Prosedyre for Adaptive Laboratory Utviklingen av mikroorganismer ved hjelp av en kjemostat
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å skaffe adaptive laboratorium evolusjon av mikroorganismer under forhold som bruker kjemostatkultur. Dessuten er diskutert genomisk analyse av utviklet seg belastning.
Abstract
Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism’s genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.
Introduction
Mikroorganismer kan overleve og tilpasse seg ulike miljøer. Under alvorlig stress, kan tilpasning skje via oppkjøpet av gunstige fenotyper av tilfeldige genomiske mutasjoner og påfølgende positiv utvelgelse 1-3. Derfor kan mikrobielle celler tilpasse ved å endre metabolske eller regulatoriske nettverk for optimal vekst, som kalles "adaptiv evolusjon". Nylige viktige mikrobielle tendenser, slik som utbrudd av super og forekomsten av robuste mikrobestammer, er meget nært beslektet med adaptive evolution under stressbetingelser. Under definerte laboratorieforhold, er vi i stand til å studere mekanismene for molekylær evolusjon og selv styre retningen av mikrobiell evolusjon for ulike bruksområder. I motsetning til flercellede organismer, encellede organismer er godt egnet til adaptive laboratorium evolusjon (ALE) av følgende grunner: de regenerere raskt, de opprettholde store bestander, og det er lett å lage og vedlikeholde homogeneous miljøer. Kombinert med nylige fremskritt i DNA-sekvensering teknikker og high-throughput teknologier, gjør ALE for direkte observasjon av genomisk endringer som fører til systemiske regulatoriske endringer. Mutasjons dynamikk og et mangfold av befolkningen er også observerbar. Genetic Engineering strategier kan bli bestemt fra analysen av ALE-stammer 4,5.
Kjemostatkultur er en metode som brukes for å oppnå steady-state celler og øke produktiviteten i gjæringsprosessen 6. Friskt medium blir tilsatt og kulturmediet høstes i løpet av prosessen (den sistnevnte omfatter medium og biomasse). Long-term kjemostatkultur imidlertid endrer steady-state produktivitet av kulturen og forårsaker akkumulering av spontane mutasjoner og valg i kultur (figur 1a). Under forskjellige seleksjonstrykk (stressorer), er akkumulering av mutasjoner forbedret. En gradvis økning av stress i en langsiktig kjemostat sørger for en kontinuerlig utvalg av mutasjoner som virker mot de gitte stressfaktorer, for eksempel temperatur, pH, osmotisk trykk, nærings sult, oksidasjon, giftige sluttprodukter, etc. Colony overføring fra et fast medium og serieoverføring fra et flytende medium (gjentatt batch kultur) også gi forskerne utviklet mikroorganismer (Figur 1b og 1c). Selv om kjemostatkultur krever kompliserte metoder, pool av mangfoldet (antall replikasjoner og populasjonsstørrelse) er høyere enn den som oppnås ved koloni-overføring og serieoverføringsteknikker. Den stabile stresset eksponering mot enkeltceller og redusert variasjon i celle tilstand under kjemostatkultur (steady state) er andre fordeler med ALE forhold til batch kulturbaserte teknikker. Stress-indusert ALE av Escherichia coli som utsettes for høye succinat betingelser er innført i denne artikkelen.
iles / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg "/>
Figur 1: Metoder for adaptive laboratorium evolusjon (A) kjemostat;. (B) seriell overføring; (C) koloni overføring. Den øverste tallene illustrerer konseptet av metodene for ALE, og de nederste tallene illustrerer antall celler som vokste under ALE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroorganismer er i stand til å tilpasse seg nesten alle miljøer på grunn av sin raske vekst og genetisk mangfold. Adaptive laboratorium evolusjon gjør at mikroorganismer å utvikle seg i henhold til designet forhold, som gir mulighet til å velge individuelle organismer som bærer spontane mutasjoner som er gunstig under de gitte forhold.
Kjemostaten teknikken er mer robust for å oppnå kunstig drevet evolusjon enn overføringsteknikker av følgende grunner: (a) en jevn miljø – fordi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was financially supported by the Korean Ministry of Science, ICT and Future Planning (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim was supported by a fellowship from the Catholic University of Korea (2015).
Materials
| Mini-chemostat fermentor | Biotron Inc. | – | manufactured by special order |
| silicon tubing | Cole-Parmer | Masterflex L/S 13 | tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar. |
| reservoir jar | Bellco | Media storage bottle | 20 L |
| chemicals | Sigma-Aldrich | – | reagent grade |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | ACS reagent |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | ACS reagent, ≥99% |
| Na2HPO4·2H2O | Sigma-Aldrich | 4272 | 98.5-101% |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | ACS reagent, ≥99% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | ACS reagent, ≥98% |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | ACS reagent, ≥96% |
| thiamine·HCl | Sigma-Aldrich | T4625 | reagent grade, ≥99% |
| Na2·succinate·6H2O | Sigma-Aldrich | S2378 | ReagentPlus, ≥99% |
Referências
- Rando, O. J., Verstrepen, K. J. Timescales of genetic and epigenetic inheritance. Cell. 128, 655-668 (2007).
- Kim, H. J., et al. Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase. Front Microbiol. 5, 476 (2014).
- Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. Epigenetics and evolution. Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).
- Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling. Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).
- Lee, J. Y., et al. Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum. AMB Express. 4, 15 (2014).
- Narang, A. The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat. J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).
- Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain. J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).
- Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
