高感度免疫組織化学を使用してシトシンの修飾された形態の検出

全ての動物-関与手順はノッティンガムの倫理審査委員会の大学に従って行われました。 1.免疫染色のための適切な組織標本を選択します以前25記載されているように、野生型CD1マウス胚および成体の脳組織のパラフィン包埋切片を生成します。方法25の免疫染色のために4％ホルムアルデヒド（FA）または4％パラホルムアルデヒド（PFA）のいずれかで固定した脳組織切片を使用します。 注：パラフィン包埋組織切片の使用は、抗体標識の前に脱脂が必要です。 2を用いた治療ので – DNA変性のためのプロトコルで用いられる4 M塩酸（HCl）、最も抗原回復戦略とは互換性がありません、我々は、タンパク質と5MC酸化誘導体の同時検出のために冷凍のかミクロトームセクションのいずれかを使用することをお勧めしますマーカー。 2.脱ロウパラフィン包埋組織切片< / P> 実行中のクラスII安全キャビネット内で、室温で、キシレンで満たされたコプリンジャー中で10分間2回ずつパラフィン包埋組織切片を洗浄します。 注：これは、不完全なパラフィン除去が一貫性のない染色パターンにつながることができますように新鮮なキシレンを使用することが重要です。 脱ワックス後、急速に95、75、そして室温で10分間、50％エタノール中で連続して洗浄す​​ることにより組織切片を再水和します。 3.固定および冷凍のとミクロトーム切片の透過処理 RTで15分間、氷冷4％PFAまたは4％FAのいずれかでそれらを置くことによって再水和した組織切片を修正しました。 室温で5分間、PBS中のセクション（リン酸緩衝生理食塩水）を洗浄することにより、過剰な固定液を除去します。 RTで30分間PBXが充填されたコプリンジャー（PBS中0.5％トリトンX-100）中に配置することによって、組織切片を透過。 PBT（PBS中0.01％のTween 20）でまもなくセクションを洗浄することにより、過剰なPBXを削除してください。 jove_title "> 4。オキシナイト5MC誘導体の免疫染色 DNAの脱プリンをRTで60分間、2 N HCl中で透過処理セクションを配置します。 注：より効率的なDNA変性へのHCl（ 例えば、4 N）の鉛のより高い濃度が、これらはDAPIでオキシ-MCSの同時検出のために互換性がありません。 塩酸を中和するために、室温で30分間、10mMトリス – 塩酸（pH8.5）中のセクションを配置します。また、PBS中で5分ごとにセクションを3回洗浄します。室温で5分間PBTのセクションをインキュベートします。 慎重に組織切片を静かにスライドを振盪することにより、任意のステップで完全に乾燥させることなく、組織切片を周囲から液体を除去します。セクションに触れずにセクションを取り囲むように、疎水性バリアペンを使用してください。 注：疎水性バリアペンは、組織を染色するために必要な抗体の量を減少させ、複数のセクションがdifferenで染色することができるようにすることができます同じスライド上のトン抗体。 湿潤チャンバー中、室温で1時間ブロッキング溶液（PBS中10％のウシ血清アルブミン）100μl中のセクションをインキュベートします。 注：このステップをスキップする修正されたシトシン塩基を染色の効率に影響を及ぼさないであろう。 マウスモノクローナル抗5hmC 5,000希釈液と1：湿潤チャンバー内で室温で1時間、ブロッキング溶液中で、ウサギポリクローナル抗5caC一次抗体を1000倍希釈液100μlで組織切片をインキュベートします。必要に応じて別の方法として、4℃で一晩のインキュベーションを行います。 注：一次抗体なしで処理セクションは、染色手順のためのような適切な陰性対照を提供することができます。 5caC、5FCと5hmC 20に富むポスト交尾マウス胚性脳切片を陽性対照として使用することができます12.5日。 コップで5分間、PBTで満たされたコプリンジャーに各3回セクションを洗浄することにより過剰な抗体を除去RTで林の瓶。 注：洗浄溶液の体積を増加させるバックグラウンド染色を減少させることができます。 過剰PBTを削除して、必要に応じて、PBTは、疎水性の障壁を弱めることができ、界面活性剤が含まれているとして、疎水性のバリアペンで再びセクションを取り囲みます。 ヤギ抗ウサギHRP結合抗体の400希釈および1：ブロッキング溶液中のロバ抗マウス555結合抗体の400倍希釈してください。 湿潤チャンバー中、室温で1時間、 ステップ4.9からの二次抗体混合物100μl中の組織切片をインキュベートします。 室温で5分間ずつPBT 3回満たしコプリンジャーに組織切片を洗浄してください。 室温で2分間、チラミドシグナル増幅バッファ内のチラミドの200希釈：1100μlの組織切片を置きます。 すぐに、PBTで5分間スライドをそれぞれ3回洗浄することによって過剰チラミド溶液を除去。 気をつけyが過剰PBTを削除し、 すぐに （材料リストを参照してください）封入剤のドロップを持つセクションをカバーしています。 静かに組織切片上のカバースリップを置き、 すぐにマニキュアでカバーガラスをシール。 顕微鏡検査の前に、いくつかの時間のために4℃で組織切片を保管してください。 （ – 40X倍率10）405、488および/または555 nmで蛍光顕微鏡下で調べます。