איתור של טפסים השתנו ציטוזין שימוש אימונוהיסטוכימיה רגיש
Summary
Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.
Abstract
Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.
Introduction
מתילציה של בסיסי ציטוזין בדנ"א (5mC) מייצגת סימן אפיגנטיים גדול נמצא הגנום חוליות הקשורות תעתיק השתקת 1. 5mC הוא שהוצג ומתוחזק על ידי methyltransferases DNA 2-5, ו הוכח ממלאי תפקידים חשובים מספר תהליכים ביולוגיים כולל החתמה גנומית, איון כרומוזום X, התמיינות, ופיתוח 3, 6. כתוצאה מכך, השיבוש 5mC דפוסי גנומי קשור במספר המחלות 7, 8-11. למרות ההתקדמות בהבנת תפקיד 5mC בפיתוח ומחלות, הוא עדיין אינו ידוע בעיקר איך זה סימן מתבצע סר בפיתוח רקמות בוגרות. מספר מנגנונים האפשריים של demethylation DNA הוצעו לאחרונה כוללים מנגנוני demethylation אקטיביים ופסיביים 12, 13, 14, 15. גילוי של תוצרי חמצון רציפי 5mC בתיווך enzym טרנסלוקציה עשר-אחת עשרes (tet1 / 2/3) כגון 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), ו -5 carboxylcytosine (5caC) ב איקריוטיים DNA 16, 17, 18, 19 הנחיה ספקולציות אם הם עשויים לשמש ביניים של תהליכים demethylation DNA או לפעול יציב סימני אפיגנטיים בזכות עצמם 13. בעוד ההפגנה כי הרכיב של תיקון כריתת בסיס, הטימין-DNA glycosylase (TDG) יכול להיקשר ולהסיר הן 5fC ו 5caC מ- DNA 19, 20 מצביעה על תפקיד עבור נגזרי 5mC השונים בתוך demethylation DNA פעיל. ראיות אחרונות מראה כי 5fC / 5caC יכול לווסת את קצב נקודות processivity RNA II למעורבות הפוטנציאל של סימנים אלה בתקנה תעתיק 29. בשל חשיבות ביולוגית הפוטנציאל הזה של טפסים חמצון של 5mC, מגוון של טכניקות המבוססות ביוכימיות נוגדן הועסק ללימוד הפצה הגנומי שלהם ותוכן העולמי 16, 19-24.
בהתחשב בכך שרוב tהוא החולייתנים איברים המורכבים של סוגי תאים שונים וכי חלוקת בסיסי ציטוזין שונה היא רקמות תאים מסוג מסוים 16-18, 20, 23, 25-27, בקביעת הפריסה המרחבית של נגזרי 5mC חמצון ברקמות שונות הופך חשובת ניסיוני משימה הכרחית חשיפת התפקודים הביולוגיים שלהם. רוב הגישות מבוססות ביוכימיות נוגדן לא מספקים שום מידע מרחבים בדבר חלוקת הצורות השונות של 5mC ברקמות שונות-סוגי תאים. לעומת זאת, טכניקות המבוססות immunochemistry יכולות לספק כלי מהיר להערכת הפריסה המרחבית ולוקליזציה גרעין של 5mC 28 והנגזרים המושחרים שלה 20. כי הוא אמר, השפע נמוך מאוד המדווח של 5fC (20 בכל 10 6 ציטוזין) ו 5caC (3 מכל 10 6 ציטוזין) בגנום העכבר 18 מהווים אתגר משמעותי עבור immunochemistry הסטנדרטי.
כאן,אנו מתארים שיטת חיסון רגישה מאוד מספקות חזק וכן איתור מהיר של טופס חמצון של ציטוזין ברקמת המוח יונק. על ידי שילוב נוגדנים משני מצומדות peroxidase יחד עם צעד הגברת אות, שיטה זו עוקפת את האתגרים של גילוי הסכומים נמוכים מאוד של 5fC ו 5caC. בנוסף, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לשתף לזהות הצורות השונות של ציטוזין עם סמנים ספציפיים שושלת, המשלימה גישות אחרות ביעילות הבהרת התפקודים הביולוגיים של סימני אפיגנטיים אלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות השפע הנמוך דיווח נגזר חמצון 5mC, 5fC ו 5caC ברקמות כמה יציג מגבלות משמעותיות עבור פרוטוקול immunochemistry רגיל, השילוב של נוגדנים משני מצומדות peroxidase אפשר זיהוי של שינויי ציטוזין אלה ברקמות קבועות ותאים (איור 2) . עם זאת, זמן הדגירה האופטימלי עם פתרון tyramide צריך להיות מותאם באופן ניסיוני עבור כל אצווה פרט של tyramide ערכת הגברת אות שבו קשר ליניארי בין עוצמת אות ומשך הגברת אות מבוססת tyramide הוא ציין, לפרטי רא אלמיידה et al. 2012 26 . בנוסף, יחס אות / רקע ניתן לשפר באופן משמעותי על ידי ביצוע השוטף בצנצנת Coplin כדי לאפשר הסרה יעילה של נוגדנים עודפים. לאחר דגירה עם פתרון tyramide, חשוב מיד כדי לעצור את התגובה על ידי שטיפה בתמיסת PBT דמכתים רקע ecrease. זה קריטי לא לאפשר סעיפים לייבש בכל נקודה במהלך ההליך.
היעילות של depurination DNA ניתן לשפר על ידי ביצוע התגובה depurination על 37 מעלות צלזיוס. בעת שימוש 4 N HCl במקום 2 N משפר מכתים הצורות השונות של 5mC באמצעות 4 N HCl עבור depurination DNA לא ירשתי מכתים שיתוף עם DAPI, כפי שהוא מקיים אינטראקציה בלעדי עם DNA גדילים כפול.
למרות טכניקה זו יכולה לספק הערכה וכמותיות חזקה של צורות השונות של בסיסי ציטוזין שם לזיהוי, זה לא יכול לשמש לצורך הערכת הרמות המוחלטות של 5mC או נגזר החמצון שלה. לכן, אנו ממליצים על שימוש משלימים אחרים אבל כמותית מתקרב 16, 19 -24. מאז גילויו של נגזרי חמצון 5mC הגנומים יונקים, מספר גישות פותחו ללמוד התפקידים הביולוגיים שלהם 16, 19-24. אמנם אלה approaצ 'ס יכול להיות בעל ערך בקביעת הרמות המוחלטות של נגזרי חמצון 5mC, הם אינם מספקים מידע לגבי הפריסה המרחבית שלהם 20, 26. יש לנו בהצלחה השתמשו בשיטה המתוארת כאן כדי למפות את ההתפלגות ולוקליזציה המרחבי של נגזרי חמצון 5mC בסוגי תאים שונים של המוח המתפתח ומבוגר 20
מדגים הפריסה המרחבית שלהם 20, טכניקה זו יכולה להיות מכרעת להבנת השלכות הביולוגיות ועל הגורל נגזר חמצון של 5mC בהקשרים ביולוגיים שונים בם נגזרים שונים אלה של 5mC ניתן לאתר כולל בידול, פיתוח ומחלות הסלולר. בנוסף, השיטה אנו מתארים כאן יכולה לתת הערכות כמותית למחצה של נגזרי החמצון של 5mC ברקמות שונות על ידי בחינה של קינטיקה של תגובת peroxidase (אשר עומדת ביחס לעוצמת המכתים) בזמני דגירה שונים עם tyramiדה 26.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Advanced Microscopy Unit (School of Life Sciences, University of Nottingham) and the Histology team of MRC Human Reproductive Sciences Unit (Edinburgh), the Institute of Neuroscience at the ULB and the FNRS for help and support. This work was supported by MRC (MR/L001047/1 to A.D.J.).
Materials
| Coplin jar | Cole-Parmer | UY-48585-30 | Glass made |
| Xylene | Use only in Class II safety cabinet | ||
| Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific | 12821680 | pPH 7.5, filtered before use |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Once made can be stored at -20°C in aliquotes for several months |
| 4% formaldehyde (FA) | Sigma Aldrich | F8775 | Once made can be stored at -20°C in aliquotes for several months |
| Ethanol, anhydrous denatured, histological grade | Sigma Aldrich | 64-17-5 | 95, 75, 50 % in PBS |
| 0.01 % Tween 20 in PBS | Sigma Aldrich | P9416 | PBT |
| 0.5% Triton X-100 in PBS | Sigma Aldrich | X100 | PBX |
| 2 N HCl | Sigma Aldrich | 71826 | caution extremely toxic |
| 100 mM Tris-HCl | Promega | H5121 | PH adjusted to 8.5 |
| hydrophobic barrier pen | Abcam | ab2601 | for immunohistochemistry |
| Slide moisture chamber | Scientific Device Laboratory | 197-BL | |
| anti-5mC mouse antibody | Diagenode | C15200081 | monoclonal primary antibody |
| Anti-5hmC antibody | Active Motif | 39791 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Anti-5caC antibody | Active Motif | 61225 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Peroxidase-conjugated anti-rabbit seconday antibody | Dako | K1497 | |
| 555-congjuated goat anti-mouse antibody | Molecular probes | A-11005 | secondary antibody |
| 10% BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Blocking solution |
| 22x32mm Glass cover slips | BDH | 406/0188/24 | |
| Tyramide Signal Amplification System | Perkin Elmer | NEL741001KT | Other fluorochome conjugated seconday antibodies can be used for co-detection of oxi-5mC |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Colourless nail polish | |||
| chicken polyclonal anti-GFAP polyclonal antibody | Thermo Scientific | PA5-18598 | 1:400 dilution |
| anti-NeuN mouse monoclonal antibody | Merck milipore | MAB377B | 1:400 dilution |
Referências
- Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16, 6-21 (2002).
- Reik, W., Dean, W., Walter, J. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science. 293, 1089-1093 (2001).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet. 33, 245-254 (2003).
- Li, E., Bestor, T. H., Jaenisch, R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell. 69 (6), 915-926 (1992).
- Okano, M., et al. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).
- Cedar, H., Bergman, Y. Programming of DNA methylation patterns. Annu Rev Biochem. 81, 97-117 (2012).
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Chouliaras, L., et al. Consistent decrease in global DNA methylation and hydroxymethylation in the hippocampus of Alzheimer’s disease patients. Neurobiol Aging. 34, 2091-2099 (2013).
- Jowaed, A., et al. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson’s disease patients’ brains. J Neurosci. 30, 6355-6359 (2010).
- Reik, W., et al. Age at onset in Huntington’s disease and methylation at D4S95. J Med Genet. 30, 185-188 (1993).
- Landgrave-Gòmez, J., Mercado-Gòmez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 27, 9-58 (2015).
- Seisenberger, S., Peat, J. R., Hore, T. A., Santos, F., Dean, W., Reik, W. Reprogramming DNA methylation in the mammalian life cycle: building and breaking epigenetic barriers. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 368 (1609), (2013).
- Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5- methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25, 2436-2452 (2011).
- Oswald, J., et al. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote. Curr Biol. 10 (8), 475-478 (2000).
- Ooi, S. K., Bestor, T. H. The colorful history of active DNA demethylation. Cell. 133 (7), 1145-1148 (2008).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, 1300-1303 (2011).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
- Wheldon, L. M., et al. Transient accumulation of 5-carboxylcytosine indicates involvement of active demethylation in lineage specification of neural stem cells. Cell Rep. 7, 1353-1361 (2014).
- Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149, 1368-1380 (2012).
- Lu, X., et al. Chemical modification assisted bisulfite sequencing (CAB-Seq) for 5-carboxylcytosine detection in DNA. J Am Chem Soc. 26, 9315-9317 (2013).
- Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
- Szwagierczak, A., et al. Sensitive enzymatic quantifi cation of 5- hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, e181 (2010).
- Ruzov, A., et al. Lineage-specific distribution of high levels of genomic 5-hydroxymethylcytosine in mammalian development. Cell Res. 21, 1332-1334 (2011).
- Almeida, R. D., et al. Semi-quantitative immunohistochemical detection of 5-hydroxymethyl-cytosine reveals conservation of its tissue distribution between amphibians and mammals. Epigenetics. 7, 137-140 (2012).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905 (2013).
- Santos, F., Dean, W. Chapter 11, Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos. Nuclear reprogramming methods and Protocols. , 129-138 (2006).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523, 621-625 (2015).
