Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.
Zebrafisk muskelutveckling är mycket konserverad med däggdjurssystem gör dem en utmärkt modell för att studera muskelfunktion och sjukdom. Många myopatier påverkar skelettmuskelfunktion kan snabbt och enkelt bedömas i zebrafisk under de första dagarna av embryogenes. Av 24 timmar efter befruktning (HPF), vildtyp zebrafisk spontant kontrakt stjärtmusklerna och 48 HPF, zebrafisk uppvisar kontrollerad simning beteenden. Minskning av frekvensen av, eller andra förändringar i, kan dessa rörelser indikera en skelettmuskeldysfunktion. Att analysera simbeteende och bedöma muskelprestanda i början av zebrafisk utveckling använder vi både berörings framkallade fly respons och locomotion analyser.
Touch-framkallade utrymningssvarsanalyser kan användas för att bedöma muskel prestanda under kort burst rörelser till följd av sammandragning av snabba muskelfibrer. Som svar på en yttre stimulans, som i detta fall är en kran påhuvudet, vildtyp zebrafisk vid 2 dagar efter befruktning (dpf) uppvisar typiskt en kraftfull skur simma, tillsammans med skarpa svängar. Vår metod kvantifierar skelettmuskelfunktion genom mätning av den maximala accelerationen under en skur simning rörelse, accelerationen är direkt proportionell mot den kraft som alstras av muskelkontraktion.
Däremot är locomotion analyser under tidigt zebrafisk larvutveckling används för att bedöma muskelprestanda under ihållande perioder av muskelaktivitet. Med användning av ett system för spårning för att övervaka simbeteende, erhåller vi en automatiserad beräkning av frekvensen av aktivitet och avståndet i 6 dagar gamla zebrafisk, reflekterande av deras skelettmuskelfunktion. Mätningar av simning prestanda är värdefulla för fenotypisk bedömning av sjukdomsmodeller och high-throughput screening av mutationer eller kemiska behandlingar som påverkar skelettmuskelfunktion.
Under det senaste årtiondet zebrafisk har blivit allt vanligare att studera muskel cellbiologi och sjukdom. Den snabba extern utveckling av zebrafisk embryo, i kombination med dess optiska klarhet, tillåter direkt visualisering av muskelbildning, tillväxt och funktion. Processen för muskelutveckling är mycket konserverad i zebrafisk och detta har gjort det möjligt för framgångsrik modellering av en rad olika muskelsjukdomar inklusive muskeldystrofier och medfödda myopatier 1-8. Detaljerad undersökning av zebrafisk modeller har inte bara gett nya insikter i patobiologi av dessa villkor, men också en plattform för testning av lämpliga terapier 6,9-13.
Analysen av zebrafisk modeller av muskelsjukdomar bygger på tillförlitliga och reproducerbara analyser för att mäta muskelprestation. Tidigare studier har framgångsrikt mäts den kraft genererande förmågan hos zebrafisk trunk muskeln i fisk mellan 3 och 7 dpf avelektriskt stimulera sammandragning av stillastående fisk ansluten till en kraft överföring systemet 14. Detta kan ge detaljerade mätningar av kraft, men är inte idealiska för högre genomströmning experiment och det finns fördelar med att mäta muskelprestation under simning. Vid 2 dpf zebrafisk muskler är fullt fungerande och fisken kan framkalla brast simning rörelser som svar på stimuli. Touch-framkalla flyktsvar analys används för att mäta acceleration under en skur simning rörelse, som kan användas som ett mått på sammandragande kraft.
En av de mest använda åtgärderna i muskelfunktion i myopati patienter är 6 min gångtest, som registrerar det totala avståndet gick på en hård plan yta 15,16. Vi har tillämpat en jämförbar test för att mäta muskelfunktion i 6 dpf zebrafisk larver, där vi övervakar det totala avståndet badat, och det totala antalet förflyttningar av varje larv under en 10-minutersperiod. Detta utförsmed hjälp av ett automatiserat system för spårning, som ger tillförlitliga och hög genomströmning mätningar av muskelprestanda. Båda muskeltester är mycket reproducerbar och har använts för att kvantifiera skillnaderna i muskel prestanda i zebrafisk myopati modeller 8.
Många olika djurmodeller, inklusive möss, hundar, zebrafisk, flugor och maskar har bidragit till vår förståelse av den genetiska och molekylära grunden för muskelsjukdomar, och bidragit till utveckling av terapeutiska strategier för att bekämpa dem. Zebrafisk har flera fördelar för studiet av muskelsjukdom. Zebrafisk ger en genetiskt manipulerbar system för bedömning av komplex muskel mönstring i en lämplig fysiologisk miljö, vilket inte är möjligt i in vitro odlingssystem. Till skillnad från andra ryggradsdjur djurmodeller, det stora antalet fiskar produceras, tillsammans med dess optiska klarhet, underlättar snabb, high-throughput in vivo kemisk och genetisk screening.
Här beskriver vi utvecklingen av zebrafisk rörelseanalyser för att ge en hög genomströmning och automatisk metod för att bedöma muskel prestanda under zebrafisk embryogenes. För båda analyserna måste det erkännas att dygnsrytmen ochyttre stimuli från omgivningen kommer att avsevärt påverka zebrafisk simbeteende 17,18. Upprepad testning av samma zebrafisk kommer också att leda till tillvänjning orsakar en minskning i svar på den taktila stimulus 23. Därför bör i syfte att uppnå reproducerbara resultat mellan experiment varje zebrafisk embryo endast provas en gång, den tid på dygnet och ljusförhållanden bör standardiseras, och vattentemperatur måste hårt reglerad.
Använda styr framkallade analys vid 2 dpf vi kan direkt mäta den maximala accelerationen av en skur simning handling, som är proportionell mot muskelstyrka. Tidigare tekniker i zebrafisk har undersökt muskelkraften genom att knyta båda ändarna av embryon till experimentell utrustning varefter muskelsammandragning stimuleras med hjälp av ett elektriskt fält och den kraft-genererande förmåga muskeln 14 mäts. Även denna metod mäter den kraft produktionskapacitet than larv muskel, inte mäta den faktiska kraft som genereras av larv muskler under simning. Vi utvecklade därför en metod för att indirekt bedöma den kraft som genereras under normal larver simning rörelse för att ge en övergripande mått på muskel hälsa. Videosystemet för höghastighetståg, som kan spela in enskilda zebrafisk rörelser på en bildhastighet på 1000 bilder / sek kan användas för att identifiera små men signifikanta skillnader i muskelfunktion, som inte är direkt urskiljbara med ögat. Det kommer att vara av intresse att se hur tidigare rapporterade förändringar i elektriskt stimulerad kraft generationens korrelerar med förändringar i simning prestanda.
Dessutom framkallat anslagskänslighet analyser kan också användas för att bedöma simning kinematik, såsom form och hastighet vågigt under simning motion 24, för att ge en kvantitativ mätning av motoriskt beteende.
På grund av den spontana rörelsen av zebrafish larver efter tre dpf var vi inte kunna utföra de berörings framkalla analyser för att mäta muskelfunktion. Omvänt, mätte vi muskel prestanda under en längre tid genom att bestämma avståndet simmat genom zebrafisk larver på 6 dpf. Detta test, även om ett indirekt mått på muskelfunktion, kan användas för att identifiera fisk som visar försämrad muskelprestanda 8 eller neurodegeneration 25,26. Detta test ger inte bara ett mått analogt med 6 min gångtest men är också lämplig för automatiserad hög genomströmning in vivo drog- eller mutagenes skärmar.
The authors have nothing to disclose.
We thank Viewpoint for their kind sponsorship of this manuscript. This work was funded by an Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant (APP1010110).
21G X 1' Blunt Needle | Terumo/Admiral Medical Supplies | TE2125 | |
48-well plates | Sigma | M8937 | |
90mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S90001 | |
High Speed Camera | Baumer | HXC20 | |
http://www.randomization.com | N/A | Steps 1.1.2, 2.1.3 | |
Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
Plastic Pipette | VWR | 16001-188 | |
StreamPix5 | NorPix | Step 1.2.3 | |
Temperature Control Unit | Viewpoint | ||
Tweezers, style 8 | ProSciTech | T04-821 | |
Zebrabox System | Viewpoint | ||
Zebralab | Viewpoint | Steps 1.3.1, 2.2.1 |