A detecção visual Colorimétrico de polimorfismos multi-nucleótidos em uma plataforma de manipulação pneumático gota
Summary
Este trabalho apresenta um método simples e visual para detectar polimorfismos multi-nucleotídeos em uma plataforma de manipulação gota pneumático. Com o método proposto, toda a experiência, incluindo gota de manipulação e de detecção de polimorfismos de vários nucleótidos, pode ser realizada próximo de 23 ° C, sem o auxílio de instrumentos avançados.
Abstract
Um método simples e visual para detectar polimorfismo de multi-nucleótido (MNP) foi realizada sobre uma plataforma de manipulação gota pneumática sobre uma superfície aberta. Esta abordagem para a detecção de ADN foi colorimétrico baseado no crescimento mediada por hibridação de sondas de nanopartulas de ouro (sondas AUNP). O tamanho e a configuração do crescimento do AUNP são dominadas pelo número de amostras de DNA hibridaram com as sondas. Com base nas propriedades ópticas e SIZE- dependente da forma específica das nanopartículas, o número de desemparelhamentos de um fragmento de ADN da amostra com as sondas é capaz de ser discriminado. Os testes foram realizados através de gotículas contendo os reagentes e as amostras de ADN, respectivamente, e foram transportadas e misturado na plataforma pneumática com a sucção pneumática controlada da membrana hidrofóbicas à base de PDMS flexíveis. Gotículas podem ser entregues simultaneamente e, precisamente, numa superfície aberta na plataforma pneumática proposta que é altamente biocompatível sem FEP ladoect de amostras de ADN no interior das gotas. A combinação dos dois métodos propostos, o polimorfismo de multi-nucleótido pode ser detectada à vista sobre a plataforma de manipulação gota pneumático; nenhum instrumento adicional é necessária. O procedimento de instalação das gotas na plataforma para o resultado final leva menos de cinco minutos, muito menos do que os métodos existentes. Além disso, esta abordagem combinada de detecção MNP exige um volume de amostra de apenas 10 ul em cada operação, o que é notavelmente menos do que a de um sistema de macro.
Introduction
-polimorfismo de um único nucleótido (SNP), que é uma única diferença de par de bases numa sequência de ADN, é uma das variações genéticas mais comuns. Estudos atuais relatam que SNPs estão associados com o risco de doença, a eficácia da droga e os efeitos colaterais dos indivíduos por afetar a função do gene. 1,2 Estudos recentes também revelou que as mutações de dois ou multi-ponto (polimorfismo multi-nucleotídeo) causam doenças específicas e individuais diferenças nos efeitos da doença 3,4 A detecção de polimorfismo de nucleotídeo. é, portanto, imperativo prescreening doença. Métodos simples e eficientes para a detecção rápida de oligonucleotídeos específicos de sequência foram altamente desenvolvido nas últimas duas décadas. 1,5 As abordagens atuais para identificar mutações no DNA tipicamente procedimentos, incluindo a imobilização da sonda, rotulagem de fluorescência, eletroforese em gel, etc. envolvem, 6,7 mas estes métodos requerem geralmente um processo analítico de comprimento, expenequipamentos sive, os técnicos bem treinados e consumo significativo de amostras e reagentes.
Uma nanopartícula com uma grande proporção de área de superfície para volume e propriedades físico-químicas únicas é um material ideal como uma plataforma de detecção altamente sensível e barato para biomarcadores específicos. As nanopartículas de ouro (AUNP) são amplamente utilizados para a detecção de DNA devido à sua grande capacidade de ser modificado com sondas de oligonucleotídeos. 8-10 técnicas de detecção de SNP também foram desenvolvidos usando AUNP. 11-13 Neste trabalho adotamos uma nova abordagem colorimétrico para detectar a polimorfismo multi-nucleótido (MNP) através do DNA crescimento mediada por hibridação de sondas AUNP. 14 Este método de sondagem simples e rápida é baseada na teoria de que os comprimentos variados de ADN de cadeia simples (ssDNA) ou de ADN de cadeia dupla (dsDNA), conjugada com AUNP influenciar o crescimento do tamanho e forma do AUNP (ver Figura 1). 15 Este método de detecção de ADNapresenta um pequeno consumo de reagentes, um ensaio de duração pequena (alguns minutos), e um processo simples, sem controlo térmico que é aplicável prospectivamente para o diagnóstico clínico e um exame médico interno.
Vários sistemas de microfluido para detectar a sequência de ADN ter sido desenvolvido; 16 Estes sistemas de microfluidos, evoluíram a partir de protocolos experimentais tradicionais, necessária menos peças de equipamento de grandes dimensões e simplificada os protocolos experimentais, de modo a melhorar a sensibilidade, limite de detecção e especificidade do ADN biossensor. Métodos de detecção de DNA nos sistemas microfluídicos ainda exigem, no entanto, instrumentos de um processo subsequente, como a PCR (reação em cadeia da polimerase) máquinas para a amplificação de sinal e um leitor de fluorescência para uma única leitura para identificar o SNP heterogêneo. 17,18 Desenvolvimento de uma simples plataforma sem o processamento subsequente para ler diretamente os resultados de polimorfismo multi-nucleotídeoé altamente desejável. Comparado ao bem utilizado, convencional, fechou sistemas microfluídicos, o open-superfície dispositivos microfluídicos oferecem promissora várias vantagens, tais como um caminho óptico claro, uma maneira fácil de acessar a amostra, a acessibilidade ambiental direta e cavitação não facilmente formadas ou obstrução interfacial em o canal. 19 o nosso trabalho anterior apresentou uma plataforma pneumático simples para a manipulação da superfície aberta gotícula (ver Figura 2). 20 Nesta plataforma, as gotas podem ser simultaneamente transportadas e manipulado sem interferência a partir de uma energia motriz usando uma força de sucção, que tem um grande potencial em aplicações biológicas e químicas. Esta plataforma pneumático foi assim utilizada para executar a manipulação de amostras de ADN para a detecção de MNP em combinação com a abordagem colorimétrico utilizando o conceito de ADN crescimento mediada por hibridação de sondas AUNP.
O protocolo apresentado neste artigo descreveuma detecção visual simples de polimorfismos multi-nucleotídeos na plataforma manipulação gota pneumático em uma superfície aberta. Este trabalho confirma que o polimorfismo multi-nucleotídeo é detectável a olho nu; a plataforma pneumático proposto é adequado para aplicações biológicas e químicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, um método colorimétrico simples para detectar MNP pode ser implementado em concentrações que variam de 0.11-0.50 uM em tubos de microcentrífuga. Além disso, o método de detecção MNP proposto é conduzida sobre uma plataforma de manipulação gota pneumático que tem um elevado potencial para o rastreio de ADN e outras aplicações biomédicas. Na prática, o intervalo da concentração detectável de ADN da amostra depende da eficiência de mistura dos plataformas operacionais. Para assegurar q…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ministry of Science and Technology of Taiwan provided financial support of this research under contracts MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3.
Materials
| PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| benchtop engravers | Roland DG | EGX-400 | |
| laser cutting machine | Universal Laser Systems, Inc. | VLS 3.50 | |
| Oxygen plasma treatment system | Femto Science Inc. Korea | CUTE-MPR | |
| solenoid valve | home built | ||
| vacuum pump | ULVAC KIKO, Inc. | DA-30D | |
| 13-nm AuNP solution | TAN Bead Inc., Taiwan | NG-13 | |
| DNA (with 5 -end labeled thiol) | MDBio, Inc., Taiwan | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | UniRegion Bio-Tech,. Taiwan | PBS001-1L | |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | J. T. baker | 4095-04 | |
| Hydroxylamine solution (NH2OH) | Sigma-Aldrich | 467804 | |
| Chloroauric acid (HAuCl4) | Sigma-Aldrich | G4022 | |
| sodium chloride (NaCl) | |||
| vortex mixer | Digisystem Laboratory Instruments Inc. | VM-2000 | |
| centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH. | Z 216 MK |
Referências
- Chorley, B. N., et al. Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies. Mutat. Res. Rev. Mutat. 659 (1), 147-157 (2008).
- Hinds, D. A., et al. Whole-genome patterns of common DNA variation in three human populations. Science. 307 (5712), 1072-1079 (2005).
- Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing. Nucleic Acids Res. , 408 (2010).
- Whelan, S., Goldman, N. Estimating the frequency of events that cause multiple-nucleotide changes. Genética. 167 (4), 2027-2043 (2004).
- Saiki, R. K., Walsh, P. S., Levenson, C. H., Erlich, H. A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (16), 6230-6234 (1989).
- Kim, S., Misra, A. SNP genotyping: technologies and biomedical applications. Annu. Rev. Biomed. Eng. 9, 289-320 (2007).
- Kwok, P. Y., Chen, X. Detection of single nucleotide polymorphisms. Curr. Issues Mol. Biol. 5, 43-60 (2003).
- Elghanian, R., Storhoff, J. J., Mucic, R. C., Letsinger, R. L., Mirkin, C. A. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles. Science. 277 (5329), 1078-1081 (1997).
- Lee, J. S., Han, M. S., Mirkin, C. A. Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-Functionalized Gold Nanoparticles. Angew. Chem. 119 (22), 4171-4174 (2007).
- Storhoff, J. J., et al. Gold nanoparticle-based detection of genomic DNA targets on microarrays using a novel optical detection system. Biosens. Bioelectron. 19 (8), 875-883 (2004).
- Bao, Y. P., et al. SNP identification in unamplified human genomic DNA with gold nanoparticle probes. Nucleic Acids Res. 33 (2), 15-15 (2005).
- Chen, Y. T., Hsu, C. L., Hou, S. Y. Detection of single-nucleotide polymorphisms using gold nanoparticles and single-strand-specific nucleases. Anal. Biochem. 375 (2), 299-305 (2008).
- Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (39), 14036-14039 (2004).
- Fang, W. F., Chen, W. J., Yang, J. T. Colorimetric determination of DNA concentration and mismatches using hybridization-mediated growth of gold nanoparticle probes. Sensor. Actuat. B Chem. 192, 77-82 (2014).
- Wang, Z., Zhang, J., Ekman, J. M., Kenis, P. J., Lu, Y. DNA-mediated control of metal nanoparticle shape: one-pot synthesis and cellular uptake of highly stable and functional gold nanoflowers. Nano Lett. 10 (5), 1886-1891 (2010).
- Chen, L., Manz, A., Day, P. J. Total nucleic acid analysis integrated on microfluidic devices. Lab Chip. 7 (11), 1413-1423 (2007).
- Lien, K. Y., Liu, C. J., Lin, Y. C., Kuo, P. L., Lee, G. B. Extraction of genomic DNA and detection of single nucleotide polymorphism genotyping utilizing an integrated magnetic bead-based microfluidic platform. Microfluid. Nanofluid. 6 (4), 539-555 (2009).
- Ng, J. K. K., Feng, H. H., Liu, W. T. Rapid discrimination of single-nucleotide mismatches using a microfluidic device with monolayered beads. Anal. Chim. Acta. 582 (2), 295-303 (2007).
- Xing, S., Harake, R. S., Pan, T. Droplet-driven transports on superhydrophobic-patterned surface microfluidics. Lab Chip. 11 (21), 3642-3648 (2011).
- Huang, C. J., Fang, W. F., Ke, M. S., Chou, H. Y. E., Yang, J. T. A biocompatible open-surface droplet manipulation platform for detection of multi-nucleotide polymorphism. Lab Chip. 14 (12), 2057-2062 (2014).
- Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials. Nature. 382 (6592), 607-609 (1996).
- Ichimura, K., Oh, S. K., Nakagawa, M. Light-driven motion of liquids on a photo-responsive surface. Science. 288 (5471), 1624-1626 (2000).
- Jones, T. B., Gunji, M., Washizu, M., Feldman, M. J. Dielectrophoretic liquid actuation and nanodroplet formation. J. Appl. Phys. 89 (2), 1441-1448 (2001).
- Lee, J., Kim, C. J. C. Surface-tension-driven microactuation based on continuous electrowetting. J. Microelectromech. S. 9 (2), 171-180 (2000).
- Daniel, S., Chaudhury, M. K., De Gennes, P. G. Vibration-actuated drop motion on surfaces for batch microfluidic processes. Langmuir. 21 (9), 4240-4248 (2005).
- Darhuber, A. A., Valentino, J. P., Davis, J. M., Troian, S. M., Wagner, S. Microfluidic actuation by modulation of surface stresses. Appl. Phys. Lett. 82 (4), 657-659 (2003).
