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Extração e Análise de Microbial Phospholipid Fatty Acids em solos

Published: August 26, 2016
doi:
10.3791/54360
, , , , ,
1Department of Renewable Resources,University of Alberta, 2Department of Science, Augustana Faculty,University of Alberta, 3Laboratoire Génie Civil et géo-Environnement,Université de Lille, 4Department of Earth and Environmental Sciences,Mount Royal University, 5Forest Ecology & Production, Great Lakes Forestry Centre,Natural Resources Canada

Summary

ácidos graxos de fosfolipídios fornecer informações sobre a estrutura das comunidades microbianas do solo. Apresenta-se métodos para a extracção de amostras de solo com uma mistura de fase única de clorofórmio, fraccionamento de lípidos extraídos, utilizando colunas de extracção em fase sólida, e a metanólise para produzir ésteres de metilo de ácidos gordos, que são analisadas por cromatografia de gás capilar.

Abstract

ácidos graxos de fosfolipídios (PLFAs) são os principais componentes das membranas celulares microbianas. A análise dos PLFAs extraído de solos podem fornecer informações sobre a estrutura geral das comunidades microbianas terrestres. PLFA profiling tem sido amplamente utilizada em uma variedade de ecossistemas como um índice de biológicos de qualidade do solo em geral, e como um indicador quantitativo da resposta do solo à terra gestão e outras agressões ambientais.

O método padrão aqui apresentado descreve quatro etapas principais: 1. a respectiva extracção de amostras de solo com uma mistura de clorofórmio monofásica, 2. fracionamento usando colunas de extração em fase sólida para isolar fosfolipídios de outros lípidos extraídos, 3. metanólise de fosfolipídios para produzir ácidos graxos ésteres metílicos (FAMEs), e 4. análise FAME por cromatografia gasosa capilar usando um detector de ionização de chama (GC-FID). Dois padrões são utilizados, incluindo 1,2-dinonadecanoyl–sn-glicero-3-fosfocolina (PC (19:0/19: 0)) para avaliar a recuperação global do método de extracção, e decanoato de metilo (MEC10: 0) como padrão interno (ISTD) para a análise de GC.

Introduction

Ácidos graxos de fosfolipídios (PLFAs) fazem parte das membranas celulares microbianos dos Domínios Bacteria e Eukarya. Microrganismos produzem PLFAs de diferentes comprimentos de cadeia e a composição como um meio para manter a integridade da membrana celular e a função celular em resposta às condições ambientais imediatos; portanto, pode-se argumentar que as comunidades microbianas que são separados geograficamente, mas são submetidos a condições semelhantes de solo irá expressar PLFAs semelhantes. PLFAs solo com um comprimento de cadeia entre 14 e 20 átomos de C são geralmente considerados como sendo de origem predominantemente bactérias e fungos 1. Nas culturas mistas, PLFA análise não pode ser utilizado para identificar espécies microbianas individuais, mas pode fornecer uma impressão digital global das comunidades microbianas encontrados em solos. Além disso, uma vez que são rapidamente degradados PLFAs sobre a morte celular, que pode ser considerado como representante da comunidade microbiana do solo viável 2. este technique tem sido amplamente utilizada para caracterizar a composição estrutural das comunidades microbianas encontradas em uma ampla gama de ambientes, que vão desde florestas 3-4 para 5-6 pradarias e campos agrícolas 7. Ele tem sido aplicado com sucesso na caracterização resposta solo para pousar mudanças de gestão, incluindo a floresta clara de corte 8, calagem 9, recuperação de 10-12, bem como distúrbios, tais como incêndio 13, a contaminação por metais 14 e hidrocarbonetos 15, e insetos surto 16 .

O método analítico PLFA contemporâneo evoluiu durante as últimas seis décadas através de vários avanços importantes por uma série de grupos de pesquisa. Em 1958, uma melhoria significativa surgiu de ajustar o clorofórmio: metanol: água na proporção da solução de extracção para deslocar a mistura de um monofásico a um sistema bifásico 17. Essa extração de lipídios otimizada ea pro isolamento revistoprotocolo tornou-se conhecido como o método de Bligh e Dyer. O protocolo foi adotado por muitos laboratórios ao longo das próximas décadas e, durante este tempo, branco e colegas contribuíram avanços significativos para o método; por exemplo, eles melhoraram o passo de extracção através da troca de um tampão de fosfato para a água, e optimizado a análise por cromatografia gasosa (GC) por meio da identificação do pico melhorada e a quantificação. Talvez de maior importância para a ciência do solo, que determinado em 1979 que os lípidos extraídos poderia ser utilizada como um índice da estrutura microbiana quando examinados a biomassa microbiana de sedimentos marinhos 18.

Outros desenvolvimentos ocorridos na década de 1980 como o método tornou-se mais amplamente utilizada em ciência do solo, especificamente em relação à rizosfera 19. Nessa altura, o método incluído nonadecanoato metilo (MeC19: 0) como padrão interno e 19 a utilização de uma coluna de ácido silícico para fraccionamento lípido 21 </ Sup>. Seguindo seu trabalho com Branco 19,21, Tunlid regressou à Suécia e começou a investigação em colaboração com o Baath e Frostegård. Ao examinar a eficiência dos diferentes tampões de extracção para um conjunto de solos variando em teor de matéria orgânica, o grupo mostrou que o tampão citrato aumentou a quantidade de fosfato de lípido extraído em comparação com o tampão fosfato 22. Além disso, a sua publicação 1993 23 sobre a influência da calagem nas comunidades microbianas do solo passou a se tornar um clássico citação no solo Biologia e Bioquímica 24. Os pesquisadores utilizaram análise de componentes principais no seu processamento de dados. análise PLFA, como o método é chamado agora, gera grandes conjuntos de dados ea utilização de procedimentos estatísticos multivariados para processar esses dados foi altamente inovador para a época e inspiração para muitos. Concomitante ao trabalho que está sendo feito na Suécia, modificações no procedimento PLFA estavam sendo investigados emAlemanha por Zelles e colegas 25-26. A sua versão do procedimento era notável pelo uso de uma coluna de extracção em fase sólida (SPE), em vez da coluna de ácido silícico, mas, em geral, foi mais laboratório intensiva.

O artigo de Frostegård 23, juntamente com a metodologia detalhada por White & Ringelberg 27, desde a fundação para uma explosão no uso da técnica PLFA para investigar questões fundamentais da ciência do solo. Desde então, refinamentos do método pela Firestone e colaboradores têm incluído a adição de um padrão GC interno (C10: 0) e C19: 0, como um padrão substituto para melhorar a quantificação 28, e substituindo a utilização de separação funis para frascos de fundo redondo de simplificar extracção 29. Mais recentemente, Chowdhury e Dick 30 investigado o passo de metilação e relatou que um dos dois procedimentos de metilação utilizados na literatura científica solo o método de KOH / MeOH identified uma gama maior de ácidos graxos.

O método apresentado é em grande parte baseado no método original desenvolvido por Bligh e Dyer, e incorpora as modificações acima mencionadas, tais como a utilização de KOH metanólico para o passo de metilação. Dois padrões são utilizados para cada amostra: um padrão de substituição de 1,2-dinonadecanoyl- sn-glicero-3-fosfocolina (PC (19: 0/19: 0)), que é adicionado à amostra de solo antes da primeira extracção para avaliar a eficiência e a recuperação de todo o protocolo, e um padrão de instrumento de decanoato de metilo (MEC10: 0), que é adicionado antes da identificação e quantificação por GC.

Nós reconhecemos que o método PLFA é comumente usado por muitos laboratórios de ecologia microbiana em todo o mundo, e tem sido documentado muitas vezes, inclusive pela Organização Internacional de Normalização 2. O objetivo deste trabalho é apresentar um fácil de seguir e protocolo robusto que pode ser útil para o solocientistas que estão tentando aprender a técnica PLFA.

Protocol

NOTA: Assegure-se sempre que os equipamentos de protecção individual (EPI) é usado durante todo o protocolo. Vidraria não deve ser tocado com as mãos. Lipídios dos dedos, cabelo, graxas, óleos e hidrocarbonetos são todos os contaminantes potenciais. Use sempre luvas de borracha nitrílica e luvas de lavagem com álcool a 70% ao manusear material de vidro limpo. 1. Preparação de produtos vidreiros para Análise Copos descartáveis ​​(por exemplo, tubos de centrífuga) Embrulhe em papel alumínio e calor no forno de mufla de quatro horas e meia a 450 ºC. Politetrafluoretileno (PTFE) -lined tampas Mergulhe tampas durante uma hora em detergente fosfato e, em seguida, lavar com escova em água quente e detergente fosfato. Enxaguar o sabão com água da torneira. Coloque em banho de ácido (5% HCl) durante uma hora somente (não deixe mais tempo como os revestimentos podem cair das calotas se eles são embebidos por muito tempo. Lavar três vezesna água da torneira. Lavar três vezes em água destilada. Seco em estufa a 40 ºC. Copos reutilizáveis ​​(por exemplo, 10 ml, 15 ml, 45 ml frascos / potes) Lavar com escova em água quente e detergente fosfato. Enxaguar o sabão com água da torneira e coloque em banho de ácido (5% HCl) durante a noite. Lavar três vezes em água da torneira, em seguida, lavar três vezes em água destilada e, em seguida, seco em estufa a 40 ºC. Embrulhe em papel alumínio limpo (50 ml frascos são embalados individualmente e outros artigos de vidro é envolto em lotes de amostra, por exemplo, 20) e de calor em mufla para quatro horas e meia a 450 ºC. Vidraria volumétrica (por exemplo, balão volumétrico) Lavar com escova em água quente e detergente fosfato. Enxaguar o sabão com água da torneira e coloque em banho de ácido (5% HCl) durante a noite. Lavar três vezes em água da torneira, lavar três vezes em água destilada, e depois seco em estufa a 40 &# 186; C. Antes do uso lavar 3 vezes com uma pequena quantidade de solvente (por exemplo, metanol) – Não coloque vidraria volumétrica na mufla. 2. Recolha e Tratamento de Amostras de solo antes da análise PLFA Recolher amostras de solo em sacos estéreis, ea menos que estes podem ser analisadas imediatamente, congelá-los o mais rápido possível. Armazene as amostras em congelador (-80 ºC) até estar pronto para prosseguir com a liofilização de amostras. Congelar lotes de amostras a seco, seguindo as instruções do secador por congelação. Transfira cada amostra liofilizada de saco estéril nova marcado. Pesar amostra do material liofilizado no saco em tubo de centrífuga abafado pré-marcado para a extração PLFA. NOTA: A orientação geral é a utilização de 0,5 g de materiais orgânicos (teor de carbono> 17% em peso) e até 3,0 g de amostras de solo mineral. peso da amostra registro para cada amostra. Para cada 10 amostras, também pesam a umaduplicado para análise adicional, e para cada 20 amostras incluem um espaço em branco (isto é, um tubo de centrifugação que não tem qualquer amostra em que – utilizado como um controlo para identificar qualquer possível contaminação durante o processo de extracção PLFA). processar lotes de tubos de amostra ao mesmo tempo. NOTA: Um conjunto de 20 amostras corresponderá a um lote de 23 tubos de amostra (amostras 1 a 10, um duplicado da amostra de 10, amostras de 12 a 22, um duplicado da amostra 22, e um em branco = lote de 23 tubos de amostra). NOTA: Realizar a extração, a separação, em seguida, a metilação em lotes de amostras antes de prepará-los para análise GC e executá-los todos juntos. Isso ajuda a identificar onde os erros ter acontecido se alguma coisa der errado, e pode ajudar a diminuir o número de extracções repetidas necessárias. 3. PLFA Técnica (etapas são para amostra individual, mas completa um lote inteiro de cada vez) NOTA: Todas as etapas da técnica PLFA descritos nos Passos1-3 abaixo devem ser realizados em um exaustor usando EPI adequado e seguindo as diretrizes de segurança de laboratório. Extração (Passo 1): Prepare de KOH a 5,0 M por dissolução de 14 g de KOH em ​​50 ml de água destilada e desionizada (dH2O). Preparar tampão de citrato 0,15 M por dissolução de 31,52 g de mono-hidrato de ácido cítrico em 400 ml de dH 2 O. Ajustar a pH 4,00 ± 0,02 por adição de 5,0 M de KOH; cerca de 45-50 ml de 5,0 M KOH será necessário para ajustar o pH a 4,00. Quando o pH é ajustado, dilui-se tampão citrato de 1.000 ml utilizando um balão volumétrico. Memória tampão de citrato no refrigerador quando não está em uso (até um mês). Prepare diariamente o PC (19: 0/19: 0) nonadecanoato padrão substituto por diluição de 250 uL da solução de stock (10 mg / ml) em 25 ml de clorofórmio (isto fornece padrão substituto suficiente para um lote de 23 amostras). Adicionar 0,5 ml de PC (19: 0/19: 0) solução padrão substituto para o tubo de amostra centrífuga. UMAdd extractante Bligh e Dyer com a amostra de solo na seguinte ordem: i) 2,0 mL de tampão citrato, ii) de 2,5 ml de clorofórmio, e iii) 5,0 ml de metanol. amostra de boné e com uma tampa forrada de PTFE e vortex durante 30 seg; colocar em shaker-over-end end durante 2 h. Centrifugar a 226 g durante 15 min com o tampão no. Desenhe sobrenadante com uma pipeta de Pasteur e transferir para um 45 ml frasco de vidro rotulados. Adicionar uma segunda rodada de Bligh e Dyer extrator a cada amostra, e repita os passos 4 e 5 acima. Desenhe sobrenadante com uma pipeta de Pasteur e transferência para o mesmo marcado 45 frasco ml de vidro. Adicionar ao sobrenadante marcado contendo 45 ml frasco de vidro de: i) 5,0 mL de clorofórmio, e ii) tampão de 5,0 ml de citrato. Cap com revestido de PTFE tampão branco e vortex de vidro frasco durante 30 segundos. Deixar repousar durante a noite à temperatura ambiente no escuro (para evitar a oxidação). Cuidadosamente aspirar-se a fase aquosa superior do frasco de 45 ml (se não está disponível vácuo, a pipeta deve ser reduzido através do aquefase ous com muito cuidado, para não recolher qualquer na pipeta ao pipetar a fase orgânica). Pipeta inferior fase orgânica para rotulada 15 ml frasco. Ponto lote de 15 ml de frascos sob N 2 comprimidos (para evitar a oxidação) à temperatura ambiente. Evapora-se o clorofórmio-se lentamente, ajustando o caudal de N2 para irritar a superfície do líquido dentro do recipiente, mas não subir os lados do frasco. Parafuso em amostras de tampão e armazenar revestidos com PTFE no congelador a -20 ºC embrulhados em papel alumínio (envoltório em lotes em vez de individualmente) até que esteja pronto para prosseguir com a Etapa 2. Lipid fraccionamento (Passo 2) Coloque o suporte da coluna SPE com espigões no tanque de vidro. Inserir novas colunas de SPE (sílica, 500 mg, 6 ml) em espigões. colunas de etiquetas conforme necessário (recomendado para evitar misturar amostras). Acondicionar cada coluna por adição de 5 ml de acetona e deixá-la escorrer através de, e em seguida, adicionar duas adições de 5 ml de clorofórmio (volume total = 10 ml). Permitir segunda lavagem clorofórmio a fluir para fora até ~ 1 mm acima da frita e feche a torneira. Re-dissolver-se amostra (armazenado em 15 ml do frasco na extremidade do Passo 1) por adição de 0,5 ml de clorofórmio ao frasco e agitar com vortex suavemente. amostra na coluna SPE com uma pipeta de Pasteur de transferência de re-dissolvido; repetir para um total de 2 transferências (volume de transferência total de 1 ml de clorofórmio por exemplo). Lay amostra lípido directamente para o centro da coluna e permitir solvente para drenar completamente para dentro do tanque. Eluir lípidos neutros através da adição de 5 ml de clorofórmio para cada coluna. Permitir solvente para drenar completamente dentro do tanque. Elui-se os glicolípidos por adição de 5 ml de acetona para cada coluna. Permitir solvente para drenar completamente para dentro do tanque de recolha. Remover coluna ficar do tanque e drenar tanque com aparelho de vácuo. Insira rack com limpos e rotulados tubos de centrifugação para o tanque. Substituir a coluna ficar em tanque; coluna denominada acima deve alinhar com centr rotuladaifuge tubo abaixo. Eluir fosfolípidos para tubos de centrífuga por adição de 5 ml de metanol para cada coluna. Espere por colunas SPE a secar no exaustor antes de descartá-los. Frações fosfolipídeos para baixo secos à temperatura ambiente sob N comprimido 2. Tubos de purga com N 2. Parafuso em amostras tampão e armazenar revestidos com PTFE no congelador a -20 ºC embrulhados em papel alumínio (envoltório em lotes em vez de individualmente) até que esteja pronto para prosseguir para a Etapa 3. Metilação lípido (Passo 3). Ligue o banho de água quente ajustada para 37 ºC. Preparar ácido acético 1M (se já não fez) por dissolução de 57,1 ml de ácido acético glacial em 1.000 ml de dH2O usando um 1.000 ml balão volumétrico. Esta solução pode ser armazenada à temperatura ambiente durante até três meses. . Preparar em lote de KOH metanólico. Preparar a solução de KOH 0,2 M por dissolução de 0,45 g de KOH em 40 ml de metanol. Ajustar o volume de KOH e metanol de acordo com umtamanho do lote nticipated no Passo 3. Prepare esta solução diariamente; não armazenar por períodos mais longos. Retirar amostras (em tubos de centrífuga armazenados após a etapa 2) do congelador e permitir amostras atingir a temperatura ambiente. Adicionar 0,5 ml de clorofórmio e 0,5 ml de metanol a cada amostra, seguida por 1,0 ml de KOH metanólico. tubos de tampa bem com tampa forrada de PTFE. Agite para misturar. Coloque amostras seladas em 37 ºC banho para 30 min. Certifique-se de que o nível de água é um mínimo de 1-2 mm acima do nível do líquido da amostra. Retire e deixe amostras para esfriar. Enquanto as amostras estão em banho-maria, rotular pequenos frascos de vidro com IDs de amostra (10 ml frasco de vidro com tampa forrada de PTFE). Adicionar 2,0 ml de hexano a cada amostra e redemoinho. Em seguida, adicionar 0,2 ml de ácido acético 1,0 M a cada amostra e agite para misturar novamente; separação de fases deve tornar-se visível. Adicionar 2,0 ml de dH 2 O para cada amostra a ruptura da fase. amostras vortex durante 30 seg. Em seguida as amostras centrifugar a 226 xg durante 2 min. utilizaçãocurta pipeta de Pasteur, transferir a fase superior para limpar marcado frascos de 10 ml. Tenha cuidado para não transferir qualquer da fase inferior (aquosa). Adicionar 2,0 ml de hexano a cada tubo de amostra e centrífuga redemoinho. amostras vortex durante 30 seg. Em seguida as amostras centrifugar a 226 xg durante 2 min. Usando short pipeta de Pasteur, adicione novamente a fase de topo para o frasco de 10 ml de vidro escrito. Evaporar o solvente no marcado 10 ml frasco de vidro à temperatura ambiente sob N 2. Parafuso em amostras de tampão e armazenar revestidos com PTFE no congelador a -20 ºC embrulhados em papel alumínio (envoltório em lotes em vez de individualmente) até que esteja pronto para prosseguir com a análise GC. Certifique-se de rotular todas as amostras. Cromatógrafo a gás análise (GC) NOTA: A identificação e quantificação dos PLFAs individuais é realizada utilizando um GC conectado a um FID ou um detector de MS. Enquanto as instruções abaixo são para GC-FID, a preparação da amostra seria válida para GC-MS como well. Um exemplo de configuração para um sistema de GC-FID incluiria a 25 m × 0,2 mm x 0,33 mm (5% fenil) coluna -methylpolysiloxane com o seguinte protocolo de temperatura: temperatura inicial de 190 ºC, rampa de 10 ºC / min a 285 ºC , segure 9,5 min, rampa de 60 ºC / min a 310 ºC, mantenha 0,42 min 31. Prepare o padrão interno GC (ISTD), adicionando uma gota de MEC10: 0 (decanoato de metilo) a 100 ml de hexano (registro adicionado peso a 0,1 mg). Ligue gases para GC e, em seguida, ligar o GC. Certifique-se de que o H 2, N 2 e cilindros de ar estão abertas e que não existe gás suficiente para executar a análise (H 2 nunca deve ficar abaixo de 500 psi). Verificar que as condições de uma boa calibração forem satisfeitas, executando os padrões de calibração contendo uma mistura de ácidos gordos, seguida de uma peça em bruto de hexano. Identidade de ácidos gordos individuais podem ser manualmente definida com base em comparações com os tempos de retenção obtidos para padrões, ou isso pode ser automatically atribuída utilizando comercialmente softwares disponíveis 31. Em todos os casos, a identificação inequívoca pode ser conseguida utilizando um detector de MS 2. NOTA: Os sinais adicionais de uma boa calibração incluem uma linha de base plana e sem contaminação no enxaguamento hexano. Dissolve-se cada resíduo amostra PLFA (contida no frasco de 10 ml de vidro de metilação lípido Passo 3) em 150 ul da solução de ISTD e transferir para dentro do frasco de GC (alternativamente usar 50 a 75 ul, se a resposta da amostra é antecipado a ser fraca, tal como em muito solos arenosos). Definir o volume de injeção de amostra para 2 l. Regule a temperatura do FID a 300 ºC. Executar as amostras utilizando uma temperatura de entrada de 250 ° C, com H2 como gás portador (taxa de fluxo de 1,3 ml / min) e uma razão de divisão de 30: 1.

Representative Results

Os ácidos gordos são designados como X: YωZ, onde X representa o número de átomos de carbono, Y representa o número de ligações duplas, e Z indica a posição da primeira ligação dupla a partir da extremidade alifático (ω) da molécula. Os sufixos 'c' e 't' indicam cis e isómeros geométricos trans. O prefixos e sufixos 'a' e 'i' referem-se a Anteiso e iso ramificação e Me e OH especificar grupos metil e grupos hidroxilo, respectivamente. run pós-GC, verifique se amostras recebidas ISTD adequada, olhando para a 10: 0 pico. Além disso, verifique a resposta dos padrões de GC, ou seja, os frascos contendo hexano com uma solução ISTD acrescentado; estes não devem ter outros picos. resposta padrão interno deve ser semelhante em todas as corridas. A Figura 1 apresenta uma representaçãorun amostra tiva. O grande pico do solvente hexano caracteristicamente aparece em um tempo de retenção (RT) a cerca de 1,8 min. O pico do padrão ISTD (C10: 0) aparece em um RT de 3,4 min, enquanto C19: 0 tem um RT de 16,2 min. A análise por CG separa os PLFAs com base no seu comprimento de cadeia, com cadeias mais longas eluindo mais lentamente; por exemplo, C18: 0 elui a 14,4 minutos, enquanto se C16: 0 elui a 10,8 min. Além disso, este protocolo de análise pode separar PLFAs com base no seu grau de insaturação e a posição da sua ligação dupla; por exemplo, C18: 0 elui a 14,4 minutos, enquanto C18: 1 9c, e C18: 1 7c eluir a 14,0 e 14,1 min, respectivamente (Figura 1). Por último, PLFAs de comprimento semelhante corrente e saturação, mas a configuração de ramificação diferente (anteiso contra iso) podem ser separados; por exemplo, C15: 0i e C15: eluir 0a em 8,6 e 8,7 min, respectivamente (Figura 1). As áreas dos picos de GC diferentes podem ser importado para uma planilha para processar ainda mais as informações cromatograma. Cada PLFA identificado foi quantificada (nmol g -1 de solo seco) usando a seguinte equação: onde F é um fator de ajuste que leva em conta a selectividade FID e as diferenças molarity entre ácidos graxos 32, areaPLFA é a área do pico para cada identificados PLFA, areaC10: 0 é a área do pico para o ISTD (MEC10: 0), C10: 0 std adicionado é a quantidade de ISTD (nmol) adicionados a cada amostra antes da GC de execução, a proporção (C19: 0 std adicionado / C19: 0 amostra) corresponde à recuperação do PC (C19: 0 / C19: o) padrão de substituição, e o peso da amostra representa a quantidade de solo seco no forno (g) adicionado ao tubo de centrífuga de amostra original e utilizado para extrair PLFAs. NOTA: As áreas sob a diferent picos são expressos como as áreas dos picos, resposta ou resposta%, dependendo do sistema de GC. Dentro da gama relevante para o solo PLFA caracterização, áreas pode ser assumido ser linearmente proporcional aos pesos de ácidos gordos; Em alternativa, os factores de correcção pequenas podem ser aplicadas para contabilizar FID selectividade 32. Além disso, porque os resultados são inicialmente expressa numa base de percentagem em peso, que necessitam de ser normalizadas para produzir quantidades molares. Ajustar para diferenças molarity é conseguido tendo em conta os pesos moleculares dos ácidos gordos individuais; publicou tabelas 32 ​​e software comercial 31 também estão disponíveis para ajudar quando normalizando para molarity. A quantidade de ISTD (nmol) adicionado a cada amostra pode ainda ser calculado como: C10: 0std acrescentou = [ISTD] × V (STD acrescentado) <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> em que [ISTD] é a concentração (nmol L -1) do MEC10: 0 (decanoato de metilo) dissolvido em hexano (ver Passo 3.4.1), e V (DST adicionado) é o volume (L) de solução preparada ISTD adicionados a cada amostra antes da GC de execução (isto é, 150 ul de acordo com o passo 3.4.4). A quantidade de C19: 0 (nmol) presente em cada amostra durante a análise cromatográfica corresponde a: onde areaC19: 0 representa a área do pico para C19: O, enquanto que a quantidade correspondente de C19: 0 (nmol) adicionado a cada amostra no início do método de extracção PLFA (cf. Etapa 3.1.3) é: onde [19: 0] Std (mg L -1 </sup>) representa a concentração do C19: 0 nonadecanoato padrão substituto dissolvido em clorofórmio (Passo 3.1.3), V (19: 0 std adicionado) é o volume de padrão substituto preparado adicionados a cada amostra no início da extracção PLFA método (cf. passo 3.1.3), H 19: 0 é o peso molecular de 1,2-dinonadecanoyl- sn-glicero-3-fosfocolina (PC (19: 0/19: 0)). NOTA: Um mol de C19: 0 nonadecanoato rendimentos padrão substitutos duas moles de C19: 0 seguindo o passo de metilação, enquanto o C10: 0 padrão é adicionado após metilação. Os seguintes PLFAs são normalmente excluídos da análise de comunidades microbianas do solo: i) PLFAs que são <14 c e> 20 C de comprimento, e ii) PLFAs com menos do que 0,5% do total de área de pico. Uma vez que estes PLFAs foram excluídas, as respostas de todos os PLFAs restantes podem ser somados para obter o bi total de PLFAomass (nmol g -1 de solo seco). A análise univariada dos dados PLFA (por exemplo, análise de variância, após transformação de dados conforme apropriado para atender às premissas do teste que está sendo executada) pode ser usado para comparar biomassa total PLFA e / ou PLFA biomassa dos grupos seleccionados entre os grupos de amostra / tratamentos. Por exemplo, a Figura 2 apresenta os resultados para a distribuição relativa de diferentes grupos, tais como PLFA PLFAs saturados de cadeia linear, saturados com PLFAs quer a meio da cadeia (10-metilo) ou ramificação do terminal, e mono- ou poli-insaturados PLFAs, bem como a soma de PLFAs totais (nmol g -1 de solo seco). Neste exemplo particular, a idade das árvores (que diminui a partir do Local 1 para Local 3) é visto de influenciar tanto PLFAs totais e a distribuição relativa dos diferentes grupos PLFA. Para avaliar os padrões globais na composição PLFA entre as amostras, a análise multivariada de todos PLFAs pode ser Conducted 33. Os dados PLFA precisa ser transformado, se necessário, antes da análise multivariada selecionados para atender as premissas do teste estatístico ea questão de pesquisa a ser abordada, por exemplo, uma transformação Hellinger é frequentemente usado para relativizar os dados. A Figura 3 mostra os resultados de um não escalonamento multidimensional (NMDS) ordenação -metric dos mesmos dados que foram utilizados na Figura 2; NMDS é um não-paramétrico, técnica multivariada que produz posicionamento 2 ou 3-dimensional de pontos de dados com base na similaridade do ranking pontuação entre as amostras. Figura 1. representativas cromatograma GC-FID. Uma amostra obtida a partir de um solo castanho chernozemic cultivado foi usado para esta análise. Os tempos de retenção e PLFAs correspondentes (entre parênteses) e sua área de pico (PA) aestá indicado na figura por picos representativos. Para maior clareza, nem todos os picos são indicadas na figura, embora esta amostra particular rendeu 33 PLFAs identificados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2. abundância relativa de seis diferentes classes de PLFAs (% de PLFAs totais), e biomassa total PLFA (nmol g -1 de solo seco). As amostras de solos Luvisolic florestais foram utilizados para esta análise. Os resultados indicam maiores PLFAs totais do solo no Site 1, que está localizado sob as árvores mais velhas (> 50 anos), seguidos pelos intermediários-idade (25 anos) Árvores (local 2), e por último os mais jovens (10 anos) árvores ( site 3). Relativamente PLFAs mais saturadas estão presentes na mais jovemlocal, enquanto mais PLFAs insaturados estão presentes no local mais antiga. As barras de erro representam os desvios padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3. escalonamento multidimensional não-métrico (NMDS) ordenação de PLFAs (usando% do total de dados PLFAs) para eixos 2 e 3 de uma solução de 3-dimensional. Esta ordenação foi calculado usando os mesmos dados que os utilizados para a Figura 2. O local mais jovem (site 3) separa muito claramente dos dois locais mais antigos (Sites 2 e 3), que mostram sobreposição na sua composição comunidade microbiana PLFA. A quantidade de variação nos dados comunidade PLFA explicada por cada eixo está incluído nos parênteses; 72,5% da variação é explicada por estes dois eixos para um 3-Dimensolução NMDS sional. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Para minimizar e evitar erros de interpretação dos dados PLFA, o rastreio de dados cuidadosa deve ser feito porque alguns PLFAs que são encontrados na comunidade microbiana do solo também estão presentes em organismos eucarióticos individuais e multicelulares, como as raízes das plantas, algas e animais do solo. Além disso, Archaea não contêm PLFAs; Em vez disso, as membranas de arqueia são compostos de lípidos de fosfolípidos de éter (PLELs). Consequentemente, o protocolo PLFA não pode ser utilizado para caracterizar as comunidades arqueia no solo.

Associando PLFAs individuais a grupos microbianos específicos deve ser realizado com cautela (veja a publicação 2011 por Frostegård e colegas 34 para uma excelente discussão de algumas das limitações do método PLFA). Em vez disso, pode ser mais apropriado, tal como foi feito na figura 2, a PLFAs grupos com base na sua estrutura química, por exemplo, i) PLFAs saturados de cadeia linear, saturados PLFAs II) com meio-chaiN (10-metil) ramificados, ácidos gordos saturados III) terminal-ramificados, iv) PLFAs monoinsaturados, v) PLFAs poli-insaturados, e vi) ácidos gordos hidroxi.

O peso da amostra pode necessitar de ser ajustada com base na quantidade de PLFAs extraíveis contidos numa dada amostra de solo. Por não ajustar a quantidade de solo extraído em solos ativos menos microbianos, os usuários correm o risco de não obter um número suficiente de respostas PLFA (picos) para representar com precisão a comunidade microbiana em geral. Em solos altamente microbiologicamente activos com elevadas concentrações de PLFAs, os utilizadores estão em risco de sobrecarga da coluna GC, impedindo assim a quantificação precisa de PLFAs. Em ambos os casos, as amostras de solo deve ser re-analisadas para PLFAs. Um bom ponto de partida é adicionar 0,5 g de amostras de solo orgânicos (tais como pisos florestais), e cerca de 3 g de amostras de solo mineral. Uma vez que a quantidade de extraíveis é PLFAs normalmente correlacionado com a quantidade de carbono orgânico contido em um solo, que amostraight pode ser ajustada com base no teor de carbono, por exemplo, 1 g de amostra de solo mineral pode ser suficiente para obter uma boa quantificação PLFA quando o teor de carbono é de 10-15%, enquanto> 5 g pode ser necessário se o teor de carbono é 0,5 ≤ %. É sempre uma boa idéia para fazer um ensaio com algumas amostras para otimizar o peso da amostra antes de todo o conjunto é executado.

estratégias de resolução de problemas comuns para o protocolo PLFA e análise por CG são como se segue. Se a linha de base GC cromatograma é demasiado elevada, o cilindro de gás H2 deve ser mudado. Se os picos de solvente ou ISTD estão ausentes do cromatograma, pode haver um problema com a injeção da amostra (por exemplo, ligado seringa, problema com amostrador automático, frasco vazio ou em falta, erro no posicionamento do frasco). Se mais de três picos são detectados no método em branco / amostra, não há contaminação da peça em bruto, e existe uma elevada probabilidade de que o mesmo contaminante (s) estarão presentes na amostra de CG Chromatograms. Localizar a fonte de contaminação (meios normalmente aquosa), ou, pelo menos, assegurar que os picos correspondentes ao contaminante são removidos a partir dos cromatogramas de amostra e que esses picos não estão incluídos em qualquer análise estatística dos dados PLFA. Além disso, é uma boa idéia para executar hexano lavagens entre as amostras quando carry-over é suspeita. Picos adicionais na lavagem hexano indicará carry-over (ou seja, componentes mais pesados ​​eluição de execução anterior).

Lipídios são particularmente suscetíveis à oxidação, e em particular o cuidado deve ser exercido ao longo do protocolo para proteger amostras de exposição ao ar ea luz, como armazená-los no escuro e mantê-los sob azoto. Todas as amostras e brancos deve ter C19 suficiente: 0 padrão de aluguel. A C19 faltando: 0 pico, tanto em amostras ou espaços em branco, indica uma má recuperação ou uma completa perda de analitos. Uma resposta de C19: 0 nas amostras que é consideravelmente mais baixa do que o mblanks étodo / amostra indica uma perda de analitos em algum momento na metodologia PLFA. Quando confrontados com a má C19: 0 de recuperação, todos os aspectos do processo têm de ser cuidadosamente considerados e examinados incluindo a extração inicial, todas as fases da transferência da amostra, extração SPE, a metilação de ácidos graxos, secagem, armazenamento e manipulação da amostra, a fim de isolar o fase ou fases em que os analitos são perdidos. Por outro lado, pode ser que a extracção de algumas amostras de solo podem produzir C19: 0, em que a recuperação caso do padrão de substituição pode ser subestimada. Enquanto estiver usando dois padrões ((PC (19: 0/19: 0) e MEC10: 0) não é uma exigência absoluta, descobrimos que este é muito útil quando a necessidade de solucionar Enquanto o MEC10:. 0 resposta é adequada , solução de problemas pode se concentrar nas etapas anteriores à análise GC.

Como observado anteriormente, o cuidado deve ser usado ao interpretar relações de significação e de ecossistemas ecológicos baseada unicamente em biomarcadores derivard a partir de dados PLFA, porque os estudos de cultura pura revelam que cepas de bactérias isoladas conterá diferentes categorias de PLFAs. Em vez disso, PLFAs biomarcadores deve ser visto como uma adição útil para um conjunto de evidências ao fazer inferências ecológicas mais amplas. Na literatura, PLFAs individuais têm sido propostos e utilizados como biomarcadores para diferentes grupos de microrganismos. PLFAs saturados são tipicamente usados ​​para representar as bactérias gram-positivas e monoinsaturada PLFA são utilizados para as bactérias gram-negativas. biomarcadores reconhecidos para bactérias gram-negativos incluem ácidos gordos monoinsaturados com a insaturação na posição ω5 ou ω7, tais como C16: 1ω7, C18: 1ω7, e C18: 1ω5. Além disso, os ácidos gordos podem também ser ciclopropilo representativo de bactérias gram-negativas 35. Assim, PLFAs de bactérias gram-negativas pode ser calculada como sendo igual à soma de A: 1ω5 + A: + A 1ω7: 0cyclo. biomarcadores reconhecidos para bactérias gram-positivas são terminalmente sa ramificadaácidos graxos turated,-iso ramificada tais como C15: 0i, C16: 0i, C17: 0i; ou anteiso-ramificados, tais como C15: 0a e C17: 0a. Saturada PLFAs com a meio da cadeia (10-metil) ramificação, como 10Me16: 0 e 10Me18: 0 são características presentes nos actinomicetos 36. Assim, PLFAs de bactérias Gram-positivas pode ser calculado como sendo igual à soma de A: 0 (ISO, anteiso, 10-metilo).

Muitos biomarcadores associados com PLFA fúngica são muitas vezes poli-insaturado, mas alguns biomarcadores fúngicas são monoinsaturada. Por exemplo, em termos de biomarcadores monoinsaturadas fúngicas, C16: 1ω5 foi identificado como um indicador de fungos micorrízicos arbusculares (FMA) 37, C18: 1ω9 é comum em fungos saprófitas, e ectomycorrhizae normalmente contêm C16: 1ω9. A presença de di-insaturados C18: 2ω6,9 ocorre muitas vezes em conjunto com C18: 1ω9 e também se correlaciona bem com o ergosterol esteróis fúngica, o que indica que C18: 2ω6,9 pode adequadamente representar ectomycorrhizae e fungos saprófitas 38. O C18 tri-insaturados: 3ω 6,9,12 também tem sido utilizada como um biomarcador para fungos 10; No entanto, C18: 3ω6c podem ser encontradas em outros organismos eucariotas, incluindo plantas e algas, embora normalmente não é encontrada em bactérias. Em termos de protistas solo, C20: 4ω6c tem sido reconhecido como um biomarcador protista 39, embora, outros trabalhos não conseguiram detectar C20: 4ω6c mesmo quando as populações protistas viáveis ​​foram confirmadas visualmente utilizando microscopia de luz 40.

Muitos estudos abordam questões ecológicas relacionadas com a comunidade em geral microbiana do solo, utilizando técnicas de ordenação multivariada como uma ferramenta de análise de dados PLFA. Ao usar esta abordagem, alguns autores escolheram a excluir PLFAs raras a partir do conjunto de dados através da remoção PLFAs que estão presentes em menos do que 5% das amostras 4. Os ácidos gordos saturados normais C16: 0 e C18: 0 são abundantes em todos os microorganismos do solo, incluindo procariotas e EUKaryotes. Por isso, alguns pesquisadores optar por remover esses PLFAs antes da análise estatística na base de que eles não podem ser indicadores sensíveis da composição da comunidade microbiana do solo – embora C16: 0 e C18: 0 ainda devem ser incluídos quando somando todas PLFAs para um índice de biomassa microbiana. Em termo de análises estatísticas, muitos investigadores escolher conduzir uma ordenação não métrico escalonamento multidimensional (NMDS) como esta técnica é bem adequado para dados que não podem ser normalmente distribuído 33. Análises adicionais relacionadas com variáveis ​​categóricas podem incluir análise de espécies indicadoras, que pode se relacionar a ocorrência de PLFAs específicas aos agrupamentos categóricos e procedimentos múltiplos de permutação de resposta (MRPP), que podem ajudar a determinar semelhanças ou diferenças entre as comunidades microbianas atribuídos a grupos categóricas. Além disso, árvores de regressão multivariada (MRT) pode ser particularmente útil quando a influência de múltiplas variáveis ​​ou experimentaistratamentos precisa ser avaliada como variáveis ​​explicativas potenciais 5 (por exemplo, textura do solo, umidade, idade recuperação).

Uma vez estabelecido, o protocolo PLFA é um método analítico relativamente simples que pode ser muito útil ao quantificar a resposta microbiana do solo às mudanças ambientais e perturbações antropogénicas. Embora as técnicas moleculares, como a impressão digital genética são mais adequados para a caracterização detalhada das comunidades microbianas, o método PLFA apresenta a vantagem de fornecer informações quantitativas sobre biomassa microbiana total de 34. Em nosso laboratório de pesquisa, uma pessoa pode confortavelmente processar um conjunto de 20 amostras ao longo de 4 dias, e temos encontrado o protocolo apresentado aqui para ser uma técnica robusta e reproduzível para avaliar a qualidade biológica do solo.

O poder do método PLFA pode ser consideravelmente prolongada através do seu acoplamento a análise dos isótopos estáveis ​​41, 42. Especificamente, a adição óf 13 substratos marcado-C para solos permite a quantificação da incorporação substrato em microrganismos do solo que as análises isotópicas dos PLFAs individuais 41. Além disso, este método parece ser uma ferramenta muito promissora para elucidar as ligações tróficas no solo teias alimentares 42.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was financed in part by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada. The authors acknowledge Jela Burkus, Donna Macey, and Jennifer Lloyd for their technical expertise and their contribution to the optimization of this method.

Materials

Pierce Reacti-Vap III-evaporator gassing manifold with 27 ports Used in Steps 1-3
Compressed Nitrogen Praxair Ni-T Dangerous: Use only after training and minimize contact and use; Used in Steps 1-3
Disposable centrifuge tube and Teflon-lined cap Fisher Scientific 05-569-3 Used for Step 1 (1 per sample) and Step 2 (1 per sample)
Disposable glass long-necked Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20D Used for Step 1 (2 per sample)
Disposable glass short-necked Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-4 Used for Step 2 (1 per sample), Step 3 (1 per sample), GC analysis (1 per sample),, and one for each type of solution dispensed during PLFA methods (~10 per batch of samples)
Elastic band Grand & Toy 42199 1 per sample for freeze drying
Freeze Dryer-Labconco 7806002 and 7753000 Used for preparing samples for PLFA analysis – use whatever model your lab has
Freezer (-20 °C, -80 °C) Revco ULT2586-5-A36 Minus 80 °C is used for freezing freshly collected soil samples, -20 °C is used for storing samples at end of each of 3 steps of PLFA analysis
Gas chromatograph – Agilent 6890 Series capillary gas chromatograph (GC;, Wilmington, DE) equipped with a 50 m Ultra 2 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane column Agilent Technologies Used for GC analysis, other models of GC could also be used (1 needed)
Analytical column Agilent Technologies 19091B-105
Gas chromatograph insert Agilent Technologies 5183-4692 Used for GC analysis (1 per sample)
Gas chromatograph vial and lid Agilent Technologies 5188-6592 Used for GC analysis (1 per sample)
Hexanes Fisher Scientific H292-4 Hazardous: use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 4 ml (2.0 ml + 2.0 ml (step 3)
Hot water bath -Isotemp 220 Fisher Scientific Used for Step 3 (1 per batch of samples)
Kimwipe Fisher Scientific 06-666-2 Used for freeze drying samples
KOH,  ACS grade Fisher Scientific P250-500 Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Used for making citrate buffer (used in Step 1) and methanolic KOH (step 3)
Lab quake end-over-end shaker for centrifuge tubes Barnstead/Thermolyne 3,625,485 Used for Step 1 (1 per batch of samples of appropriate holding capacity)
MeC10:0 methyl decanoate internal standard Sigma-Aldrich 299030-2.5G Used for GC analysis
Methanol Fisher Scientific A454-4 Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 15.5 ml (5 ml + 5 ml (step 1) + 5 ml (step 2) + 0.5 ml (step 3))
MIDI Peak Identification Software MIDI, Inc., Newark, DE Used for interpreting GC analysis output
MIDI Calibration Standard Mix for Microbial Identification System Lab Sphere Inc 1200-A Used as a Calibration mix for TSBA 40
Nitrile gloves Fisher Scientific 27-058-52 Used always when conducting PLFA lab work
pH Meter – Accumet XL200 Fisher Scientific Used for making citrate buffer
Pipette (0.2 – 2 ml)- Socorex -Calibra Digital 832 Macropipette Socorex 832.02 Used throughout Steps (1 per sample)
250 µL gastight syringe Hamilton  1725 Used for GC analysis (1 per sample)
silver shield gloves Sigma-Aldrich Z529575 For use when handling chloroform
solid phase extraction (SPE) column Agilent Technologies 5982-2265 Used for Step 2 (1 per sample)
SPE glass column holder with spigots  and vacuum apparatus attached Sigma-Aldrich Used for Step 2 (1 per batch of samples)
Vortex – Barnstead International Maxi Mix II- M37615 Barnstead International  M37615 Used in Steps 1-3
Water -  ultra-pure and Chromosolv HPLC grade Sigma-Aldrich 270733-4L Used throughout analysis
Whirl-Pak® bags Fisher Scientific 01-812-120 Used in sample collection – 2 bags required per sample collected
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Referências

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Quideau, S. A., McIntosh, A. C., Norris, C. E., Lloret, E., Swallow, M. J., Hannam, K. Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils. J. Vis. Exp. (114), e54360, doi:10.3791/54360 (2016).
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