Bir Pnömatik Damlacık Manipülasyon Platformu Multi-nükleotid Polimorfizmlerinin Görsel Kolorimetrik Tespiti
Summary
Bu eser bir pnömatik damlacık manipülasyon platformunda çoklu nükleotid polimorfizmi tespit etmek için basit ve görsel bir yöntem sunar. Damlacık manipülasyon ve çoklu nükleotid polimorfizmlerinin tespiti de dahil olmak üzere önerilen yöntem, tüm deney ile, ileri araçların yardımı olmadan, 23 ° C civarındaki gerçekleştirilebilir.
Abstract
çoklu nükleotid polimorfizmi (MNT) tespit etmek için basit ve görsel bir yöntem açık yüzeyi üzerinde bir pnömatik damlacık manipülasyon platformu üzerinde gerçekleştirilmiştir. kolorimetrik DNA tespiti için bu yaklaşım, altın nano parçacık probları (AuNP Probes) hibridizasyon aracılı büyüme dayanıyordu. AuNP büyüme boyutu ve düzenlemesi probları ile hibridize DNA numunelerinin sayısı hakimdir. Nanopartiküllerin spesifik büyüklük-ve biçime bağlıdır optik özelliklerine bağlı olarak, sondalar için örnek bir DNA fragmanı uyuşmazlıkları ayırt edilmesi mümkün olan. testleri, sırasıyla reaktifler ve DNA örnekleri ihtiva eden damlacıklar ile gerçekleştirilmiştir, ve esnek PDMS göre süperhidrofobik membran kontrol pnömatik emme ile taşınan ve pnömatik bir platform üzerinde karıştırıldı. Damlacıklar hiçbir yan eff ile son derece biyouyumlu olduğu önerilen pnömatik platformda açık yüzey üzerinde aynı anda ve tam teslim edilebilirdamlacıklar içindeki DNA örneklerinin vb. İki önerilen yöntemler birleştiren çoklu nükleotid polimorfizmi pnömatik damlacık manipülasyon platformunda bakışta tespit edilebilir; hiçbir ek cihaz gereklidir. sonuca platformda damlacıklar yükleme Prosedür mevcut yöntemlere göre çok daha az az 5 dakika alır. Ayrıca, bu kombine MNP bir tarama yaklaşımı, bir makro sistemin daha belirgin az Her işlem, sadece 10 ul numune hacmi gerekir.
Introduction
Bir DNA sekansının bir tek baz çifti fark tek nükleotid polimorfizm (SNP), en yaygın genetik varyasyonları biridir. Mevcut çalışmalar SNP hastalık riski, ilaç etkinliği ve gen fonksiyonlarını etkileyerek bireylerin yan etkileri ile ilişkili olduğunu bildirmektedir. 1,2 Son çalışmalar da iki veya çok nokta mutasyonları (multi-nükleotid polimorfizmi) belirli hastalıklar ve bireysel neden olduğunu ortaya hastalığın etkileri farklılıklar. 3,4 nükleotid polimorfizm tespit hastalığı prescreening nedenle zorunludur. Diziye özgü oligonükleotid hızlı tespiti için basit ve etkili yöntemler son derece son yirmi yılda geliştirilmiştir. Vb prob immobilizasyon, floresan etiketleme, jel elektroforezi de dahil olmak üzere prosedürler genellikle DNA mutasyonları tespit dahil 1,5 Güncel yaklaşımlar, 6,7 ancak bu yöntemler genellikle masraflı, uzun analitik süreç gerektirirsive ekipman, iyi eğitimli teknisyenler ve numune ve reaktiflerin önemli tüketim.
hacmi ve benzersiz fiziksel ve kimyasal özelliklerine yüzey alanının büyük bir oranı ile bir nanopartikül belirli biyolojik bir çok hassas ve ucuz bir algılama platformu olarak ideal bir malzemedir. Altın nanopartiküller (AuNP) yaygın oligonükleotid prob ile değiştirilecek dolayı büyük bir yetenek DNA tespiti için kullanılır. 8-10 SNP tespit teknikleri de AuNP kullanılarak geliştirilmiştir. 11-13 Bu çalışmada biz tespit etmek için yeni bir kolorimetrik yaklaşımını benimsemiştir çoklu nükleotid polimorfizmi (MNT) AuNP problarının DNA hibridizasyon dolayımlı büyüme ile. 14, bu basit ve hızlı tarama yöntemi teorisine dayanmaktadır konjuge tek bağlı DNA (ssDNA) ya da çift-şeritli DNA (dsDNA) değişik uzunluklarda AuNP büyüme büyüklüğü ve şekli etkileyen AuNP (Şekil 1 e bakınız). 15, DNA Bu tespit yöntemireaktiflerin küçük tüketimi, küçük bir deney süresi (birkaç dakika) ve klinik tanı ve yerli tıbbi tarama için ileriye dönük uygulanabilir termal kontrolü olmadan basit bir prosedür vardır.
DNA'nın duyarlılık, algılama sınırı ve özgüllüğünü artırmak amacıyla deneysel protokolleri büyük ölçekli ekipman az parçalarını gerekli geleneksel deneysel protokollerin evrimleştiği, 16 o mikroakışkan sistemleri ve basitleştirilmiş DNA dizisini tespit etmek için birkaç mikroakışkan sistemleri geliştirilmiştir biyosensör. Mikroakışkan sistemleri DNA saptama yöntemleri de heterojen bir SNP tespit etmek tek okuma için, ancak, sinyal amplifikasyonu ve bir floresan okuyucu için, bir PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) gibi bir sonraki işlem aletleri makine gerektirir. 17,18 basit geliştirilmesi sonraki işlem olmadan platformu doğrudan çoklu nükleotid polimorfizmi sonuçlarını okumakyüksek ölçüde istenmektedir. Karşılaştırıldığında iyi kullanılan geleneksel, mikroakışkan kapalı sistemler, mikroakışkan cihazlar umut verici gibi net bir optik yol, örneğe erişmek için kolay bir yol, doğrudan çevre erişilebilirlik ve hiçbir kolaylıkla oluşturulan kavitasyon ya da ara yüzey tıkanıklığı gibi birçok avantaj sunar açık yüzey kanalı. 19 Daha önceki çalışma olan, bu platformun, damlacıklar aynı anda taşınan ve bir emme kuvveti kullanarak bir itici enerji müdahalesi olmaksızın manipüle edilebilir On açık yüzey damlacık manipülasyon (Şekil 2). 20 için basit bir pnömatik platformu tanıtıldı biyolojik ve kimyasal uygulamalarda büyük bir potansiyel. Bu pnömatik platformu, böylece AuNP problarının DNA hibridleşmesinden faydalanan aracılı büyüme kavramı kullanılarak kolorimetrik bir yaklaşım ile kombinasyon halinde MNT tespiti için DNA örneklerinin işleme yürütmek için kullanıldı.
Bu çalışmada sunulan protokol açıklarAçık bir yüzey üzerinde pnömatik damlacık manipülasyon platformunda çoklu nükleotid polimorfizmlerinin basit bir görsel algılama. Bu çalışma çok nükleotid polimorfizmi çıplak gözle saptanabilir olduğunu doğrular; Önerilen pnömatik platformu biyolojik ve kimyasal uygulamalar için uygundur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, basit bir kolorimetrik yöntem MNP 0,11-0,50 uM arasında mikrosantrifüj tüpleri içinde değişen konsantrasyonlarda uygulanabilir tespit etmek. Ayrıca, önerilen MNP saptama yöntemi, DNA taraması ve diğer biyo-medikal uygulamalar için yüksek potansiyele sahip bir pnömatik damlacık manipülasyon platformunda yapılır. Uygulamada, DNA örneği konsantrasyonu tespit edilebilir niteliktedir çalışma platformları karıştırma verimliliğine bağlıdır. coalesced damlacık tamamen karışık old…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ministry of Science and Technology of Taiwan provided financial support of this research under contracts MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3.
Materials
| PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| benchtop engravers | Roland DG | EGX-400 | |
| laser cutting machine | Universal Laser Systems, Inc. | VLS 3.50 | |
| Oxygen plasma treatment system | Femto Science Inc. Korea | CUTE-MPR | |
| solenoid valve | home built | ||
| vacuum pump | ULVAC KIKO, Inc. | DA-30D | |
| 13-nm AuNP solution | TAN Bead Inc., Taiwan | NG-13 | |
| DNA (with 5 -end labeled thiol) | MDBio, Inc., Taiwan | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | UniRegion Bio-Tech,. Taiwan | PBS001-1L | |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | J. T. baker | 4095-04 | |
| Hydroxylamine solution (NH2OH) | Sigma-Aldrich | 467804 | |
| Chloroauric acid (HAuCl4) | Sigma-Aldrich | G4022 | |
| sodium chloride (NaCl) | |||
| vortex mixer | Digisystem Laboratory Instruments Inc. | VM-2000 | |
| centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH. | Z 216 MK |
Referências
- Chorley, B. N., et al. Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies. Mutat. Res. Rev. Mutat. 659 (1), 147-157 (2008).
- Hinds, D. A., et al. Whole-genome patterns of common DNA variation in three human populations. Science. 307 (5712), 1072-1079 (2005).
- Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing. Nucleic Acids Res. , 408 (2010).
- Whelan, S., Goldman, N. Estimating the frequency of events that cause multiple-nucleotide changes. Genética. 167 (4), 2027-2043 (2004).
- Saiki, R. K., Walsh, P. S., Levenson, C. H., Erlich, H. A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (16), 6230-6234 (1989).
- Kim, S., Misra, A. SNP genotyping: technologies and biomedical applications. Annu. Rev. Biomed. Eng. 9, 289-320 (2007).
- Kwok, P. Y., Chen, X. Detection of single nucleotide polymorphisms. Curr. Issues Mol. Biol. 5, 43-60 (2003).
- Elghanian, R., Storhoff, J. J., Mucic, R. C., Letsinger, R. L., Mirkin, C. A. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles. Science. 277 (5329), 1078-1081 (1997).
- Lee, J. S., Han, M. S., Mirkin, C. A. Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-Functionalized Gold Nanoparticles. Angew. Chem. 119 (22), 4171-4174 (2007).
- Storhoff, J. J., et al. Gold nanoparticle-based detection of genomic DNA targets on microarrays using a novel optical detection system. Biosens. Bioelectron. 19 (8), 875-883 (2004).
- Bao, Y. P., et al. SNP identification in unamplified human genomic DNA with gold nanoparticle probes. Nucleic Acids Res. 33 (2), 15-15 (2005).
- Chen, Y. T., Hsu, C. L., Hou, S. Y. Detection of single-nucleotide polymorphisms using gold nanoparticles and single-strand-specific nucleases. Anal. Biochem. 375 (2), 299-305 (2008).
- Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (39), 14036-14039 (2004).
- Fang, W. F., Chen, W. J., Yang, J. T. Colorimetric determination of DNA concentration and mismatches using hybridization-mediated growth of gold nanoparticle probes. Sensor. Actuat. B Chem. 192, 77-82 (2014).
- Wang, Z., Zhang, J., Ekman, J. M., Kenis, P. J., Lu, Y. DNA-mediated control of metal nanoparticle shape: one-pot synthesis and cellular uptake of highly stable and functional gold nanoflowers. Nano Lett. 10 (5), 1886-1891 (2010).
- Chen, L., Manz, A., Day, P. J. Total nucleic acid analysis integrated on microfluidic devices. Lab Chip. 7 (11), 1413-1423 (2007).
- Lien, K. Y., Liu, C. J., Lin, Y. C., Kuo, P. L., Lee, G. B. Extraction of genomic DNA and detection of single nucleotide polymorphism genotyping utilizing an integrated magnetic bead-based microfluidic platform. Microfluid. Nanofluid. 6 (4), 539-555 (2009).
- Ng, J. K. K., Feng, H. H., Liu, W. T. Rapid discrimination of single-nucleotide mismatches using a microfluidic device with monolayered beads. Anal. Chim. Acta. 582 (2), 295-303 (2007).
- Xing, S., Harake, R. S., Pan, T. Droplet-driven transports on superhydrophobic-patterned surface microfluidics. Lab Chip. 11 (21), 3642-3648 (2011).
- Huang, C. J., Fang, W. F., Ke, M. S., Chou, H. Y. E., Yang, J. T. A biocompatible open-surface droplet manipulation platform for detection of multi-nucleotide polymorphism. Lab Chip. 14 (12), 2057-2062 (2014).
- Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials. Nature. 382 (6592), 607-609 (1996).
- Ichimura, K., Oh, S. K., Nakagawa, M. Light-driven motion of liquids on a photo-responsive surface. Science. 288 (5471), 1624-1626 (2000).
- Jones, T. B., Gunji, M., Washizu, M., Feldman, M. J. Dielectrophoretic liquid actuation and nanodroplet formation. J. Appl. Phys. 89 (2), 1441-1448 (2001).
- Lee, J., Kim, C. J. C. Surface-tension-driven microactuation based on continuous electrowetting. J. Microelectromech. S. 9 (2), 171-180 (2000).
- Daniel, S., Chaudhury, M. K., De Gennes, P. G. Vibration-actuated drop motion on surfaces for batch microfluidic processes. Langmuir. 21 (9), 4240-4248 (2005).
- Darhuber, A. A., Valentino, J. P., Davis, J. M., Troian, S. M., Wagner, S. Microfluidic actuation by modulation of surface stresses. Appl. Phys. Lett. 82 (4), 657-659 (2003).
