Förfarande för adaptiv Laboratory Evolution av mikroorganismer med hjälp av en kemostat
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att erhålla adaptiv laboratorium utvecklingen av mikroorganismer under betingelser med användning kemostat kultur. Dessutom är genom-analys av den utvecklade stammen diskuteras.
Abstract
Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism’s genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.
Introduction
Mikroorganismer kan överleva och anpassa sig till olika miljöer. Under svår stress, kan anpassning ske via förvärv av nyttiga fenotyper av slumpmässiga genomiska mutationer och efterföljande positiv selektion 1-3. Därför kan mikrobiella celler anpassa genom att ändra metaboliska eller regulatoriska nätverk för optimal tillväxt, som kallas "adaptiv evolution". Senaste viktiga mikrobiella tendenser, såsom utbrott av superbugs och förekomsten av robusta mikrobiella stammar, är mycket nära släkt med adaptiv evolution under stressiga förhållanden. Under definierade laboratoriemiljö, har vi möjlighet att studera mekanismerna för molekylär evolution och även styra riktningen på mikrobiell utveckling för olika tillämpningar. Till skillnad från flercelliga organismer, encelliga organismer är väl lämpade för adaptiv laboratorie evolution (ALE) av följande skäl: de regenerera snabbt, de behåller stora populationer, och det är lätt att skapa och underhålla homogeneous miljöer. Kombinerat med de senaste framstegen inom DNA-sekvenseringstekniker och teknik med hög kapacitet, gör ALE för direkt observation av genomiska förändringar som leder till systemregelförändringar. Mutations dynamik och en mångfald av befolkningen är också observeras. Gentekniska strategier kan bestämmas genom analys av alestammar 4,5.
Kemostat kultur är en metod som används för att erhålla steady-state-celler och öka produktiviteten i jäsningsprocesser 6. Färskt medium tillsätts och odlingsbuljong skördas under processen (den senare innefattar mediet och biomassa). Långsiktig kemostat kultur, men ändrar steady-state produktivitet kultur och medför ackumulering av spontana mutationer och urval under odling (Figur 1a). Under olika selektionstryck (stressorer), är en ansamling av mutationer förbättras. En gradvis ökning av stress i ett långsiktigt kemostat föreskrivs en kontinuerlig urval av mutationer som arbetar mot de givna stressfaktorer, såsom temperatur, pH, osmotiskt tryck, näringsämnen svält, oxidation, giftiga slutprodukter, etc. Colony överföring från ett fast medium och seriell överföring från ett vätskemedium (upprepad satsvis odling) tillåter också forskare att erhålla utvecklats mikroorganismer (Figur 1b och 1c). Även kemostat kultur kräver komplicerade metoder, är poolen av mångfald (antal upprepningar och populationsstorlek) högre än den som erhålls genom koloniöverförings och serieöverföringsteknik. Den stabila spännings exponering för enskilda celler och minskad variation i den cellulära tillstånd under kemostat kultur (steady state) är andra fördelar med ALE jämfört med satskulturbaserade tekniker. Stressinducerad ALE av Escherichia coli utsätts för höga succinat villkor införs i den här artikeln.
iles / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg "/>
Figur 1: Metoder för adaptiv laboratorie evolution (A) kemostat;. (B) seriell överföring; (C) koloniöverförings. Den översta figurer illustrerar begreppet metoder för ALE, och botten siffror visar antalet celler som växte under ALE. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroorganismer är kapabla att anpassa sig till nästan alla miljöer på grund av deras snabba tillväxt och den genetiska mångfalden. Adaptiv laboratorium evolution gör mikroorganismer att utvecklas enligt utformade villkor, vilket ger ett sätt att välja individuella organismer som härbärgerar spontana mutationer som är fördelaktiga under givna förutsättningar.
Den kemostat teknik är mer robust för att uppnå konstgjord väg driven evolution än överföringsteknik av följand…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was financially supported by the Korean Ministry of Science, ICT and Future Planning (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim was supported by a fellowship from the Catholic University of Korea (2015).
Materials
| Mini-chemostat fermentor | Biotron Inc. | – | manufactured by special order |
| silicon tubing | Cole-Parmer | Masterflex L/S 13 | tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar. |
| reservoir jar | Bellco | Media storage bottle | 20 L |
| chemicals | Sigma-Aldrich | – | reagent grade |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | ACS reagent |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | ACS reagent, ≥99% |
| Na2HPO4·2H2O | Sigma-Aldrich | 4272 | 98.5-101% |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | ACS reagent, ≥99% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | ACS reagent, ≥98% |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | ACS reagent, ≥96% |
| thiamine·HCl | Sigma-Aldrich | T4625 | reagent grade, ≥99% |
| Na2·succinate·6H2O | Sigma-Aldrich | S2378 | ReagentPlus, ≥99% |
Referências
- Rando, O. J., Verstrepen, K. J. Timescales of genetic and epigenetic inheritance. Cell. 128, 655-668 (2007).
- Kim, H. J., et al. Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase. Front Microbiol. 5, 476 (2014).
- Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. Epigenetics and evolution. Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).
- Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling. Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).
- Lee, J. Y., et al. Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum. AMB Express. 4, 15 (2014).
- Narang, A. The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat. J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).
- Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain. J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).
- Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
