सूक्ष्मजीवों के अनुकूली प्रयोगशाला विकास के लिए प्रक्रिया एक Chemostat का प्रयोग
Summary
यहाँ, हम chemostat संस्कृति का उपयोग की शर्तों के तहत सूक्ष्मजीवों के अनुकूली प्रयोगशाला विकास प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इसके अलावा, विकसित तनाव के जीनोमिक विश्लेषण चर्चा की है।
Abstract
Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism’s genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.
Introduction
सूक्ष्मजीवों को जीवित और विविध वातावरण के लिए अनुकूलित कर सकते हैं। गंभीर तनाव के तहत, अनुकूलन यादृच्छिक जीनोमिक म्यूटेशन और बाद में सकारात्मक चयन 1-3 से फायदेमंद phenotypes के अधिग्रहण के माध्यम से हो सकता है। इसलिए, माइक्रोबियल कोशिकाओं इष्टतम विकास है, जो कहा जाता है "अनुकूली विकास के लिए" चयापचय या नियामक नेटवर्क बदलकर अनुकूलन कर सकते हैं। ऐसे सुपेर्बुग्स के फैलने और मजबूत माइक्रोबियल उपभेदों की घटना के रूप में हाल ही में महत्वपूर्ण माइक्रोबियल प्रवृत्तियों, बहुत बारीकी से तनावपूर्ण परिस्थितियों में विकास अनुकूली से संबंधित हैं। परिभाषित प्रयोगशाला परिस्थितियों के तहत हम आणविक विकास के तंत्र का अध्ययन करने के लिए और यहां तक कि विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए माइक्रोबियल विकास की दिशा को नियंत्रित कर सकते हैं। बहुकोशिकीय जीव के विपरीत, एक कोशिकीय जीवों में अच्छी तरह से निम्नलिखित कारणों के लिए अनुकूली प्रयोगशाला विकास (शराब) के लिए अनुकूल हैं: वे जल्दी से पुनर्जीवित, वे बड़ी आबादी को बनाए रखने, और इसे बनाने और hom बनाए रखने के लिए आसान हैogeneous वातावरण। डीएनए अनुक्रमण तकनीक और उच्च throughput प्रौद्योगिकियों में हाल के अग्रिमों के साथ संयुक्त, शराब जीनोमिक परिवर्तन है कि प्रणालीगत विनियामक परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व के प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए अनुमति देता है। Mutational गतिशीलता और जनसंख्या की विविधता भी प्रत्यक्ष कर रहे हैं। जेनेटिक इंजीनियरिंग रणनीतियों शराब उपभेदों 4,5 के विश्लेषण से निर्धारित किया जा सकता है।
Chemostat संस्कृति स्थिर राज्य कोशिकाओं को प्राप्त और किण्वन प्रक्रिया 6 में उत्पादकता बढ़ाने के लिए इस्तेमाल एक विधि है। ताजा माध्यम से जोड़ा जाता है और संस्कृति शोरबा प्रक्रिया (उत्तरार्द्ध मध्यम और बायोमास भी शामिल है) के दौरान काटा जाता है। लंबे समय तक chemostat संस्कृति, तथापि, संस्कृति के स्थिर राज्य उत्पादकता में परिवर्तन और संस्कृति (चित्रा 1 ए) के दौरान सहज म्यूटेशन और चयन के संचय के बारे में लाता है। विभिन्न चयन दबावों (तनाव) के तहत परिवर्तन के संचय बढ़ाया है। एक लंबी अवधि में तनाव का एक क्रमिक वृद्धि chemostat म्यूटेशन, जैसे तापमान, पीएच, आसमाटिक दबाव, पोषक तत्व भुखमरी, ऑक्सीकरण, विषाक्त अंत उत्पादों, आदि कॉलोनी हस्तांतरण एक तरल माध्यम से एक ठोस मध्यम और धारावाहिक हस्तांतरण (दोहराया से उस के रूप में दी तनाव के खिलाफ काम की एक सतत चयन के लिए प्रदान करता है बैच संस्कृति) भी शोधकर्ताओं ने विकसित सूक्ष्मजीवों (चित्रा 1 बी और 1 सी) प्राप्त करने के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि chemostat संस्कृति जटिल तरीकों की आवश्यकता है, विविधता के पूल (अनुकरण और जनसंख्या के आकार की संख्या) कॉलोनी हस्तांतरण और सीरियल हस्तांतरण तकनीक के द्वारा प्राप्त की तुलना में अधिक है। व्यक्ति की कोशिकाओं को स्थिर तनाव जोखिम और chemostat संस्कृति (स्थिर राज्य) बैच संस्कृति आधारित तकनीकों की तुलना में शराब के अन्य लाभ कर रहे हैं के दौरान सेलुलर राज्य में बदलाव की कमी हुई। कोलाई उच्च succinate शर्तों के अधीन की तनाव प्रेरित शराब इस लेख में पेश किया है।
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चित्रा 1: अनुकूली प्रयोगशाला विकास के तरीके (ए) Chemostat;। (बी) के सीरियल अंतरण; (सी) कॉलोनी हस्तांतरण। शीर्ष आंकड़े शराब के लिए तरीकों की अवधारणा को वर्णन है, और नीचे आंकड़े कोशिकाओं है कि शराब के दौरान हुई की संख्या को दर्शाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
सूक्ष्मजीवों उनके तेजी से विकास दर और आनुवंशिक विविधता की वजह से लगभग सभी प्रकार के वातावरण के अनुकूल ढालने में सक्षम हैं। अनुकूली प्रयोगशाला विकास के लिए बनाया गया परिस्थितियों, जो व्यक्ति सहज म्यू?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was financially supported by the Korean Ministry of Science, ICT and Future Planning (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim was supported by a fellowship from the Catholic University of Korea (2015).
Materials
| Mini-chemostat fermentor | Biotron Inc. | – | manufactured by special order |
| silicon tubing | Cole-Parmer | Masterflex L/S 13 | tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar. |
| reservoir jar | Bellco | Media storage bottle | 20 L |
| chemicals | Sigma-Aldrich | – | reagent grade |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | ACS reagent |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | ACS reagent, ≥99% |
| Na2HPO4·2H2O | Sigma-Aldrich | 4272 | 98.5-101% |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | ACS reagent, ≥99% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | ACS reagent, ≥98% |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | ACS reagent, ≥96% |
| thiamine·HCl | Sigma-Aldrich | T4625 | reagent grade, ≥99% |
| Na2·succinate·6H2O | Sigma-Aldrich | S2378 | ReagentPlus, ≥99% |
Referências
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