İnsan Melanom tümör-süzücü lemfositler ile ilgili uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi
Summary
The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.
Abstract
Ex vivo Evlatlık transferi metastatik melanom hastalarında önemli alt gruplarında dayanıklı ve tam yanıtlara aracılık edebilir otolog tümör infiltre lenfositleri (TILS) genişletti. Bu yaklaşımın en önemli engeller telomerik kaynaklanan transfer T hücrelerinin, azalmış canlılığı, ve TILS sınırlı sayıda hastadan elde edilmiştir. Bununla birlikte, bu daha az farklılaşmış T hücrelerinin çok sayıda üretilmesi problemlidir, uzun telomerlerin ile daha az farklılaşmış T hücreleri adoptif T hücresi terapisi için ideal bir T hücresi alt kümesi olabilir. adoptif T hücresi tedavisinin bu sınırlama teorik kullanılarak uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) aşılabilir, kendi kendini yenileme pluripotense, uzamış telomer korumak ve immünoterapi için otolog T hücrelerinin sınırsız bir kaynak sağlar. Burada, TILS içine yeniden programlama faktörleri iletimi için Sendai virüsü vektörleri kullanılarak iPSCs üretmek için bir protokol mevcut. Bu protokol oluşturmakTamamen yeniden programlanması, vektör ücretsiz klonlar s. Bu TIL türetilmiş iPSCs adoptif T hücre tedavisi için daha az farklılaşmış hastaya ve tümör-spesifik T hücrelerini elde etmek mümkün olabilir.
Introduction
Transkripsiyon faktörleri, tanımlanmış bir dizi aşırı ekspresyonu ile uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) üretilmesini sağlar Hücresel yeniden programlama teknolojisi hücre bazlı terapiler 1,2 alanında büyük ümit vaat etmektedir. Bu iPSCs transkripsiyonel ve epigenetik özelliklerini sergilemek ve benzer embriyonik kök hücreleri (EKH) 3-5 kendini yenileme ve pluripotensin kapasitesine sahip. Geçtiğimiz on yıl içinde yeniden programlama teknolojisi yapılan kayda değer ilerleme bize bile böyle T hücreleri 6-8 olarak terminal olarak farklılaşmış hücreler, insan iPSCs oluşturmak için izin verdi. T hücresi-kaynaklı iPSCs (TiPSCs) TiPSCs 9-11 antijen-spesifik T hücrelerinin yenilenmesini sağlayan özgün T hücreleri gibi T hücresi reseptörü (TCR) zincir genlerinin aynı yeniden düzenlenmiş konfigürasyonunu muhafaza eder.
melanom süzücü limfositlerin yaklaşık% 80 (TILS), bir hastanın tümör spesifik tümör bağlantılı antijenleri tanıyan eldeND, orijinal Kanser hücreleri 12 karşı sitotoksisite korumak. Özellikle, TILS ile programlanmış hücre ölümü proteini-1 (PD-1) ifadesi mutasyona uğramış neoantijen özgü CD8 + 13 lenfositlerin dahil olmak üzere, otolog tümör reaktif repertuarı tespit bulunmuştur. Hazırlayıcı lymphodepleting rejimleri ve interlökin-2 (IL-2), sistemik tatbikat ile kombinasyon halinde, ex-vivo genişletilmiş otolog TILS adoptif nakli hastalarında 14 alt-metastatik melanom büyük gerilemesine neden olabilir. klinik öncesi modellerde ve hastalarda cesaret verici sonuçlar rağmen, yoksul infüzyon T hücrelerinin hayatta kalma ve bağışıklık baskılayıcı yolların varlığı evlatlık T hücre tedavisi tam potansiyelini tehlikeye görünmektedir. Mevcut klinik protokoller sayıda elde edilmesi için otolog T hücrelerinin geniş bir ex vivo işleme gerektirir. Bu sonuç, zayıf yaşam süresine sahiptir terminal olarak farklılaşmış T hücreleri, indirgenmiş Proteinlerin üretimi ile sonuçlanıriferative kapasitesi ve PD-1 15 yüksek düzeyde.
adoptif T hücresi tedavisinin Bu sınırlama teorik immünoterapi için otolog T hücrelerinin sınırsız kaynağı sağlayabilir iPSCs kullanılarak aşılabilir. Son zamanlarda Sendai virüsü (sev) dört transkripsiyon faktörlerinin aracılı transdüksiyonu, OKT3 / 4, Sox2 Klf4 ve c-myc 16 PD-1 yüksek seviyede ifade eden melanoma TILS yeniden programlamayı bildirmiştir. retrovirüs vektörleri yeniden programlama genleri ifade etmek konak kromozom entegrasyonu gerektiren ederken, SeV vektörleri olmayan entegre ve sonunda sitoplazmaya çıkarılmıştır. Verimliliği yeniden programlanması lentivirüs veya retrovirüs vektörleri 6-8 ile karşılaştırıldığında SeV sistemi ile çok daha yüksektir. Lentivirüs veya retrovirüs vektörleri tarafından üretilen bazı iPSC klonlar nonlymphoid soy 6-8 arasında olabilir iken Ayrıca, SeV özel olarak ise, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) T hücreleri yeniden programlamak için. Burada, detayprosedürler insan melanoma TILS izolasyonu ve aktivasyonu için bir SeV yeniden programlama sistemi kullanılarak TIL türetilmiş iPSCs üretimi için uyguladı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, OCT3 / 4, Sox2 Klf4 ve c-myc, dört transkripsiyon SeV aracılı transdüksiyonu ile iPSCs için melanom TILS yeniden programlanması için bir protokol faktörleri gösterdi. Bu yaklaşım, T hücrelerini yeniden programlamak için SeV sistemi kullanılarak olmayan bir entegre yöntem 7 olanaklar sunar.
Bir önceki çalışma SeV yeniden programlama sistemi fibroblastlar değil, aynı zamanda periferik kan T hücrelerini 7,17 sadece yeniden programlamak yüksek…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ms. Deborah Postiff and Ms. Jackline Barikdar in the Tissue Procurement Core and Dr. Cindy DeLong in the Pluripotent Stem Cell Core Laboratory at the University of Michigan for her technical assistance. This study was supported by University of Michigan startup funding and grants from the Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance, and NIH/NCI (1K08CA197966-01) to F. Ito.
Materials
| gentle MACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentle MACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| RPMI 1640 | Life technologies | 11875-093 | |
| Falcon 70 um Cell Strainer | BD | 352350 | |
| BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes | BD | 352070 | |
| IMDM | Life technologies | 12440053 | |
| human AB serum | Life technologies | 34005100 | |
| L-glutamine (200mM) | Life technologies | 25030-081 | |
| 2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) | Life technologies | 21985-023 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| gentamicin | Life technologies | 15750-060 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-02 | |
| D-PBS (-) | Life technologies | 14040-133 | |
| recombinant human (rh) IL-2 | Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc. | ||
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 | BD | 555329 | |
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 | BD | 555725 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| HEPES | Life technologies | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Cumberland Pharmaceuticals Inc. | NDC 66220-207-30 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (6-well) | Corning | 353046 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (24-well) | Corning | 353047 | |
| Sendai virus vector | DNAVEC | ||
| SNL feeder cells | Cell Biolabs, Inc | CBA-316 | |
| mitomycin C | SIGMA | M4287 | soluble in water (0.5 mg/ml) |
| gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Primate ES Cell Medium | Reprocell | RCHEMD001 | warm in 37 ℃ water bath before use |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life technologies | PHG0264 | |
| ReproStem | Reprocell | RCHEMD005 | warm in 37 ℃ water bath before use |
Referências
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Maherali, N., et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
- Wakao, H., et al. Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).
- Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients. J Immunother. 26, 332-342 (2003).
- Gros, A., et al. PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors. J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).
- Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).
- Saito, H., et al. Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 11 (2016).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).
- Fujie, Y., et al. New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood. PLoS One. 9, e113052 (2014).
