Нервные стволовые клетки (NSCs) относятся к клеткам, которые могут самообновлению и дифференцируются в трех нейронных линий. Здесь мы опишем протокол для определения частоты НСК в данной популяции клеток с использованием нейросфера формирования и дифференциации при клоновых условиях.
Нервные стволовые клетки (NSCs) обладают способностью к самообновлению и генерировать три основных нервных родословных – астроциты, нейроны и олигодендроциты. NSC , и нервные клетки – предшественники (NPS), как правило , культивируют в пробирке , как нейросферах. Этот протокол подробно описывает, как определить частоту НСК в данной популяции клеток при клоновых условиях. Протокол начинается с посевом клеток при плотности, что позволяет генерировать клоновых нейросферах. В нейросферы затем переносили в камерных покровные и дифференцируются в соответствии с клоновых условиях в кондиционированной среде, которая максимизирует дифференциацию потенциал нейросферах. И, наконец, частота НСК рассчитывается на основе нейросфера формирования и мультипотентность возможностей. Утилиты этого протокола включают оценку кандидатов НСК маркеров, очистку NSCs и способность различать NSCs от NPs. Этот метод занимает 13 дней, чтобы выполнить, что значительно shorter, чем нынешние методы для перечисления частоты НСК.
Нервные стволовые клетки (NSC,) являются клетки центральной нервной системы (ЦНС), что может самообновлению и мультипотентны. NSCs сначала определены в процессе развития эмбрионального переднего мозга и продолжают сохраняться в мозге взрослого в конкретных регионах, таких как субвентрикулярной зоны (SVZ) боковых желудочков и зубчатую извилину (DG) гиппокампа. Ряд NSC линий используются в клинических испытаниях для лечения инсульта и других неврологических заболеваний , таких как болезнь 1 Баттена.
NSC, и нервные клетки-предшественники (NPS) размножают в культуре, как плавающий 3-мерные сфероидами структуры, называемые нейросферы. Система нейросфера культуры была разработана Рейнольдс и Weiss в начале 1990 – х годов, когда они обнаружили , что эмбриональные и взрослые корковые клетки могли бы разделить в присутствии эпидермального фактора роста (EGF) и основной фактор роста фибробластов (bFGF) 2-4. Нейросферах состоят из гетерогенной смеси Cгезов состоящие из подклассов на разных стадиях развития 5. Это является сложной задачей, чтобы конкретно изучить NSCs использованием данных, полученных из нейросферах из-за наличия NPs. Следовательно, крайне важно, чтобы обогатить NSCs от нейросферах. В настоящее время четыре основных метода были использованы для обогащения NSC , в пробирке. Во-первых, является использование маркеров клеточной поверхности. Льюис-X (LeX) и CD133 (также известный как Prominin1) являются наиболее известных на поверхности клетки маркеров НСК 6-9. Syndecan-1, Notch-1 и Интегринзависимая бета1 другие поверхностные белки , которые обогащают для NSCs 10. Во-вторых, исключение красителя. Было показано , что клетки из стороны населения, которые обладают уникальной способностью выкачать флуоресцентного ДНК-связывающий краситель Hoechst 33342, обогащены NSCs 11. В-третьих, является использование морфологического отбора. Было показано , что клетки с увеличенным размером клеток и зернистости гавани больше NSCs , чем их аналоги 5,12,13. В-четвертых, добавление НСК суrvival факторы к культуральной среде. Было показано , что добавление хондроитинсульфата протеогликанов и аполипопротеина Е повышает выживаемость NSC и , таким образом , увеличивает частоту NSC 14,15. Хотя многие маркеры , включая факторы транскрипции, были связаны с NSCs 16,17, ни один из этих маркеров не способны обогатить NSCs к чистоте. Из – за отсутствия окончательных маркеров НСК, остается проблемой для количественного определения NSCs и отличить их от NPs в пробирке.
Первоначальные исследования использовали анализ формирования нейросфера (NFA) для количественного определения NSCs 7,11,13. В этом анализе, диссоциированные клетки культивируют с образованием нейросферы и количество нейросферах генерируется на каждые 100 посеянных клеток определяется. Это значение называется как формирование блока нейросфера (NFU). NFU равна частоте NSC, если все нейросферы возникают из NSCs. Тем не менее, было показано, что NFU завышенную частоту NSC, как нейросферы формируются как NSCs и раннее NPs 5. Таким образом, было бы неправильно перечислить NSCs исключительно на основе нейросфера формации. Это может быть возможным дать количественную оценку NSCs на основе их способности к самообновлению, пролиферируют интенсивно и генерировать мультипотентных нейросферы.
NSCs, которые являются EGF и bFGF реагируют, как правило , выживают в течение по крайней мере десяти проходов и таким образом показывают способность обширную самообновлению в культуре 4,18-20. NPs, которые являются EGF и bFGF отзывчивым, а также, может также генерировать нейросферы за несколько проходов, но не в течение длительного периода времени. Следовательно, оно было широко признано , что добросовестные NSCs могут быть перечислены с достаточной точностью на основе нейросфера формирования , по крайней мере , десять проходов. В большинстве исследований, однако, самообновление обычно измеряется на основе формирования вторичного или третичного нейросфера вследствие длительного экспериментального времени, необходимого для десяти проходов. Следовательно, вторичное НЛА может быть использован в широком смысле сравнить ставку способность самообновленияWEEN популяции, но не может быть использован для точного перечисления частоты НСК.
NSCs имеют большую пролиферативную способность по сравнению с NPs. Это свойство было использовано NSCs Луи и др. разработать метод количественного подсчета НСК – нейронную анализ клеток колониеобразующей (NCFCA) 21,22. В этом анализе, одиночные клетки культивируют в течение 3-х недель в коллагенсодержащего полутвердой матрице. В этих условиях культивирования, было показано, что клетки, которые образуют нейросферы выше 2 мм в диаметре и могут tripotent самообновлению в течение длительного срока. Эти клетки определяются как NSCs. Поэтому NSCs эффективно отличать от NPs.
NSC, обладают способностью дифференцироваться в астроциты, олигодендроциты и нейроны. Для дифференциации нейросферах, факторы роста, удаляются и сыворотку добавляют к культуральной среде. Если все три нейронные родословные наблюдаются в нейросфера, то клетка, которая инициировала эту нейросфера яS НСК. Тем не менее, анализ дифференциации имеет некоторые ограничения. Во-первых, условия культивирования, используемые для дифференцировки не может быть оптимальным для генерации всех трех нейронными родословных. На самом деле, в одном процессе дифференцировки нейросфера, значительная гибель клеток происходит и в основном происходит генерация астроцитов (Tham М и Ахмеда S, неопубликованные). Во-вторых, есть вопрос о клональности. Для точного подсчета NSCs, формирования и дифференциации нейросферах должны быть выполнены в соответствии с клоновых условиях, где каждый нейросфера возникает из одной клетки. В объемных суспензионных культурах, агрегация происходит на клеточном и нейросфера уровнях 23-25. Следовательно, можно каждому нейросфера возникать из нескольких ячеек или нейросферах, что усложняет нейросфера подсчета и оценки мультипотентность. Последние данные показывают, что агрегация клеток не происходит при низкой плотности металлизации 0,5 клеток / мкл или ниже, и, когда культуральные планшеты не перемещаются во время Neuформирование rosphere 15. Таким образом, культивировании клеток при такой низкой плотности обеспечит клональности.
В настоящее время NCFCA является наиболее часто используемый метод, чтобы отличить NSCs от Соседства и перечислить частоты НСК. NCFCA, однако, требует относительно длительного времени трех недель. Здесь мы опишем протокол для перечисления частоты NSC основан на способности NSC, чтобы сформировать мультипотентных нейросферы. Этот протокол занимает всего 13 дней, чтобы выполнить. NCFCA обеспечивает клональности в качестве коллагеновой матрицы предотвращает движение нейросферах. Условия культивирования, используемые в данном протоколе также позволяет клональности будет поддерживаться на протяжении. Например, использование 50-луночных камерных покровные гарантирует, что нейросферы будет дифференцироваться, не контактируя друг с другом. Кроме того, мы используем кондиционированной среды , которая поставляет нейротрофических факторов в процессе дифференциации для максимизации дифференциации потенциала нейросферах (рисунок 1).
Мы опишем хи перечисление NSCs под клоновых условиях. Критические шаги включают в себя использование свежего роста и дифференциации среды НБК, а также использование свежеприготовленного раствора ФАПЧ / Laminin для покрытия камерные покровные, а также блюда культуры. Это обеспечивает оптимальный рост и дифференциацию условий жизни нейросферах. Использование хороших антител качества для эффективного обнаружения нейронов и глии, а также выборочное комплектование клональных нейросферах, которые не находятся в контакте с другими нейросферах, имеют решающее значение. Кроме того, важно обеспечить отборные нейросферы не высыхают. Рекомендуется добавить 10 мкл среды дифференцировки в каждую лунку после получения каждые 10 нейросферы. Важно, чтобы использовать один камерные покровное в одном 10-см чашку на образец, чтобы избежать взаимных помех между нейросферах из разных образцов. Если два покровные (каждая из которых содержит нейросферах из разных образцов) помещают вТе же 10 см блюдо, нейросферы из одного покровное может выпустить факторы, которые могут изменить склонность нейросферах в другом покровного дифференцироваться в специфические клоны. Два покровные в том же 10-см чашку также может привести к смеси между образцами.
В случае NFU или частота НСК ниже, чем ожидалось, убедитесь, что используются с низким числом пассажей нейросферы. Кроме того, важно, что здоровые низкие нейросферы проход используются для генерации кондиционированную среду. Далее, если нейросферы культивируют в скважинах малого диаметра, например, в 96-луночного блюдо, то это будет трудно маневрировать и выбрать нейросферы с помощью микропипетки. В этом случае, передача нейросферы в большую чашку для культивирования, такие как блюдо 6-луночного, до сбора. Некоторые из отборных нейросферах может отрываться от камерно покровного во время культивирования и иммунное окрашивание. Сведение к минимуму движение камерно покровного во время культивирования, и менее интенсивное мытьеING во время иммуноокрашиванием, помогло бы избежать отряд нейросферах.
Первоначальные исследования количественно NSCs с использованием только НКА 7,11,13. Тем не менее, NFA завышает частоту НСК , как оба NSCs и ранние NPs генерировать нейросферы 5. Луи и др. Разработали другой метод количественной оценки NSCs известный как NCFCA 21,22. NCFCA включает культивирование отдельных клеток в матрице на основе коллагена для обеспечения клональности, и было показано, что нейросферы выше 2 мм в диаметре образованы только NSCs. Подобно NCFCA, клональности обеспечивается на протяжении всего этого протокола. Это достигается за счет генерации нейросферы на клональной плотности и дифференциации нейросферы в камерных покровные. Использование камерных покровные дает ряд преимуществ. Камерных покровного позволяет каждый образец нейросфера дифференцировать без физического контакта с другими нейросферах образца, обеспечивая тем самым клональности во время дифференцировки.Камерные покровное может быть помещен приостановлено на дифференциации среды, чтобы позволить образец нейросферы быть постоянно кондиционером и для обеспечения максимальной дифференциации. При отсутствии кондиционированной среды и сыворотки в процессе дифференцировки, выживаемости нейросферах уменьшается, а в основном нейросферы генерировать астроциты (Тэм M и Ahmed S, неопубликованные данные). Кроме того, иммунологически нейросферы можно удобно хранить в течение длительного периода времени и камерные покровные могут быть установлены непосредственно на микроскопе предметные стекла. Кроме того, визуализация из иммуноокрашиванию нейросферах производится легко, как можно быстро найти нейросфера в малом камерные хорошо, захватить изображение, и двигаться дальше к следующей скважине.
Мы определили частоту НСК в E14.5 мыши нейросфера культуры с использованием как протокол , описанный в этой рукописи 27 и NCFCA 28. Частота НСК в E14.5 нейросферах мыши определяется как мнеthods сопоставимы. NCFCA перебирает NSCs, которые мультипотентны и имеют долгосрочный потенциал самообновления. Поскольку частота NSC из нашего метода сопоставима с NCFCA, считывание из нашего протокола, кажется, не переоценивать частоту НСК. NCFCA требуется три недели, чтобы быть завершены и в основном включает в себя покрытие клеток и среднего пополнения. Протокол , описанный здесь , требуется 13 дней , чтобы выполнить и включает в себя различные серии шагов, например, нейросфера комплектование и иммунное окрашивание. Этот протокол может служить в качестве альтернативного метода для перечисления NSCs. Исследователи могут использовать как NCFCA и этот протокол для проверки частоты НСК в их образцах.
Одним из ограничений этого протокола заключается в том, что ряд важных шагов должны быть все выполнены на 8-й день Методику кондиционированной среды, определение NFU образцов нейросферах и передачи образцов нейросферах к 50-а камерно покровное должны быть выполнены на дау 8. Можно было бы занять некоторое время, чтобы завершить эти шаги. Кроме того, она требует практики для выполнения этих шагов в эффективным образом.
Нейросферах широко используется для изучения функции НСК и поведение. Тем не менее, нейросферы состоят из обоих NSCs и NPs. Следовательно, важно, чтобы обогатить NSCs от нейросферах для изучения NSC биологии. В настоящее время на поверхности клеток маркеры, краситель исключения собственности, а также размера клеток и зернистости, были использованы для обогащения NSCs 6,7,9-13,29,30. Этот протокол может быть использован для количественного обогащения NSCs потенциальных маркеров НСК, а также для облегчения поиска окончательного НСК маркера. Четыре недавние исследования использовали этот протокол для перечисления частоты НСК 5,14,15,26.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Агентство по науке, технологиям и исследованиям (A * STAR), Сингапур за финансирование этого исследования.
15 ml conical centrifuge tubes | BD | 352096 | |
50 ml conical centrifuge tubes | BD | 352070 | |
20 ml sterile syringe | BD | 300141 | |
50 ml sterile syringe | BD | 300144 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody | Covance | MMS-435P-100 | |
Rabbit anti-GFAP IgG antibody | Dako | Z033401 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
Microscope fitted to laminar flow hood | Leica | MZ6 | |
Glass slides | Marienfeld-superior | 1000200 | |
Mouse anti-O4 IgM antibody | Merck Millipore | MAB345 | |
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | |
Microscope | Nikon Eclipse | TS100-F | |
Laminar flow hood | NuAire | NU-543 | |
96-well culture dishes | NUNC | 167008 | |
10-cm culture dishes | NUNC | 150350 | |
Paraffin film | Parafilm | PM999 | |
Human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
0.2 µm filter | Sartorius Stedim | 16534-K | |
0.45 µm filter | Sartorius Stedim | 16555-K | |
1.0 N Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S2770 | |
1.0 N Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H9892 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
Paraformaldehyde (PFA) powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Toxic |
Bovine serum albumin (BSA) powder | Sigma-Aldrich | A7906 | |
50-well chambered coverslips | Sigma-Aldrich | C7735 | |
Stir plate with heat function | Stuart | UC152 | |
DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
B27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
1x phosphate buffered saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | A21042 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific | A21135 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
Cell culture centrifuge | Thermo Fisher Scientific | RT1 75002383 | |
Pasteur pipettes | Thermo Fisher Scientific | 10006021 | |
CO2 incubator | |||
Ventilated fume hood | |||
Aspirator | |||
Confocal microscope | |||
Micropipettes | |||
Micropipette tips | |||
Plastic pipettes | |||
Multichannel pipettes | |||
Glass beaker | |||
Sterile forceps | |||
pH meter |