De Visual Colorimetrische Detectie van Multi-nucleotide polymorphisms op een pneumatische Droplet Manipulation Platform
Summary
Dit werk geeft een eenvoudige en visuele methode om multi-nucleotide polymorfismen detecteren op een pneumatische druppel manipulatie platform. Met de voorgestelde werkwijze, het gehele experiment, met inbegrip druppeltje manipulatie en detectie van multi-nucleotide polymorfismen dergelijke kunnen bij 23 ° C zonder behulp van geavanceerde instrumenten.
Abstract
Een eenvoudige en visuele methode om multi-nucleotide polymorfisme (MNP) sporen werd uitgevoerd op een pneumatische druppel manipulatie platform een open oppervlak. Deze benadering van DNA colorimetrische detectie werd gebaseerd op de hybridisatie-gemedieerde groei van goud nanodeeltjes probes (AuNP probes). De groei afmeting en configuratie van de AuNP worden gedomineerd door het aantal DNA-monsters gehybridiseerd met de probes. Gebaseerd op de specifieke grootte-en vorm-afhankelijke optische eigenschappen van de nanodeeltjes, het aantal verkeerde paringen in een DNA-monster fragment de probes kan worden onderscheiden. De tests werden uitgevoerd via druppeltjes bevattende reagentia en DNA-monsters respectievelijk, en werden getransporteerd en gemengd op de pneumatische platform met de bediende pneumatische zuigkracht van de flexibele PDMS-gebaseerde superhydrophobic membraan. Druppeltjes gelijktijdig en nauwkeurig worden afgeleverd op een open-oppervlak op de voorgestelde pneumatische platform dat is zeer biocompatibel zonder zijde effect van DNA-monsters in de druppels. De combinatie van de twee voorgestelde methoden, kan de multi-nucleotide polymorfismen worden gedetecteerd op zicht op de pneumatische druppel manipulatie platform; geen extra instrument noodzakelijk. De procedure van het installeren van de druppels op het platform om het eindresultaat duurt minder dan 5 minuten, veel minder dan bij bestaande werkwijzen. Bovendien is deze gecombineerde MNP detectiebenadering vereist een monstervolume van 10 pl in elke operatie, hetgeen opmerkelijk lager is dan die van een macro systeem.
Introduction
Enkele nucleotide polymorfisme (SNP), dat een enkele basepaar verschil in een DNA-sequentie, is een van de meest voorkomende genetische variaties. Huidige studies rapporteren dat SNPs geassocieerd met de ziekte risico, drug werkzaamheid en bijwerkingen van individuen door beïnvloeding genfunctie. 1,2 recent onderzoek is ook gebleken dat twee of meerdere puntmutaties (multi-nucleotide polymorfisme) bepaalde ziekte veroorzaakt en individuele verschillen in de effecten van de ziekte. 3.4 de detectie van nucleotide polymorfisme is daarom noodzakelijk in prescreening ziekte. Eenvoudige en efficiënte werkwijzen voor de snelle detectie van sequentie-specifieke oligonucleotiden werden sterk ontwikkeld in de laatste twee decennia. 1,5 Huidige benaderingen voor DNA-mutaties typisch procedures waaronder probe immobilisatie fluorescentie labeling, gelelektroforese, etc. identificeren betrekken 6,7 maar deze methoden vereisen over het algemeen een lange analytisch proces, uitgasive apparatuur, goed opgeleide technici, en een aanzienlijk verbruik van de monsters en reagentia.
Een nanodeeltjes met een grote verhouding van oppervlak tot volume en unieke fysisch-chemische eigenschappen is een ideaal materiaal als een zeer gevoelige en goedkope detectie platform voor specifieke biomarkers. Gouden nanodeeltjes (AuNP) worden veel gebruikt voor DNA detectie vanwege hun grote vermogen om te worden gemodificeerd met oligonucleotideprobes. 8-10 SNP detectie technieken werden ontwikkeld met AuNP. 11-13 In dit werk wij een nieuwe benadering voor de colorimetrische detectie aangenomen multi-nucleotide polymorfisme (MNP) door middel van DNA-hybridisatie-gemedieerde groei van AuNP probes. 14 Deze eenvoudige en snelle indringende methode is gebaseerd op de theorie dat verschillende lengten van enkelstrengs DNA (ssDNA) of dubbelstrengs DNA (dsDNA) geconjugeerd aan AuNP invloed op de groei grootte en vorm van de AuNP (zie figuur 1). 15 Deze methode van detectie DNAheeft een klein verbruik van reagentia, een kleine test periode (enkele minuten), en een eenvoudige procedure zonder temperatuurregeling die prospectief toepasbaar voor klinische diagnose en huishoudelijke medische screening.
Verscheidene microfluïdische systemen voor de DNA-sequentie te detecteren zijn ontwikkeld; 16 deze microfluïdische systemen geëvolueerd van traditionele experimentele protocollen vereist minder stukken grootschalige apparatuur en vereenvoudigde de testprotocollen teneinde de gevoeligheid, detectielimiet en specificiteit van de DNA verbeteren biosensor. DNA detectiemethoden in de microfluïdische systemen nog vereisen echter instrumenten van een volgend proces, zoals een PCR (polymerasekettingreactie) machine voor signaalversterking en een fluorescentie lezer voor een uitlezing van de heterogene SNP identificeren. 17,18 ontwikkelen van een eenvoudige platform zonder verdere verwerking direct uitlezen van de resultaten van de multi-nucleotide polymorfismeis zeer gewenst. Vergeleken met goed gebruikt, conventioneel, gesloten microfluïdische systemen, de open oppervlak microfluïdische inrichtingen verscheidene voordelen, zoals een heldere optische pad een eenvoudige toegang tot het monster, een rechtstreekse milieu toegankelijkheid en niet gemakkelijk gevormd cavitatie of grensvlak obstructie in bieden veelbelovend het kanaal. 19 Ons voorgaand onderzoek werd een eenvoudige pneumatische platform open oppervlak druppel manipulatie (zie figuur 2). 20 op dit platform, druppeltjes kunnen gelijktijdig worden getransporteerd en gemanipuleerd zonder inmenging van een aandrijfenergie via een zuigkracht die een heeft een groot potentieel in de biologische en chemische toepassingen. Deze pneumatische platform wordt aldus gebruikt voor de manipulatie van DNA-monsters uitgevoerd voor MNP detectie in combinatie met de colorimetrische benadering hand van het begrip van DNA-hybridisatie-gemedieerde groei van AuNP probes.
Het protocol in dit document beschrijfteen eenvoudige visuele detectie van multi-nucleotide polymorfismen op de pneumatische druppel manipulatie platform een open oppervlak. Dit werk bevestigd dat meerdere nucleotide polymorfisme detecteerbaar met het blote oog; de voorgestelde pneumatische platform is geschikt voor biologische en chemische toepassingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol, een eenvoudige colorimetrische methode voor het opsporen MNP kunnen in concentraties variërend 0,11-0,50 uM in reactievaatjes uitgevoerd. Verder is de voorgestelde MNP detectiemethode uitgevoerd op een pneumatische druppel manipulatie platform met een sterk vermogen voor het screenen van DNA en andere biomedische toepassingen heeft. In de praktijk, het detecteerbare bereik van het monster DNA-concentratie is afhankelijk van het mengrendement van de besturingsplatformen. Opdat de samengevoegde druppel v…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ministry of Science and Technology of Taiwan provided financial support of this research under contracts MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3.
Materials
| PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| benchtop engravers | Roland DG | EGX-400 | |
| laser cutting machine | Universal Laser Systems, Inc. | VLS 3.50 | |
| Oxygen plasma treatment system | Femto Science Inc. Korea | CUTE-MPR | |
| solenoid valve | home built | ||
| vacuum pump | ULVAC KIKO, Inc. | DA-30D | |
| 13-nm AuNP solution | TAN Bead Inc., Taiwan | NG-13 | |
| DNA (with 5 -end labeled thiol) | MDBio, Inc., Taiwan | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | UniRegion Bio-Tech,. Taiwan | PBS001-1L | |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | J. T. baker | 4095-04 | |
| Hydroxylamine solution (NH2OH) | Sigma-Aldrich | 467804 | |
| Chloroauric acid (HAuCl4) | Sigma-Aldrich | G4022 | |
| sodium chloride (NaCl) | |||
| vortex mixer | Digisystem Laboratory Instruments Inc. | VM-2000 | |
| centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH. | Z 216 MK |
Referências
- Chorley, B. N., et al. Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies. Mutat. Res. Rev. Mutat. 659 (1), 147-157 (2008).
- Hinds, D. A., et al. Whole-genome patterns of common DNA variation in three human populations. Science. 307 (5712), 1072-1079 (2005).
- Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing. Nucleic Acids Res. , 408 (2010).
- Whelan, S., Goldman, N. Estimating the frequency of events that cause multiple-nucleotide changes. Genética. 167 (4), 2027-2043 (2004).
- Saiki, R. K., Walsh, P. S., Levenson, C. H., Erlich, H. A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (16), 6230-6234 (1989).
- Kim, S., Misra, A. SNP genotyping: technologies and biomedical applications. Annu. Rev. Biomed. Eng. 9, 289-320 (2007).
- Kwok, P. Y., Chen, X. Detection of single nucleotide polymorphisms. Curr. Issues Mol. Biol. 5, 43-60 (2003).
- Elghanian, R., Storhoff, J. J., Mucic, R. C., Letsinger, R. L., Mirkin, C. A. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles. Science. 277 (5329), 1078-1081 (1997).
- Lee, J. S., Han, M. S., Mirkin, C. A. Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-Functionalized Gold Nanoparticles. Angew. Chem. 119 (22), 4171-4174 (2007).
- Storhoff, J. J., et al. Gold nanoparticle-based detection of genomic DNA targets on microarrays using a novel optical detection system. Biosens. Bioelectron. 19 (8), 875-883 (2004).
- Bao, Y. P., et al. SNP identification in unamplified human genomic DNA with gold nanoparticle probes. Nucleic Acids Res. 33 (2), 15-15 (2005).
- Chen, Y. T., Hsu, C. L., Hou, S. Y. Detection of single-nucleotide polymorphisms using gold nanoparticles and single-strand-specific nucleases. Anal. Biochem. 375 (2), 299-305 (2008).
- Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (39), 14036-14039 (2004).
- Fang, W. F., Chen, W. J., Yang, J. T. Colorimetric determination of DNA concentration and mismatches using hybridization-mediated growth of gold nanoparticle probes. Sensor. Actuat. B Chem. 192, 77-82 (2014).
- Wang, Z., Zhang, J., Ekman, J. M., Kenis, P. J., Lu, Y. DNA-mediated control of metal nanoparticle shape: one-pot synthesis and cellular uptake of highly stable and functional gold nanoflowers. Nano Lett. 10 (5), 1886-1891 (2010).
- Chen, L., Manz, A., Day, P. J. Total nucleic acid analysis integrated on microfluidic devices. Lab Chip. 7 (11), 1413-1423 (2007).
- Lien, K. Y., Liu, C. J., Lin, Y. C., Kuo, P. L., Lee, G. B. Extraction of genomic DNA and detection of single nucleotide polymorphism genotyping utilizing an integrated magnetic bead-based microfluidic platform. Microfluid. Nanofluid. 6 (4), 539-555 (2009).
- Ng, J. K. K., Feng, H. H., Liu, W. T. Rapid discrimination of single-nucleotide mismatches using a microfluidic device with monolayered beads. Anal. Chim. Acta. 582 (2), 295-303 (2007).
- Xing, S., Harake, R. S., Pan, T. Droplet-driven transports on superhydrophobic-patterned surface microfluidics. Lab Chip. 11 (21), 3642-3648 (2011).
- Huang, C. J., Fang, W. F., Ke, M. S., Chou, H. Y. E., Yang, J. T. A biocompatible open-surface droplet manipulation platform for detection of multi-nucleotide polymorphism. Lab Chip. 14 (12), 2057-2062 (2014).
- Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials. Nature. 382 (6592), 607-609 (1996).
- Ichimura, K., Oh, S. K., Nakagawa, M. Light-driven motion of liquids on a photo-responsive surface. Science. 288 (5471), 1624-1626 (2000).
- Jones, T. B., Gunji, M., Washizu, M., Feldman, M. J. Dielectrophoretic liquid actuation and nanodroplet formation. J. Appl. Phys. 89 (2), 1441-1448 (2001).
- Lee, J., Kim, C. J. C. Surface-tension-driven microactuation based on continuous electrowetting. J. Microelectromech. S. 9 (2), 171-180 (2000).
- Daniel, S., Chaudhury, M. K., De Gennes, P. G. Vibration-actuated drop motion on surfaces for batch microfluidic processes. Langmuir. 21 (9), 4240-4248 (2005).
- Darhuber, A. A., Valentino, J. P., Davis, J. M., Troian, S. M., Wagner, S. Microfluidic actuation by modulation of surface stresses. Appl. Phys. Lett. 82 (4), 657-659 (2003).
