医療機器のための細菌撥ポリマーのハイスループット同定

アガロースコーティングしたスライドの調製注：ポリマーマイクロアレイを作製する前に、アミノアルキルシラン被覆ガラススライドを、非特異的バックグラウンド結合を最小化し、細菌6に結合するか、反発するポリマーの評価を可能にするためにアガロースIBで被覆されています。シランコーティングは、スライドにアガロースの結合を促進します。 2％を構成している250mlのボトルで蒸留水にアガロースIBの（w / v）溶液。 溶解するまで緩やかに瓶をキャップした後、30秒周期で、マイクロ波オーブン中で懸濁液を加熱します。キャップがしっかりと任意の潜在的な圧力ビルドアップを避けるために閉じられていないことを確認してください。定期的にボトルを外し、静かに渦巻きます。 固体が溶解し、溶液が透明であることを確認してください。溶液を維持するために65℃の水浴中でこのアガロースを100mLのビーカーに溶液、及び場所を注ぎます。 、アガロース溶液にシラン被覆スライドを浸し均一なコーティングを確実にする、とのwiティッシュペーパーとスライドの裏側をPE。 24時間の最小値のためにコーティングされた側を上にして、ほこりのない環境で（ 例えば 、食器棚やヒュームフード内部の）スライドを、乾燥させます。 目視で均一なコーティングを確認してください。コーティングは、簡単にスライド上に呼吸することによって評価することができる – 結露がコーティングされていない領域上に形成することになります。完全に均一にコーティングされたスライドだけは、マイクロアレイ印刷に使用する必要があります。 印刷用ポリマー溶液の調製ガラスバイアル中のN -methylpyrrolidone（NMP）にポリアクリレート、ポリアクリルアミドおよびポリウレタンからなる予備成形されたポリマーの選択の溶液（w / vの1％）を準備します。 （各ポリマーを1ml調製）。ポリマーが完全に溶解するまでボルテックス。ポリマーの合成は、他の場所6に記載されています。 マイクロピペットを用い、25μlのポリマー溶液を384マイクロウェルプレートの各ウェルに充填する、交差するコンタが存在しないことを保証mination、各ウェルは、独特のポリマーが含まれています。少なくとも2つのウェルで陰性コントロールとしてNMPを使用してください。ウェルプレートテンプレートやスプレッドシートファイル上の各ウェル中のポリマー溶液のアイデンティティを記録します。 3.印刷ポリマーマイクロアレイ連絡先のプリンタを使用して注：マイクロアレイの印刷は、コンタクトプリンタを用いて行きました。高分子マイクロアレイ印刷に関する具体的な手順を以下に示します。プリンタや安全上の推奨事項を使用して、上の一般的なガイドラインについては、製造元からのマニュアルに従ってください。我々は、コンタクトプリンタを使用しているが、適切な手動スタンピング装置を使用することもできます。 プリンタのマニュアルに助言したように、（8行4列として配置された）32ピンmicroarrayingヘッドを使用して、四連で384液体（ポリマー溶液またはNMP）の印刷を可能にするルーチンを（ステップ3.3を参照）を作成します。 48行と32列として配置された1536スポットを印刷します。プログラム12のセクションに印刷するルーチン秒、 すなわち 、一度に32のソリューション、プリンタはピンの洗浄を可能にするために、各セクションを印刷した後に停止することができるように。 印刷ルーチンを作成するには： ソフトウェアを開き、利用可能なオプションから「新規のルーチンを作成]を選択します。実験の入力内容に「説明」タブを選択します。 「ヘッド」タブを選択し、'32 -pin microarrayingヘッド 'を選択します。 [ソース]タブを選択し、プレートホルダー（ソースプレートホルダー（1×5））、プレートタイプ（プレート384のx 6000）を選択し、総プレート（1）とソース順（列ごと）。 タブ「スライドのデザイン」で、「3×1 ''のスライドを選択します 'とによって並べ選ぶ「フィールド数」。そして、「整列パターン」を選択します。入力「レイアウト」と「行数」として「パターン寸法 'と'スポットビュー」（6）、「列数」（8）、「行ピッチ」（750）と「列ピッチ」（560）。モミを印刷する1セクションを選択します。トン。 「スライドのレイアウト]タブ入力での印刷に使用するスライドの数。入力に[印刷]タブを選択して印刷パラメータ（インキングあたりスタンプの数：1、スポット当たりスタンプの数：5、タイムスタンプ：200ミリ秒、時間をインキング：100ミリ秒）。 注：ルーチンは、現在（8行4列として配置）32ピンmicroarrayingヘッドを用いて、四重で384液体（ポリマー溶液またはNMP）を印刷するために作成されます。合計では、ルーチンは750ミクロンと560ミクロンの列ピッチの行ピッチで48行と32列として配置された1536スポットを印刷する必要があります。 プラットフォーム上でのアガロース被覆スライドを配置した位置にスライドを保持するために良好な真空シールを確保します。 すべてのピンが同じ高さになるようにプリントヘッドを調整します。手動でスライドガラス上に頭を下げ、ピンが同時に上がることを確認することにより、これを確認してください。高さと矛盾がある場合は、sleevを使用して調整します上下にピン上の電子。 すなわち 、正しい方向にプレートホルダーにウェルプレートを置き、よくA1は、ホルダーの右上にあるとウェルプレートがしっかりと固定されていることを確認します。 高さ調整を使用して、プレートホルダーの高さは、ポリマー溶液を選ぶとき、ピンがウェルの底に触れていないようなものであることを確認してください。 注：これは、均一なポリマースポッティングのために重要であり、またそれによって交差汚染を引き起こし、隣接するウェルにポリマー溶液のこぼれを回避します。 [スタート]タブを選択し、「標準」としての「ファイル名を指定して実行タイプ]を選択します。プロンプトが表示されたら、「ファイル名を指定して実行」をクリックし、そのスライド、ウェルプレートなどを確認し、位置にあります。 一度に1セクションを印刷（一度に32溶液; 12セクション）、セクション間のピンの洗浄を可能にします。ピンが完全に乾燥していることを確認するために乾いたティッシュペーパーに続いてアセトンに浸したペーパータオル、で十分にピンを清掃してください。 マイクロアレイの印刷が完了すると、スライドホルダーに置き、オーブンポリマースポットにNMPを除去するために45℃に設定し、真空中で一晩、それらを乾燥させます。 30分間のUV光で滅菌後、マイクロアレイは、細菌の接種の準備ができています。 （セクション5で説明したように）細菌にスライドを接種する前に、バックグラウンド蛍光の測定を行います。この測定は、細菌結合の計算に使用します。 細菌を有するポリマーマイクロアレイの4接種注：良い無菌法を確認してください。文化のすべての取扱いは、無菌環境で実行する必要があります。ブンゼンバーナーを使用して、または流フードのいずれかで。培養物は、それぞれの種の要件に適合酸素利用、増殖培地、および温度で成長されるべきです。 5ミリリットルルリア-ベルターニブロス（LB接種して一晩培養を準備します：10グラムL -1バクト-トリプトン、5グラムのL -1のNaCl、および10グラムのLを<SUP> -1プレートからコロニーと酵母エキス）。 200 rpmで振とうしながら、37℃で一晩インキュベートします。 グリセロール（10％濃度の全体的な）の添加により一晩培養のフリーザーストックを調製し、-80℃での在庫を保管してください。 解凍した細菌株のサンプルから細胞数を決定するために、各ストックの連続希釈を行い、固体培地上で一晩細菌を成長させます。株の細胞数の正確な決意は、それぞれの種6の適切な接種を保証します。 マイクロアレイのための接種物を準備します。単一の種培養物を、上記のように増殖させ、マイクロアレイに直接適用されます。 BacMix-1は、 肺炎桿菌 （ 肺炎桿菌 ）、 スタフィロコッカス・サプロフィチカス （S.の腐性 ）、および黄色ブドウ球菌 （ 黄色ブドウ球菌 ）の細菌混合物である。BacMix-2は、 ストレプトコッカス・ミュータンス（S.ミュータンス）からなる細菌の混合物でありますS.球菌 </eM>、K.肺炎連鎖球菌および腸球菌 （E.フェカリス ）。 いずれかの混合培養物を生成するために、等容量（3ミリリットルずつ）でovernightsをミックスし、新鮮なLBで（約50 mlの最終体積に）4倍に希釈。 長方形の4ウェルプレートにUV殺菌高分子マイクロアレイを置き、5日間穏やかに撹拌（30 rpm）しながら37℃で混合細菌培養液の6ミリリットルでそれらをインキュベートします。 インキュベーション後、穏やかにリン酸緩衝食塩水で二回マイクロアレイを洗浄（PBS：137mMの塩化ナトリウム、2.7mMの塩化カリウム、10mMののNa 2 HPO 4、1.8mMのKH 2 PO 4）及び1μgのmlの溶液-1 4とインキュベート30分間PBSで '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）染色。 PBSで1回を変え、PBSで覆い、穏やかに旋回することにより、新鮮なウェルプレートに染色されたマイクロアレイスライドを洗浄します。空気の流れの下で乾燥しました。接着剤で所定の位置にマイクロアレイスライドとシールにガラスカバースリップを適用します。 DいったんRY、70％（v / v）エタノールで外面を滅菌します。 安全に封じ込めレベルに応じた培養物を処分。 5.マイクロアレイイメージングおよび分析各ポリマー明視野でのスポットとDAPI（例/エム= 358 nmの/ 361 nm）のチャネルのための単一の画像をキャプチャします。 20Xの対物レンズを装着した蛍光顕微鏡または（画像取得ソフトウェアによって制御XYZステージ付き）自動化された蛍光顕微鏡を使用して手動でこれを実行します。 注：ソフトウェアを動作させると、明視野およびDAPIチャネルを使用して画像を取得するために顕微鏡を調整するための取扱説明書18を参照してください。すべてのマイクロアレイのための画像キャプチャ用のゲインおよび露光時間が同じであることを確認してください。 スポット領域を選択し、画像処理ソフトウェアを用いて蛍光を定量することによってDAPIチャネルにおける各スポットの平均蛍光強度を得ます。 各スポットのバックグラウンド蛍光のため、obta複製マイクロアレイ上のポリマースポットの画像にのみ細菌なしでメディアとインキュベートしました。細菌からの蛍光を得るために、スポットの強度からバックグラウンド蛍光を差し引きます。 種々のポリマー6の結合細菌を比較するために使用される各ポリマーを表す、4つのスポットからの平均正規化した値を計算します。 「ヒット」ポリマー6として少なくとも細菌の結合（最低蛍光）を示すポリマーを特定します。 「ヒット」の検証のためのカバースリップの6コーティングポリマーでコートカバースリップへ： 「ヒット」ポリマーの溶液を調製する（〜2％w / v）のテトラヒドロフラン（THF）、または他の適切な溶媒。 10秒間2000rpmでスピンコーターを用いてポリマー溶液との適切なサイズのスピンコート円形ガラスカバースリップ。 注：スピンコーターの非存在下では、カバーガラスまたは他の材料をディップコーティングすることができる、スピンもののコーティングは、より均一な表面を生成します。 一晩40℃の対流式オーブンでコーティングされたカバースリップを乾燥前の細菌を接種し、30分間UV光を用いて滅菌します。 陰性対照のためのアガロースでコートカバースリップへ： きれいなカバーガラス10分間のプラズマ処理によって、又は4時間、1MのNaOH中に浸漬どちら。 一晩1％（3-アミノプロピル）トリエトキシシランを含むアセトニトリルでカバースリップを浸します。アセトンで3回カバースリップをきれいにし、1時間オーブン（100℃）に入れました。 ディップコート、60℃の水浴中で維持し、1％アガロース水溶液で乾燥したカバースリップ。 24時間無塵環境条件に平らな表面上のアガロースコーティングしたカバースリップを置き、前に細菌を接種し、30分間UV光を用いて滅菌します。 7.添付ファイルおよび走査型電子顕微鏡を使用したカバースリップの分析（SEM） 後の30分間UV光で滅菌、標準的な12ウェルプレート又は（カバーガラスの大きさに応じて）24ウェルプレート中のカバースリップ（ポリマー/アガロース被覆または非被覆ガラス）を配置し、セクションに記載のように細菌とインキュベート4。 細菌と共にインキュベートした後、2時間、0.1 Mカコジル酸緩衝液（pH7.4）中の2.5％（w / v）のグルタルアルデヒドで固定し、次いで0.1 Mカコジル酸緩衝液（pH7.4）で2回コーティングされていないおよびコーティングされたカバースリップを洗浄し。 1％の接尾サンプルを室温で1時間（w / v）の四酸化オスミウム及び30分ごとに（v / v）の50、70、90および100％シーケンシャルエタノール洗浄と脱水。 標準プロトコル19に係るCO 2でドライサンプル。乾燥時間は、試料の性質に依存します。 0.75トルで30 mAから真空に電流がスパッターコーターを用い、金/パラジウム合金で被覆サンプル（60/40％）。標準的なプロトコル20に従って電子顕微鏡で調べます。 注：ENSそれは非常に有毒であるとして、四酸化オスミウムの貯蔵、取扱い及び処分から生じるリスクを管理するURE十分な安全上の注意事項。 視覚的にコーティングされていないカバースリップの画像を比較し、アガロースまたは「ヒット」ポリマーでコーティングされたものは、ポリマーの細菌の結合/反発する能力を確認します。 注：添付ファイルの抵抗が存在する細胞の減少として容易に識別できるものとします。 最も有望な医療デバイス（ 例えば 、中心静脈カテーテル）6を有するコーティング研究のための非結合ポリマーを「ヒット」を選択します。 カテーテルを被覆するための溶媒の選択8. カテーテルの留置部分との互換性だけでなく、「ヒット」ポリマーを溶解する能力について、様々な溶媒を評価します。キャスキッドソン-1の部分をカットし、円筒形の片に長さ5mm、およびデジタルノギスで測定します。 このようなアセトアミドなどの種々の溶媒を評価しますIC酸、アンモニア、アセトン、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（THF）、ジメチルホルムアミド（DMF）、N-メチル-2-ピロリドン（NMP）、エタノール、メタノール、エチレングリコール、トルエン、キシレン。 12時間溶媒中でのカテーテル片を浸し、カテーテルおよび溶剤の明確化の整合性を視覚的に評価します。 注：カテーテルは膨潤または崩壊または濁った溶剤に繋がりない溶媒を選択してください。溶剤は、「ヒット」のポリマーを溶解しなければなりません。 共焦点顕微鏡によるカテーテル上の細菌付着の9分析 2.5％調製（w / v）のアセトン、又は他の適切な溶媒中のポリマー溶液を小さなガラスバイアル（5ml）中にセクション8に置き、5mmのカテーテルの部分を決定し、2分間ポリマー溶液1mlでそれらを浸すように。過剰のポリマー溶液を除去し、40℃の真空オーブンで一晩カテーテル片を乾燥させます。 解凍した細菌の目を混合して接種材料を準備しますocksを50ml LB 6にそれぞれの種の約10 6個の細胞を得ました。 30分間UV光でコーティングし、コーティングされていないカテーテルの部分を殺菌し、穏やかに撹拌6で、3日間37℃で、24ウェルプレート中のLBを接種1mlでインキュベートします。 インキュベーション後、PBS（2×2 ml）でカテーテルを洗浄し、30分間PBS中の10％のパラホルムアルデヒドで細菌を固定し、そしてPBS（1ml）で洗浄します。 （1μgのmlの- 1）DAPIを有するカテーテルピース上の細菌を染色20分間、および（1ミリリットル）PBSで洗浄します。 – Airy1、画像サイズ – 1024×1024ピクセル、ボクセル幅 – 105.2 nmで、0.5μmの間隔Z-スタック405nmの青色ダイオードレーザー、検出範囲414 nmの502に、ピンホール：次の設定を使用して、カテーテル片の共焦点画像を取得、倍率 – 40X 1.25。 カテーテルの100ミクロンの長さにわたってZ-スタッキング50画像によって共焦点イメージングを完了します。 SUITABを使用して画像を分析ル解析ソフトウェア：カテーテル片の単一のイメージを作成するために、被写界深度を拡張する機能を使用して、Z平面内でZ積層画像を平ら。 注：この画像はその後、「バックグラウンドを平ら」機能を使用してバックグラウンド補正した後、細菌によってカバーされるカテーテルの面積を得るために分析されるべきです。 SEMによるカテーテル上の細菌付着の10解析アセトン（w / v）の10％のポリマー溶液を調製します。 それを保持し、約30秒間ポリマー溶液中にピースを浸漬するために、カテーテルの切断片の中央部に（200μlのマイクロピペット用）ピペットチップを押します。 30分間周囲条件でコーティングされた部分を乾燥させます。周囲条件でのポリマー溶液と一晩乾燥に再び浸漬することにより、第2のコーティングを適用します。 細菌によるUV処理及びインキュベーション後（n = 3）をPBS（2×1 ml）及び1を含む48ウェルプレートに移すピースを洗浄します30分間、PBS中の0％ホルムアルデヒド。 PBS（1ミリリットル）、室温で一晩乾燥して作品を洗って、固定した後、スパッタコーターを使用して、導電性カーボンディスクとスタブ、および金コートにマウント（ステップ7.5を参照してください）。 走査型電子顕微鏡6を用いて画像を取得します。