Crescimento diferido Ensaio de Inibição para quantificar o efeito de antimicrobianos bactérias derivadas de concorrência
Summary
The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.
Abstract
Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.
Introduction
Bacteria living in communities compete at the interspecific and intraspecific level for space and nutrients 6. Competition between microbes can often lead to exclusion of particular species or strains within a community. Exclusion can be due to competition for a particular receptor or nutrient, or the production of an antimicrobial compound by a member of the community 6.
Studies investigating competitive exclusion frequently examine the presence and absence of species using 16S rRNA sequencing 3,4,13. However, intraspecific trait variation, for example the presence or absence of antimicrobial peptide production, can hugely impact the ability of one species to inhibit another 1. Since 16S rRNA sequencing cannot distinguish between strains of the same species, intraspecific trait variation cannot be assessed. The technique described here can be used to assess the potential of individual strains to exclude other bacteria. This method has previously been used to show a positive correlation between the presence of Staphylococcus aureus inhibitory bacteria and the absence of S. aureus in a nasal community 7.
The deferred growth inhibition (competition) assay can identify production of antimicrobial compounds or nutrient competition by the inhibitor strain. It can also detect positive interactions, whereby the presence of the inhibitor strain actually improves the growth of the competitor strain. This assay can be used to create quantitative data (zone of clearing size) and qualitative data (degree of inhibition), both of which can be overlaid onto data of the presence or absence of a species within a community to find correlations between phenotype (trait) and competitive exclusion 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma etapa fundamental deste protocolo bacteriana competição espécies que o diferencia dos outros, é a incubação durante a noite do inibidor de isolar antes da adição do isolado concorrente. A cepa inibidor requer este período de crescimento para produzir compostos inibidores. À medida que a estirpe concorrente é sobreposta no topo da mesma forma, este método permite ao investigador observar todo o potencial da estirpe de inibidor para interferir com o crescimento da estirpe de concorrente. Como resultado, este ensaio reflecte o que acontece com a natureza; um isolado está totalmente estabelecida num nicho, e o outro deve ser capaz de neutralizar quaisquer variáveis inibitórios para ser capaz de invadir com sucesso o nicho.
Há duas partes para este protocolo que são mais susceptíveis de produzir resultados errados se for realizado incorretamente. Em primeiro lugar, a esterilização incompleta das garrafas vaporizador pode introduzir bactérias contaminantes para o ensaio. incubation do caldo utilizado para enxaguar o frasco vaporizador na etapa 3.6, em um recipiente estéril pode ser utilizado para confirmar garrafas foram completamente esterilizados. lavagens adicionais em soluções desinfectantes, como Virkon, pode ser utilizado antes da lavagem em agente de limpeza tensio-activo, descrito na etapa 3.2, se a esterilização adicional é necessária.
A segunda etapa, que podem produzir resultados errados é a diluição da estirpe concorrente (passo 6.1). Se a diluição não é óptima, as medições claros de inibição não pode ser determinado facilmente. Este ensaio foi optimizado utilizando vários isolados nasal como inibidor da produção de estirpes através de uma ampla gama de espécies de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas contra S. aureus SH1000 como o 7,8 estirpe concorrente. Ele foi subsequentemente testado utilizando vários estafilococos coagulase-negativa e coagulase- positiva como concorrente e estirpes produtoras de inibidor. Ao testar diferentes dos descritos acima como o concorrente gênerosestirpe, alguma optimização da diluição para o inoculo pode ser necessário.
Se as notas clareza variam significativamente entre as repetições, pode ser necessário para padronizar o inóculo estirpe concorrente, definindo-a uma densidade óptica específica. No entanto, isto irá aumentar o tempo do ensaio preciso para configurar, e é susceptível de reduzir o número de estirpes é possível processar cada ensaio. Visualmente ajustar a cultura para um OD apropriado utilizando um padrão de McFarland pode fornecer uma alternativa rápida.
Uma limitação desta técnica é que ela só pode ser aplicada a bactérias cultiváveis. É por isso que muitos estudos utilizam 16S rRNA sequenciamento de prever as interações de exclusão competitiva 3,4,13. No entanto, as técnicas genéticas e metagenomic só pode distinguir membros da comunidade ao nível de espécie, e / ou não levam em conta nomeadamente a variação intraespecífica característica. É possível rastrear a associação de uma particulAR gene que codifica um traço com a presença ou a ausência de uma espécie bacteriana 5, no entanto isto requer pré-conhecimento de um gene susceptível de ser associada com a exclusão de uma espécie.
Uma consideração segurança dessa técnica é que, devido à geração de aerossol de bactérias, só pode ser utilizado em laboratórios com um gabinete de segurança de nível 2, ou com precauções de segurança semelhantes. Existem técnicas alternativas para testar a concorrência entre os isolados que representam a variação característica intra-específica e que não geram aerossóis de bactérias. Um tal método é o ensaio de antagonismo simultânea 2. Neste método, um inoculo de um isolado é espalhada sobre uma placa de ágar, e um segundo inoculo isolado é manchado ou picadas na parte superior uma vez que o primeiro ter secado. Isso produziria um ambiente onde as tensões estão em concorrência directa (antagonismo simultânea), ambos competindo para produzir compostos inibidores e varrer os nutrientes em primeiro lugar. o advantage do ensaio de inibição de crescimento diferido sobre o ensaio de antagonismo simultânea é que o isolado inibidor deve sempre ter a vantagem competitiva de ser totalmente estabelecida antes invasão do isolado concorrente. Este é mais reflexivo do que aconteceria no ambiente, como na maioria dos nichos, um isolado será estabelecida antes de uma outra estirpe é adicionado, em vez de dois isolados sendo adicionados ao mesmo tempo 8.
Outra alternativa para evitar a geração de aerossol de bactérias seria adicionar o competidor isolar em ágar de topo, o que pode ser vertido em vez de pulverizado ao longo do isolado inibidor. No entanto, o volume de agar de topo adicionado teria de ser cerca de 3 ml a garantir uma cobertura uniforme da placa. Dentro deste volume, o isolado concorrente não seria crescendo nos mesmos meios de comunicação como o isolado inibidor, por isso não sofrem de nutrientes reduzidos. O competidor também não estaria em contacto directo com quaisquer compostos inibidores da UNTil eles difundido no topo Agar. Um tal ensaio não pode ser descrita como inibição ou antagonismo diferido simultânea.
Um método semelhante foi anteriormente utilizada para avaliar os níveis de resistência à bacitracina entre S. clínica aureus 10. A principal diferença entre o protocolo descrito aqui e descrito por 10, é o último linhagens concorrentes unicamente classificadas como sensíveis (completo clareza inhibition- marcar 0) ou resistentes (parciais há clareza inhibition- marcar 1-5). O ensaio de inibição de crescimento diferido pode, portanto, ser também utilizadas para pesquisar os níveis de resistência aos produtores de agentes antimicrobianos em particular, ou mesmo para procurar novos agentes antimicrobianos activos contra os agentes patogénicos resistentes a múltiplas drogas.
Tem sido sugerido que a microflora do hospedeiro podem ser manipuladas para eliminar os membros indesejáveis da comunidade bacteriana 9. Aplicação de corinebactérias ou Staphylococcus epidermidis já foi mostrado para eliminar S. aureus colonização nas narinas em uma proporção significativa da população 11,12. Estudos em estirpes específicas que podem excluir competitivamente membros indesejáveis da flora do hospedeiro, através de técnicas tais como a descrita aqui, pode, portanto, conduzir a terapias futuras.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JCM é financiado por uma concessão do BBSRC-IPA com a Unilever Plc (BB / L023040 / 1). HAG é financiado por um Ministério da Arábia Saudita of Higher studentship PhD educação.
Materials
| Brain heart infusion broth | Lab M | lab049 | rich general purpose media |
| agar-agar | Merck Milipore | 101614 | |
| petri dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| plastic perfume vaporizer | not known | – | 10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket |
| Universal bottles | no longer in production, alternative SLS BOT5006 | 28 ml glass cylindrical bottle (approx 280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap | |
| Decon 90 | Decon | surface active cleaning agent |
Referências
- Bolnick, D. I., et al. Why intraspecific trait variation matters in community ecology. Trends Ecol Evol. 26 (4), 183-192 (2011).
- Christensen, G. J. M., et al. Antagonism between Staphylococcus epidermidis and Propionibacterium acnes and its genomic basis. BMC Genomics. 17 (152), (2016).
- Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PloS Comput Biol. 8 (7), (2012).
- Frank, D. N., Feazel, L. M., Bessesen, M. T., Price, C. S., Janoff, E. N., Pace, N. R. The Human nasal microbiota and Staphylococcus aureus carriage. PLoS One. 5 (5), e10598 (2010).
- Fredheim, E. G., Flaegstad, T., Askarian, F., Klingenberg, C. Colonisation and interaction between S. epidermidis and S. aureus in the nose and throat of healthy adolescents. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 34, 123-129 (2015).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).
- Libberton, B., Coates, R. E., Brockhurst, M. A., Horsburgh, M. J. Evidence that intraspecific trait variation among nasal bacteria shapes the distribution of Staphylococcus aureus. Infect Immun. 82 (9), 3811-3815 (2014).
- Libberton, B., Horsburgh, M. J., Brockhurst, M. A. The effects of spatial structure, frequency dependence and resistance evolution on the dynamics of toxin-mediated microbial invasions. Evol appl. 8, 738-750 (2015).
- Liu, C. M., et al. Staphylococcus aureus and the ecology of the nasal microbiome. Sci Adv. 1, e1400216 (2015).
- Nascimento, J. S., Ceotto, H., Nascimento, S. B., Giambiagi-deMarval, M., Santos, K. R., Bastos, M. C. Bacteriocins are alternative agents for control of multiresistant staphylococcal strains. Lett Appl Microbiol. 42, 215-221 (2006).
- Park, B., Iwase, T., Liu, G. Y. Intranasal application of S. epidermidis prevents colonization by methicillin-resistant Staphylococcus aureus in mice. PLoS One. 6 (10), e25880 (2011).
- Uehara, Y., et al. Bacterial interference among nasal inhabitants: eradication of Staphylococcus aureus from nasal cavities by artificial implantation of Corynebacterium sp. J Hosp Infect. 44, 127-133 (2000).
- Wos-Oxley, M. L., et al. A poke into the diversity and associations within human anterior nare microbial communities. ISME J. 4, 839-851 (2010).
