La medición cuantitativa de los niveles relativos de ácido retinoico en E8.5 embriones y Neurosphere culturas utilizando el ensayo indicador basado en células raras-lacZ F9

Todo el trabajo de los animales se realizó de acuerdo con los métodos de Rutgers-RWJMS aprobado IACUC. 1. Solución y Preparación de Medios Preparar soluciones madre y de amortiguamiento según la Tabla 1. Preparar soluciones de trabajo de acuerdo con la Tabla 2. 2. Cultura y mantenimiento de células raras-LacZ F9 Las células congeladas descongelación Preparar medio de cultivo celular F9 RARE-LacZ como se detalla en la Tabla 2. Coat 10 cm placas de cultivo (cultivo de células tratadas) con 10 ml de 0,2% de gelatina (se refieren a la Tabla 2) durante 30 min a TA. Lavar el exceso de gelatina con dos enjuagues de 10 ml de agua destilada. Inmediatamente añadir 9 ml de medio de cultivo de células F9 RARE-LacZ en el matraz para prevenir la gelatina de secado. Descongelar un vial de células RARO-LacZ F9 14 en un baño de agua de 37 ° durante 2 – 3 minutos. Células de la placa (alrededor de 1 x 10 6 células / ml) en el plato recubierto containing 9 ml de medio de cultivo. Cultivo a 37 ° C, 5% de CO 2. Cambiar el medio al día siguiente. Mantenimiento de células raras F9-LacZ Mantener un paso regular de cada 2 – 3 días en una proporción de 01:10. Nota: No permita que las células crecen en la confluencia ya que esto dará lugar a su diferenciación. Dividir los cultivos a una confluencia del 80-90%. Retire el medio y se lavan las células con 10 ml de 1x tampón fosfato salino (PBS). Retire el PBS y añadir 1 ml de tripsina, se incuba durante 5 min. Añadir 9 ml de medio de cultivo, las células de la pipeta hacia arriba y abajo y de división 1:10 para el paso. La congelación raras células F9-LacZ Tripsinizar un plato de 10 cm que contiene células RARE-lacZ F9 en 80-90% de confluencia, como se detalla en el paso 2.2.2. Transferencia de las células disociadas en un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugado a 200 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 10 ml de F9 RARE-LacZ freezing medio (véase la Tabla 2). Alícuota de 1 ml en crioviales etiquetados y viales de transferencia en recipientes de congelación. Coloque la congelación recipiente en -80 ° C congelador O / N y de transferencia de viales a tanques de nitrógeno líquido al día siguiente. 3. La disección de embriones E8.5 El apareamiento de la jaula Instalación y tapón de revisión Puesta en marcha de una jaula de acoplamiento que contiene un par de apareamiento. A la mañana del día siguiente, la verificación de la presencia de un tapón vaginal y designar el día un enchufe se encuentra como el día 23 de 0,5. En E8.5 días, los embriones de cosecha. La disección de embriones Sacrificar la presa a través dislocación cervical y rociar la zona abdominal con etanol al 70% (ver Tabla 2). Hacer un corte transversal en la piel por encima del abdomen usando tijeras quirúrgicas y tire de las dos aletas separadas (anterior y posterior) para exponer el área abdominal. Hacer un corte similaren el peritoneo para exponer el abdomen. Localizar los úteros y liberar úteros de los oviductos y mesometrium usando un par de tijeras 23. Coloque los úteros en una placa de 6 cm (cultivo de células no tratadas) con 10 ml de PBS 1x para lavar el exceso de grasa y la sangre. Transferir a otra placa de 6 cm que contenía 10 ml frescas 1x PBS. Separada de un útero que contiene un embrión cortándolo con tijeras quirúrgicas. Retire el útero y decidua y liberar el saco vitelino de embriones que contienen el uso de dos pares de no. 5 fórceps 23. Separar el saco vitelino del embrión, y transferir el saco vitelino a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para la extracción de ADN genómico para ser utilizado para el genotipado. Utilizar una pipeta P20 con una punta de gran calibre, transferir todo el embrión en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 10 l de tripsina. Se coloca el tubo en hielo. Repita los pasos 3.2.3 – 3.2.4 hasta que todos los embriones han sido disecados. La disociación de embriones Incubar los tubos de 1,5 ml que contienen embriones en tripsina a 37 ° C durante 5 min para facilitar la disociación enzimática. Se tritura suavemente utilizando una pipeta P20 para la disociación mecánica del embrión, y la placa de todo el volumen 10 l que contiene un embrión disociada más de un pocillo de células RARE-lacZ F9 en una placa de 96 pocillos (véase el paso 5.1 para el recubrimiento de las células F9 RARE-lacZ en una placa de 96 pocillos). Cultura O / N a 37 ° C y 5% de CO2. 4. Cable de laminectomía, Disección de Adultos de la columna lumbar y Neurosphere Cultura laminectomía Sacrificar un ratón adulto (P60) a través de la dislocación cervical. Pulverizar el lado dorsal con 70% de etanol y haga un corte transversal utilizando tijeras quirúrgicas. Retirar los dos solapas (anterior y posterior), aparte de exponer la espalda y la columna vertebral. Con unas tijeras quirúrgicas, recorte los músculos que cubren la columna vertebral.Ubicar la región lumbar de la médula espinal, debajo de las costillas. Utilizando las tijeras, hacer un corte profundo para cortar la columna vertebral en este punto para exponer la médula espinal. Tire hacia arriba de la región lumbar de la columna vertebral con el núm. 5 fórceps manera que la sección transversal expuesta de la médula espinal se enfrenta el experimentador. El uso de las puntas de unas tijeras finas, cortar las vértebras y los músculos en las posiciones de las 3 y las 9 en punto de la parte expuesta. Agarre la aleta dorsal de la vértebra corte con unas pinzas. Continuar estos recortes caudalmente hasta que se expone la longitud de la médula espinal lumbar. Liberar la médula espinal de la vértebra sin usar. 5, así como unas pinzas de punta roma. La transferencia de la médula espinal a un tubo de 15 ml que contiene 3 ml de medio / cultivo F12 DMEM. Mantener en hielo hasta que se han aislado todas las médulas espinales lumbares. La disección de la médula espinal Verter el medio de cultivo con la médula espinal en una placa de 6 cm (cultura no de células tratadas). Bajo un microscopio estereoscópico, quitar los ganglios de la raíz dorsal y los vasos sanguíneos alrededor del segmento de la médula espinal agarrando los ganglios y vasos sanguíneos utilizando dos pares de ninguna. 5 fórceps y suavemente tirando de ellos fuera de la médula espinal. Transferir el segmento de la médula espinal a una placa de 6 cm con ningún medio y picar finamente el tejido utilizando una hoja de bisturí. Transferencia picada tejido al tubo 15 ml que contiene 1 ml de medio de neuroesferas de disociación (ver Tabla 2). Colocar el tubo en hielo y repita los pasos 4.2.1 – 4.2.2 hasta que todas las médulas espinales han sido procesados. Incubar los tubos que contienen tejido picado en medio de disociación a 37 ° C durante 10 min, chasquear el tubo en el lado de mezclar y luego se incuba a 37 ° C durante otros 10 min. Después de la digestión enzimática, se tritura con pipetas pulidas al fuego de diámetros decrecientes para la disociación mecánica. Nota: Preparar pipetas pulidas al fuego de diámetros decrecientes antes de realizar los experimentos. Tome un vaso Pasteurpipeta y conecte el extremo ancho con algodón limpio. El uso de una lámpara de alcohol, esmalte de fuego las puntas de las pipetas en la llama para crear diferentes diámetros: "regular", "bien", y "extra fino". Para pipetas pulido "normales", girar el extremo de la pipeta en la llama a ronda de los bordes sin disminuir el diámetro (~ 1 mm). Gire el extremo de la pipeta en la llama durante períodos más largos para crear un poco "fino" (~> 1 mm y> 5 mm de diámetro) y "extra fino" (~ 0,5 mm) pipetas pulidos. No utilizar pipetas con un diámetro inferior a 0,5 mm. neurosphere Cultura Centrifugar los tubos que contienen abajo disociadas del tejido de la médula espinal a 200 xg durante 10 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 1 ml de medios de cultivo de neuroesferas (véase la Tabla 2). Se tritura con una pipeta P1,000 seguido de una pipeta P200 para facilitar la disociación. Nota: Evitar la introducción de burbujas,lo que disminuiría la viabilidad celular. Transferencia de 10 l de células disociadas en un hemocitómetro y obtener un recuento de células. Células de la placa a una densidad de 1×10 5/10 ml en un matraz T25 con 10 ml de medios de cultivo de neuroesferas. Se incuba a 37 ° C y 5% de CO2 durante 7 días hasta que aparecen neuroesferas 24. La disociación neurosphere Recoger la cultura neurosphere y transferir a tubos de 15 ml. Girar a 200 xg durante 10 min. Eliminar la mayor parte del sobrenadante dejando 1 ml atrás. Se tritura con una pipeta P1,000 para volver a suspender el sedimento celular y disociar neuroesferas en células individuales. Transferencia de 10 l de células disociadas en un hemocitómetro y obtener un recuento de células. Placa 1 x 10 5 células disociadas neurosphere más de un pocillo de F9 RARO-LacZ en una placa de 96 pocillos (ver sección 5.1 para chapado F9 RARO-lacZ en placas de 96 pocillos). Placa 3 pozos como repeticiones. Cultura O / N a 37 ° C y 5% de CO2. 5. RA Ensayo de embriones E8.5 y la médula espinal neuroesferas Plating F9 RARO-lacZ en placas de 96 pocillos Un día antes de embriones E8.5 cosecha o disociación de neuroesferas, recubrir una placa de 96 pocillos con 100 l de 0,2% de gelatina por pocillo durante 30 min a TA. Aspirar la gelatina y enjuague dos veces con 200 l de agua destilada. células RARO-LacZ trypsinize F9 mantuvieron en placas de 10 cm como se detalla en el paso 2.2.2. Placa 1 x 10 5 células / pocillo de células F9-LacZ raro, pero esta vez utilizando medio de cultivo sin G418. Preparar suficientes pocillos para co-cultivo de embriones (~ 12-20, dependiendo del tamaño de la camada), neuroesferas (3 pocillos / genotipo), así como para una curva estándar por triplicado (27 pozos). Co-cultivo de F9 RARO-LacZ y E8.5 embriones o de la médula espinal neuroesferas embriones de cosecha, como se detalla en la sección 3.2 y la placa en la parte superior de F9RARE-lacZ en la placa de 96 pocillos de la sección 5.1. De una manera similar, disociar neuroesferas y la placa en la parte superior de F9 RARE-lacZ en la placa de 96 pocillos como se detalla en el paso 4.4. Cultura O / N a 37 ° C y 5% de CO2. Generación de una curva estándar Para generar una curva estándar, preparar todo-trans RA (en-RA) soluciones con las siguientes concentraciones: 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM, 1 pM, 100 fM, por dilución en serie de la AT- RA de valores (véase la Tabla 1) con medio de cultivo RARO-LacZ F9. Añadir 100 l de estos diferentes al-RA concentraciones a las células RARO-LacZ F9 de la sección 5.1. Asignar los pozos que contienen células RARO-LacZ F9 sin tratar como control negativo. Preparar triplicados de cada concentración de RA y pocillos de control negativo. Cultura O / N a 37 ° C y 5% de CO2. Nota: Las celdas RARO-LacZ F9 responden de manera lineal dependiente de la dosis a diferentes concentraciones de RA todo-trans. Ensayo de la AR Después del cultivo O / N de la placa de 96 pocillos que contiene las curvas de nivel y co-cultivos, extraiga el soporte y fijar las culturas mediante la adición de 100 l de glutaraldehído al 2,5% (ver Tabla 2) durante 15 min, RT. Retire el fijador y lavar dos veces con 200 l de PBS 1x, 10 minutos por lavado. Quitar PBS y se lava tres veces con 200 l de la solución de lavado LacZ (véase la Tabla 2), 10 min por lavado. Durante el tercer lavado, preparar la solución de tinción X-gal en un tubo de 15 ml envuelto en papel de aluminio (ver Tabla 2). Calcular la cantidad de solución de tinción que se necesita y preparar la cantidad adecuada (200 l / pocillo). Nota: La solución de tinción X-gal es sensible a la luz. Utilice la solución de tinción en los 15 minutos después de su preparación. Preparar una cámara húmeda mediante la colocación de una toalla de papel humedecido con agua destilada en un recipiente de plástico suficientemente grande para contener una placa de 96 pocillos. Añadir 200 l de la Xsolución de tinción gal por pocillo de la placa de 96 pocillos y colocar la placa en una cámara humidificada. Incubar cámara humidificada que contiene la placa de 96 pocillos a 37 ° C para permitir el desarrollo de un precipitado de color azul. Para los embriones E8.5, se incuba la placa de O / N (12 – 16 h). Para neurosphere culturas, incubar la placa durante 4 – 8 horas. La lectura de la absorbancia a OD 610 y Imaging Después de la reacción de color, eliminar la solución de tinción de LacZ y reemplazar con 200 l de PBS 1x. Medir la absorbancia a 610 nm usando un lector de placas estándar ELISA para cuantificar la respuesta reportero a la AR. Image pocillos individuales usando un estereomicroscopio estándar equipado con una cámara. 6. La subclonación de células raras F9-LacZ Comprobación F9 RARO-LacZ rResponse a la AR Antes de empezar cualquier experimento, probar la respuesta de las células RARO-LacZ F9 para la AR. Placa F9 RARO-LacZ cells en placas de 96 pocillos (ver sección 5.1), y se añade 1 nM todo-trans del ácido retinoico (véase el paso 5.3). Incubar en una cámara húmeda a 37 ° CO / N. Visualizar el desarrollo de un precipitado de color azul usando un microscopio. Si el desarrollo del color no es uniforme en las células en el pozo (véase la figura 1B, a la izquierda), lleve a cabo la subclonación se detalla a continuación. Subclonación de células raras F9-LacZ Dividir las células RARO-LacZ F9 cultivadas en placas de 10 cm como se detalla en el paso 2.2.2. En lugar de una relación de 01:10, la placa una densidad de siembra de baja de 1 x 10 5 células / 10 ml en una placa de 10 cm para permitir el crecimiento de colonias aisladas de tal manera que cada colonia surge de una célula RARE-LacZ solo F9. Después de dos días, capa una placa de 24 pocillos con 500 l de 0,2% de gelatina por pocillo durante 30 min. Retire la solución de gelatina y enjuague pocillos dos veces con 500 l de agua destilada. Reemplazar el agua con 500 l de medio de cultivo de células F9 RARO-LacZ. Escoja una colonia con una punta de pipeta estéril P10 y la transferencia en un pocillo; hacer esto 24 veces para obtener 24 colonias individuales. Cultivo a 37 ° C, 5% de CO2 durante 3 – 4 días. Dividir las colonias individuales en dos placas de 24 pocillos. Después de 2 días de cultivo, añadir 1 nM de la AR a cada pocillo de una placa y cultivo de 24 pocillos O / N. Realizar tinción de LacZ como se detalla en la sección 5.4 para la prueba de alta respuesta. Visualizar reacción de color de cada pocillo bajo un microscopio para determinar la respuesta fuerte y uniforme. Una vez que se determina una fuerte respuesta subclón, expandir el cultivo correspondiente de la otra placa de 24 pocillos. ampliar aún más esa colonia en una placa de 10 cm, el congelamiento hasta varios viales como se detalla en la sección 2.3, y desechar todas las otras colonias. Nota: Sólo alrededor de una cuarta parte de las colonias originales resultar en altos respondedores. Típicamente, la primera ronda de la subclonación no da como resultado la tinción de LacZ uniforme y una ronda posterior de la subclonación se necesita hacer paralograr respondedores fuertes uniformes.