החזותי איתור מדד-צבע של פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד על פלטפורמת מניפולציה אגל פניאומטיים
Summary
עבודה זו מציגה שיטה פשוטה וחזותית לזהות פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד על פלטפורמת מניפולצית אגל פנאומטי. עם השיטה המוצעת, הניסוי כולו, כולל מניפולציה אגל וזיהוי של פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד, יכול להתבצע ליד 23 מעלות צלזיוס ללא סיוע של מכשירים מתקדמים.
Abstract
שיטה פשוטה וחזותית לזהות פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד (MNP) בוצעה על פלטפורמת מניפולציה אגל פנאומטי על משטח פתוח. גישה זו לגילוי DNA colorimetric התבססה על גידול בתיווך הכלאה של בדיקות ננו-חלקיקים מזהב (בדיקות AuNP). גודל הצמיחה והתצורה של AuNP נשלטים על ידי מספר דגימות DNA כלאה עם הבדיקות. בהתבסס על התכונות האופטיות size- וצורה תלויה הספציפיות של החלקיקים, מספר אי התאמות ב קטע DNA במדגם של הבדיקות הוא מסוגל להיות מופלה. הבדיקות נערכו באמצעות טיפות המכילות חומרים כימי דגימות DNA בהתאמה, והוסעו מעורבים בפלטפורמת פנאומטי עם היניקה פנאומטי המבוקרת של הממברנה הידרופובי המבוססת PDMS הגמישה. טיפות ניתן לשלוח בו-זמנית ודווקא על-פני השטח פתוח על פלטפורמת פנאומטי המוצע, שהינו ביולוגית ללא EFF בצדect של דגימות DNA בתוך טיפות. שילוב שתי השיטות מוצעות, פולימורפיזם נוקלאוטיד רב ניתן לאתר ממבט על פלטפורמת מניפולצית אגל פנאומטי; שום מכשיר נוסף נדרש. ההליך להתקין הטיפין על הפלטפורמה לתוצאה הסופית לוקח פחות מ -5 דקות, הרבה פחות מאשר עם שיטות קיימות. יתר על כן, גישת זיהוי משולבת MNP זה דורשת נפח דגימה של רק 10 μl בכל פעולה, המהווה להפליא פחות מזו של מערכת מאקרו.
Introduction
פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (SNP), אשר בדל בסיס-זוג אחד ברצף ה- DNA, הוא אחד הווריאציות הגנטיות הנפוצות ביותר. נוכחי מחקרים מדווחים כי SNPs קשור לסיכון למחלות, יעילות תרופה ואת תופעות לוואי של אנשים על ידי המשפיע תפקוד גן. 1,2 מחקרים שנעשה לאחרונה חשפו גם כי הוא בן שתים או ריבוי נקודות מוטציות (פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד) לגרום מחלות אדם מסוימות ההבדלים בהשפעות של המחלה. 3,4 הגילוי של פולימורפיזם נוקלאוטיד לכן חובה ב prescreening המחלה. שיטות פשוטות ויעילות עבור האיתור המהיר של oligonucleotides ספציפי רצף פותחו מאוד בשני העשורים האחרונים. 1,5 גישות נוכחיות לזהות מוטציות DNA בדרך כלל כרוכות הליכים, לרבות חוסר תנועה חללית, תיוג קרינה, ג'ל אלקטרופורזה, וכו ', 6,7 אבל שיטות אלה דורשים בדרך כלל תהליך אנליטי רב, expenציוד sive, טכנאים מאומנים היטב, וצריך משמעותי של דגימות ריאגנטים.
ננו-חלקיק עם יחס גדול של שטח פנים לנפח מאפייני physicochemical ייחודיים הוא חומר אידיאלי כפלטפורמת זיהוי רגישה וזולה מאוד עבור סמנים ספציפיים. חלקיקי זהב (AuNP) נמצאים בשימוש נרחב לגילוי DNA בגלל היכולת הגדולה שלהם כדי להיות שונה עם בדיקות oligonucleotide. 8-10 שיטות לזיהוי SNP פותחו גם באמצעות AuNP. 11-13 בעבודה זו אימצנו גישה colorimetric הרומן לזהות את פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד (MNP) באמצעות צמיחה הכלאה בתיווך DNA של בדיקות AuNP. 14 שיטה זו חיטוט פשוטה ומהירה מבוסס על התיאוריה כי אורכי מגוונת של דנ"א חד-גדילי (ssDNA) או פעמיים תקועים DNA (dsDNA) מצומדות כדי AuNP להשפיע על גודל צמיחה וצורה של AuNP (ראה איור 1). 15 שיטה זו של זיהוי DNAכולל צריכה קטנה של חומרים כימיים, משך assay קטן (כמה דקות), ואת הליך פשוט ללא בקרת תרמית כי ייושם לאבחון קליני סינון רפואי מקומי.
כמה מערכות microfluidic כדי לזהות את רצף הדנ"א פותחו; 16 אלה מערכות microfluidic, התפתחו פרוטוקולי ניסוי מסורתיים, נדרשו חתיכות פחות של ציוד בקנה מידה גדולה לפשט את פרוטוקולי הניסוי כדי לשפר את הרגישות, גבול גילוי וספציפי של ה- DNA biosensor. שיטות זיהוי DNA במערכות microfluidic עדיין דורשות, לעומת זאת, מכשירים של תהליך עקב כגון (תגובת שרשרת פולימראז) PCR מכונת הגברת אות קוראה קרינה עבור הודעה יחידה לזהות ה- SNP הטרוגנית. 17,18 פיתוח פשוט פלטפורמה ללא עיבוד לאחר להקריא את התוצאות ישירות של פולימורפיזם רב-נוקלאוטידרצוי מאוד. לעומת היטב בשימוש, קונבנציונלי, סגור מערכות microfluidic, מכשירי microfluidic-המשטח הפתוח מציעים מספר יתרונות באופן מבטיח, כגון נתיב אופטי ברור, דרך קלה לגשת המדגם, נגישות סביבתית ישירה ולא cavitation או חסימת interfacial נוצר בקלות הערוץ. 19 העבודה הקודמת שלנו שסללה פנאומטי פשוט מניפולצית אגל פתוח שטח (ראה איור 2). 20 על המשטח הזה, טיפות יכולות להיות מועברות זמנית מניפולציות בלי התערבות אנרגית נהיגה באמצעות כוח יניקה, אשר יש פוטנציאל גדול יישומים ביולוגיים וכימיים. פלטפורמה פנאומטי זה ובכך נוצל כדי לבצע מניפולציה של דגימות DNA לגילוי MNP בשילוב עם הגישה colorimetric באמצעות מושג הצמיחה הכלאה בתיווך DNA של בדיקות AuNP.
הפרוטוקול המובא במאמר זה מתארזיהוי ויזואלי פשוט של פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד על פלטפורמת מניפולציה אגל פנאומטי על משטח פתוח. עבודה זו מאשרת כי פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד ניתן לזהות בעין בלתי מזוינת; פלטפורמת פנאומטי המוצעת מתאימה ליישומים ביולוגיים וכימיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, שיטה colorimetric פשוט לזהות MNP ניתן ליישם בריכוזים הנעים בין 0.11-0.50 מיקרומטר צינורות microcentrifuge. יתר על כן, שיטת הזיהוי המוצע MNP מתנהל על פלטפורמת מניפולציה אגל פנאומטי בעל פוטנציאל גבוה להקרנה DNA ויישומים ביו-רפואיים אחרים. בפועל, הטווח לזיהוי של ריכוז ה- DNA מדגם ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ministry of Science and Technology of Taiwan provided financial support of this research under contracts MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3.
Materials
| PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| benchtop engravers | Roland DG | EGX-400 | |
| laser cutting machine | Universal Laser Systems, Inc. | VLS 3.50 | |
| Oxygen plasma treatment system | Femto Science Inc. Korea | CUTE-MPR | |
| solenoid valve | home built | ||
| vacuum pump | ULVAC KIKO, Inc. | DA-30D | |
| 13-nm AuNP solution | TAN Bead Inc., Taiwan | NG-13 | |
| DNA (with 5 -end labeled thiol) | MDBio, Inc., Taiwan | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | UniRegion Bio-Tech,. Taiwan | PBS001-1L | |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | J. T. baker | 4095-04 | |
| Hydroxylamine solution (NH2OH) | Sigma-Aldrich | 467804 | |
| Chloroauric acid (HAuCl4) | Sigma-Aldrich | G4022 | |
| sodium chloride (NaCl) | |||
| vortex mixer | Digisystem Laboratory Instruments Inc. | VM-2000 | |
| centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH. | Z 216 MK |
Referências
- Chorley, B. N., et al. Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies. Mutat. Res. Rev. Mutat. 659 (1), 147-157 (2008).
- Hinds, D. A., et al. Whole-genome patterns of common DNA variation in three human populations. Science. 307 (5712), 1072-1079 (2005).
- Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing. Nucleic Acids Res. , 408 (2010).
- Whelan, S., Goldman, N. Estimating the frequency of events that cause multiple-nucleotide changes. Genética. 167 (4), 2027-2043 (2004).
- Saiki, R. K., Walsh, P. S., Levenson, C. H., Erlich, H. A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (16), 6230-6234 (1989).
- Kim, S., Misra, A. SNP genotyping: technologies and biomedical applications. Annu. Rev. Biomed. Eng. 9, 289-320 (2007).
- Kwok, P. Y., Chen, X. Detection of single nucleotide polymorphisms. Curr. Issues Mol. Biol. 5, 43-60 (2003).
- Elghanian, R., Storhoff, J. J., Mucic, R. C., Letsinger, R. L., Mirkin, C. A. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles. Science. 277 (5329), 1078-1081 (1997).
- Lee, J. S., Han, M. S., Mirkin, C. A. Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-Functionalized Gold Nanoparticles. Angew. Chem. 119 (22), 4171-4174 (2007).
- Storhoff, J. J., et al. Gold nanoparticle-based detection of genomic DNA targets on microarrays using a novel optical detection system. Biosens. Bioelectron. 19 (8), 875-883 (2004).
- Bao, Y. P., et al. SNP identification in unamplified human genomic DNA with gold nanoparticle probes. Nucleic Acids Res. 33 (2), 15-15 (2005).
- Chen, Y. T., Hsu, C. L., Hou, S. Y. Detection of single-nucleotide polymorphisms using gold nanoparticles and single-strand-specific nucleases. Anal. Biochem. 375 (2), 299-305 (2008).
- Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (39), 14036-14039 (2004).
- Fang, W. F., Chen, W. J., Yang, J. T. Colorimetric determination of DNA concentration and mismatches using hybridization-mediated growth of gold nanoparticle probes. Sensor. Actuat. B Chem. 192, 77-82 (2014).
- Wang, Z., Zhang, J., Ekman, J. M., Kenis, P. J., Lu, Y. DNA-mediated control of metal nanoparticle shape: one-pot synthesis and cellular uptake of highly stable and functional gold nanoflowers. Nano Lett. 10 (5), 1886-1891 (2010).
- Chen, L., Manz, A., Day, P. J. Total nucleic acid analysis integrated on microfluidic devices. Lab Chip. 7 (11), 1413-1423 (2007).
- Lien, K. Y., Liu, C. J., Lin, Y. C., Kuo, P. L., Lee, G. B. Extraction of genomic DNA and detection of single nucleotide polymorphism genotyping utilizing an integrated magnetic bead-based microfluidic platform. Microfluid. Nanofluid. 6 (4), 539-555 (2009).
- Ng, J. K. K., Feng, H. H., Liu, W. T. Rapid discrimination of single-nucleotide mismatches using a microfluidic device with monolayered beads. Anal. Chim. Acta. 582 (2), 295-303 (2007).
- Xing, S., Harake, R. S., Pan, T. Droplet-driven transports on superhydrophobic-patterned surface microfluidics. Lab Chip. 11 (21), 3642-3648 (2011).
- Huang, C. J., Fang, W. F., Ke, M. S., Chou, H. Y. E., Yang, J. T. A biocompatible open-surface droplet manipulation platform for detection of multi-nucleotide polymorphism. Lab Chip. 14 (12), 2057-2062 (2014).
- Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials. Nature. 382 (6592), 607-609 (1996).
- Ichimura, K., Oh, S. K., Nakagawa, M. Light-driven motion of liquids on a photo-responsive surface. Science. 288 (5471), 1624-1626 (2000).
- Jones, T. B., Gunji, M., Washizu, M., Feldman, M. J. Dielectrophoretic liquid actuation and nanodroplet formation. J. Appl. Phys. 89 (2), 1441-1448 (2001).
- Lee, J., Kim, C. J. C. Surface-tension-driven microactuation based on continuous electrowetting. J. Microelectromech. S. 9 (2), 171-180 (2000).
- Daniel, S., Chaudhury, M. K., De Gennes, P. G. Vibration-actuated drop motion on surfaces for batch microfluidic processes. Langmuir. 21 (9), 4240-4248 (2005).
- Darhuber, A. A., Valentino, J. P., Davis, J. M., Troian, S. M., Wagner, S. Microfluidic actuation by modulation of surface stresses. Appl. Phys. Lett. 82 (4), 657-659 (2003).
