추출 및 토양의 미생물 인지질 지방산의 분석
Summary
인지질의 지방산 토양 미생물 커뮤니티의 구조에 대한 정보를 제공한다. 우리는 단상 클로로포름 혼합물을 고체상 추출 칼럼을 사용하여 추출한 지질의 분류 및 모세관 가스 크로마토 그래피로 분석 지방산 메틸 에스테르를 생성하기 위해 메탄과 토양 시료로부터 추출하기위한 방법을 제시한다.
Abstract
인지질의 지방산 (PLFAs)는 미생물의 세포막의 주요 성분이다. 토양에서 추출 PLFAs의 분석은 지상파 미생물 지역 사회의 전체 구조에 대한 정보를 제공 할 수 있습니다. PLFA 프로파일 광범위 전체 토질의 생체 지표로 생태계의 범위에서 사용되고, 토양 반응의 정량적 지표로 관리 및 기타 환경 스트레스 착륙.
단상 클로로포름 혼합물로 토양 시료로부터 (1) 지질 추출, 2. 분획 다른 추출 된 지질로부터 인지질을 분리 고상 추출 컬럼을 사용하여 지방산을 생산하는 인지질 3. 메탄 : 여기에 제시된 표준 방법은 네 가지 주요 단계를 설명 메틸 에스테르 (FAMES) 및 불꽃 이온화 검출기 (GC-FID)를 사용하는 캐 필러 리 가스 크로마토 그래피 분석 4. FAME. 1,2- dinonadecanoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 (PC (19을 포함하여 사용되는 두 개의 기준 :이 0/19 : 0))를 추출 방법의 전반적 회복을 평가하고, 메틸 데 카노 에이트 (MeC10 : 0) GC 분석에 대한 내부 표준 물질 (ISTD)로서.
Introduction
인지질 지방산 (PLFAs)는 도메인 박테리아와 Eukarya에서 미생물 세포막의 일부입니다. 미생물 즉각적인 환경 조건에 따라 세포막 무결성 및 세포 기능을 유지하기위한 수단으로서 다양한 사슬 길이 및 조성물 PLFAs 생산; 따라서이 비슷한 토양 조건에 지리적으로 분리되어 있지만, 대상이되는 미생물 지역 사회가 비슷한 PLFAs을 표현하는 것이라고 주장 할 수있다. 14 20 C 원자 사이의 사슬 길이와 토양 PLFAs는 일반적으로 주로 세균 및 진균 기원 (1)로 간주된다. 혼합 배양에서 PLFA 분석은 개별 미생물 종을 식별하는 데 사용될 수 있지만, 토양에있는 미생물 군집의 전체 지문을 제공 할 수있다. PLFAs 빠르게 세포 사멸에 분해되기 때문에, 또한, 이들은 살아있는 토양 미생물 집단이 나타내는 것으로 간주 될 수있다. 이 절반hnique 광범위 5-6 대초원 숲 3-4 이르기까지 다양한 환경에서 발견되는 미생물 군집, 및 농업 분야 (7)의 구성 성분을 특성화하는데 사용되어왔다. 그것은 성공적으로 숲은 금속 (14)와 탄화수소 (15)에 의해 화재 13, 오염 등의 장애뿐만 아니라, 매립 10-12, 8 명확한 절단 9 석회를 포함하여, 관리 변경 토지 토양 반응의 특성을 적용하고, 곤충 발생 16 한 .
현대 PLFA 분석 방법은 연구 그룹의 숫자에 의해 몇 가지 주요 발전을 통해 마지막 여섯 년 동안 진화. 이상성 시스템 (17)에 단상에서 혼합물 시프트 추출 용액에 물 비율 : 메탄올 : 1958 년 상당한 개선 클로로포름 조정에서 일어났다. 이 최적화 된 지질 추출 및 개정 된 분리 프로로토콜은 후 Bligh와 다이어 방법으로 알려지게되었다. 이 프로토콜은이 시간 동안, 화이트와 동료 방법에 상당한 발전에 기여, 향후 몇 년 동안 많은 실험실에 의해 채택되었다; 예를 들어, 이들은 물 인산 완충액 교환에 의한 추출 공정을 개선하고 향상된 피크 식별 및 정량화를 통하여 가스 크로마토 그래피 (GC)에 의한 분석을 최적화. 아마도 토양 과학에 더 관련성, 그들은 해양 퇴적물 (18)의 미생물 생물량을 조사 할 때 상기 추출 된 지질을 미생물 구조의 지표로 사용될 수 있음을 1979 결정.
이 방법이 더 널리 특히 근권 (19)과 관련하여, 토양 과학에 사용되었다으로 추가 개발은 1980 년대에 발생했습니다. 이 때,이 방법은 메틸 nonadecanoate 포함 (MeC19 : 0) 내부 표준 (19) 및 지질 분획 21 <대한 규산 컬럼의 사용과 같은/ SUP>. 화이트 19, 21와 그의 작품에 따라, Tunlid 스웨덴으로 돌아와 바트와 Frostegård와 공동 연구를 시작했다. 유기물 함량의 변화 토양 제품군의 다른 추출 버퍼의 효율을 조사함으로써, 그룹은 구연산 완충액은 포스페이트 버퍼 (22)에 비해 추출 된 지방 인산의 양이 증가 된 것으로 나타났다. 또한, 토양 미생물 커뮤니티에 석회의 영향에 대한 자신의 1993 간행물 (23)는 토양 생물학 및 생화학 (24)에서 인용 고전이 될했다. 연구자들은 데이터 처리에 대한 주성분 분석을 이용했다. PLFA 분석, 방법은 현재 호출되면, 대용량 데이터 세트를 생성하고, 이러한 데이터를 처리하기위한 다 변수 통계 방법의 사용에 매우 많은 시간을 혁신적 영감이었다. 작품에 동시 스웨덴에서 수행되며, 상기 PLFA 절차에 대한 수정이 조사되고 있었다독일에 의해 Zelles와 동료 25 ~ 26. 절차 이들 버전은 전체적으로 더 실험실 집약적이고, 고상 추출 (SPE) 컬럼 대신에 규산 칼럼의 사용을 위해 주목할했지만.
화이트 & Ringelberg (27)에 의해 상세한 방법론과 함께 Frostegård의 종이 (23)는, 토양 과학에 대한 근본적인 질문을 조사 할 PLFA 기술의 사용에 폭발에 대한 기초를 제공했다. 및 C19 : 이후 파이어 동료에 의한 방법의 더욱 세분화 내부 GC 표준 (0 C10) : 추가 포함했다 부량 (28)을 개선하기 위해 대리 기준으로 0과 분액의 사용을 대체가 단순화 둥근 바닥 튜브 퍼널 추출 29. 최근 Chowdhury 딕 30 메틸화 단계를 조사 토양 과학 문헌 코 / 메탄올 방식 식별자에 사용 된 두 개의 메틸화 절차의보고지방산의 더 큰 범위를 지정한 본.
제시된 방법은 크게 후 Bligh 및 다이어 의해 개발 된 기존 방법에 따라, 이러한 메틸화 단계 KOH 메탄올의 사용과 같은 상기 언급 된 변형을 포함한다. 두 기준은 각각의 샘플에 사용되어, 제 1 추출 전에 토양 시료에 첨가 1,2- dinonadecanoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 (: 0/19 0) PC (19) ()의 대리 표준 효율성과 전체 프로토콜의 복구, 메틸 데 카노 에이트의 구 규격 평가할 (MeC10 : 0), GC에 의해 식별 및 정량화하기에 앞서 추가된다.
우리는 PLFA 방법은 일반적으로 전 세계적으로 많은 미생물 생태 연구소에 의해 사용되며, 표준화 2 국제기구를 포함, 여러 번 기록되어 있음을 인정합니다. 본 논문의 목적은 토양에 유용 할 수있는 프로토콜 따라하기 쉽고 강력한을 제시하는 것입니다PLFA 기술을 배우려고 노력하는 과학자.
Protocol
Representative Results
Discussion
토양 미생물 커뮤니티에서 발견되는 일부 PLFAs는 또한 식물 뿌리, 조류, 토양 동물과 같은 단일 및 다세포 진핵 생물에 존재하기 때문에 최소화하고 PLFA 데이터의 잘못된 해석을 방지하기 위해주의 데이터 검사가 수행해야합니다. 또한, 고세균은 PLFAs를 포함하지 않는; 대신, 고세균 막을 인지질 알콕시 글리세롤 (PLELs)로 구성된다. 따라서, PLFA 프로토콜 토양 고세균 커뮤니티의 특징을 사용할 수 없다.
특정 미생물 그룹에 개별 PLFAs를 연결하는 것은 신중하게 행사해야합니다 (PLFA 방법의 한계 중 일부의 훌륭한 토론 Frostegård 및 동료 (34)에 의해 2011 년 출판물을 참조하십시오). 중간 차이와, 그 화학 구조에 기초한 그룹 PLFAs에,도 2에 예를 들면, ⅰ) 직쇄 포화 PLFAs, ⅱ) 포화 PLFAs을 수행되었을 대신 더 적절할 수있다N (10 메틸) 분지, ⅲ) 말단 분지 포화 지방산, ⅳ) 불포화 PLFAs, V) 불포화 PLFAs 및 VI)의 히드 록시 지방산.
샘플 중량은 주어진 토양 시료에 함유 추출 PLFAs의 양에 기초하여 조절 될 필요가있다. 이하 미생물 활성 토양에서 추출 된 토양의 양을 조정하지 않음으로써, 사용자가 정확하게 전체 미생물 군집을 나타내는 PLFA 반응 (피크)의 충분한 수를 얻기없는 위험이있다. PLFAs의 높은 농도가 높은 미생물 활성 토양에서 사용자는 이에 PLFAs의 정확한 정량을 방지 GC 열 과부하의 위험이 있습니다. 두 경우 모두에서 토양 시료 PLFAs 재 해석되어야한다. 좋은 출발점 (예 : 숲 바닥 등) 유기 토양 시료 0.5 g, 미네랄 토양 시료 3 g을 추가하는 것입니다. 추출 PLFAs의 금액은 일반적으로 토양 샘플 우리 함유 유기 탄소의 양에 상관되기 때문에ight 토양 탄소 함량을 기준으로 조절 될 수 있으며, 탄소 함량이 0.5 ≤ 경우> 5g 필요할 수 있지만 예를 들면, 미네랄 토양 시료 1g을 취하여, 탄소 함량이 10-15 % 일 때 양호한 PLFA 정량을 얻기에 충분할 수있다 %. 항상 전체 세트가 실행되기 전에 샘플 무게를 최적화하기 위해 몇 가지 샘플로 시험 실행을 수행하는 것이 좋습니다.
다음과 같이 PLFA 프로토콜 및 GC 분석을위한 일반적인 문제 해결 전략이다. GC의 크로마토 그램의 기준선이 너무 높으면, H 2 가스 실린더가 변경되어야한다. 용매 또는 ISTD 피크 크로마토 그램에서 누락 된 경우, 시료 주입에 문제가있을 수 있습니다 (예를 들어, 주사기, 자동 시료 주입기에 문제가 비어 있거나 누락 된 유리 병, 유리 병 위치와 오류를 연결). 세 개 이상의 피크 방법 / 빈 샘플에서 검출하는 경우, 블랭크가 오염과 같은 오염 물질 (들)이 샘플 GC C가 존재할 수 있다는 가능성이 높다hromatograms. 오염원 (일반적으로 수성 매질)을 찾거나 적어도, 오염물에 대응하는 피크는 샘플 크로마토 그램에서 이러한 피크는 PLFA 데이터의 통계적 분석에 포함되지 않도록 제거되도록. 또한, 이월이 의심되는 경우 헥산 샘플 사이에 린스를 실행하는 것이 좋습니다. 헥산 린스의 추가 피크는 이월 (이전 실행에서 용출 즉, 무거운 부품)을 나타냅니다.
지질의 산화에 특히 민감하며, 특히 치료는 암에 저장하고 질소하에 그들을 유지하는 등 공기와 노광로부터 시료를 보호하기 위해 프로토콜에 걸쳐 발휘되어야한다. 0 대리 표준 : 모든 샘플 및 공백은 충분한 C19이 있어야합니다. 누락 된 C19 : 0 피크, 하나의 샘플 또는 공백에는 가난한 복구 또는 분석의 전체 손실을 나타냅니다. 제 m보다 상당히 낮은 샘플에서 0 : C19의 응답ethod / 샘플 공백은 PLFA 방법에 어떤 점에서 분석의 손실을 나타냅니다. 불량한 C19에 직면했을 때 0 복구 절차의 모든 측면에는 격리하기 위해 초기 추출 시료 전송의 모든 단계, SPE 추출 지방산 메틸화, 건조, 저장 및 샘플 조작 포함 신중하게 고려되어야 할 및 검사 단계 또는 분석이 손실 단계. 대리 표준의 경우 복구를 과대 평가 될 수있는 0 : 한편, 일부 토양 시료의 추출은 C19을 수득 수 일 수있다. 0/19 : ((PC (19이 표준을 사용하는 동안 0)과 MeC10 : 0) 절대 요구, 우리는 문제를 해결하기 위해 필요로 할 때 매우 유용하다는 것을이 발견되지 않은만큼 MeC10과 같습니다. 0 응답이 적절하다 문제 해결은 GC 분석 이전 단계에 초점을 맞출 수 있습니다.
이전에 언급 한 바와 같이,주의는 전적으로 바이오 마커가 유도에 따라 생태 학적 중요성과 생태계의 관계를 해석 할 때 사용합니다PLFA 데이터로부터 D, 순수 문화 연구 고립 된 박테리아 균주는 PLFAs의 다른 종류를 포함하는 것을 공개하기 때문이다. 광범위한 생태 학적 추론을 할 때 대신, 바이오 마커 PLFAs 증거의 스위트 룸에 유용한 추가로 볼 수 있습니다. 문헌 개별 PLFAs 제안 된 다른 미생물 그룹에 대한 바이오 마커로 이용했다. 포화 PLFAs는 일반적 그람 양성균을 나타내는 데 사용되는 그람 음성균에 사용 PLFA을 불포화된다. 1ω7, C18 : 1ω7 및 C18 : 그람 음성균에 대한 인식 바이오 마커는 C16과 ω5 또는 ω7 위치에서 불포화과 지방산을 불포화 포함 1ω5합니다. 또한, 시클로 지방산은 그람 음성균 (35)을 대표 할 수있다. 1ω5 + A : 1ω7 + A : 0cyclo 따라서, 그람 음성균으로는 PLFAs의 합으로 계산 될 수있다. 그람 양성 세균에 대한 인식 바이오 마커는 말기 사 분지된다turated 지방산, 이소 지형 C15 등 : 0I, C16 : 0I, C17 : 0I; 0A 및 C17 : 0A 또는 C15로, 안테 이소는 분지. 포화 중간 체인 (10 메틸) 분기와 PLFAs 같은 10Me16 : 0 10Me18 : 0 방선균 (36)에서 특징적으로 존재한다. 따라서, 그램 양성 세균으로부터 PLFAs는의 합과 동일한 것으로 계산 될 수있다 : 0 (ISO, 안테 이소 10 – 메틸).
곰팡이 PLFA과 관련된 많은 바이오 마커들은 고도 불포화되어 있지만, 일부 곰팡이 바이오 마커는 단일 불포화된다. 예를 들어, 곰팡이 단일 불포화 바이오 마커의 관점에서, C16 : 1ω5가 arbuscular 균근 곰팡이의 지표 (AMF) (37), C18로 확인되었습니다 1ω9는 잡균 곰팡이에서 일반적이고, ectomycorrhizae는 일반적으로 C16를 포함 : 1ω9합니다. 디 – 불포화 C18의 존재 : ectomycorr 2ω6,9 적절하게 나타낼 수 2ω6,9 자주 C18와 함께 발생합니다 1ω9 또한 C18이 있음을 나타냅니다 곰팡이 스테롤 에르고 스테롤, 잘 상관 관계hizae 및 잡균 곰팡이 38. 트라이 – 불포화 C18 : 3ω 6,9,12은 곰팡이 (10)에 대한 바이오 마커로 사용되었다; 그러나, C18 : 그것은 일반적으로 박테리아에서 발견되지 않는다 3ω6c는 식물 및 조류를 포함하는 다른 진핵 생물에서 찾을 수있다. 토양 원생 생물의 용어에서, C20 : 다른 작업이 C20를 검출하는 데 실패,하지만 4ω6c는 원생 생물의 바이오 마커 (39)로 인식되었습니다 가능한 원생 생물 집단이 광학 현미경 (40)를 사용하여 시각적으로 확인되었다에도 4ω6c.
많은 연구는 PLFA 데이터 분석 도구로 다변량 조정 기술을 이용하여 전체 토양 미생물 커뮤니티 관련 생태 질문 다룬다. 이 방법을 사용할 때, 몇몇 저자가 시료 (4)의 5 % 미만으로 존재 PLFAs를 제거하여 데이터 세트에서 희귀 PLFAs 제외하도록 선택했습니다. 일반 포화 C16 : 0, C18 : 0 원핵 생물과 EUK을 포함한 모든 토양 미생물에 풍부aryotes. 따라서, 일부 연구자들은 이전에 그들이 토양 미생물 커뮤니티의 구성의 민감한 지표하지 않을 수 기준으로 통계 분석이 PLFAs을 제거 할 수 – 비록 C16 : 0, C18 : 0의 모든 PLFAs를 합산 할 때 포함되어야 여전히 미생물 바이오 매스의 인덱스입니다. 이 기술은 일반적으로 33을 배포 할 수 없습니다 데이터에 적합으로 통계 분석의 용어, 많은 연구자들은 비 통계 다차원 스케일링 (NMDS) 조정을 수행하기 위해 선택합니다. 범주 형 변수와 관련된 자세한 분석은 범주 그룹에 할당 된 미생물 지역 사회 사이의 유사성이나 차이점을 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다 범주 그룹 및 다중 응답 순열 절차 (MRPP)에 특정 PLFAs의 발생을 관련시킬 수 지표 종 분석을 포함 할 수있다. 또한, 다 변수 회귀 나무 (MRT)이 특히 유용 할 수있을 때 여러 실험 변수의 영향 또는치료 가능한 설명 변수 (5)로 평가 될 필요 (예를 들면, 토양 질감, 습도, 교정 나이).
확립되면 PLFA 프로토콜 환경 변화 인위적 교란 토양 미생물 반응을 정량 할 때 매우 유용 할 수있는 비교적 간단한 분석 방법이다. 이러한 유전자 지문 분자 기법 미생물 군집의 상세한 특성에 더 적합하지만, PLFA 방법은 총 미생물 바이오 매스 (34)에 정량의 정보를 제공하는 장점을 제공한다. 우리의 연구 실험실에서 한 사람이 편안하게 사일에 걸쳐 20 샘플 세트를 처리 할 수 있습니다, 우리는 토양의 생물학적 품질을 평가하는 강력하고 재현 기술이 될 여기에 제시된 프로토콜을 발견했다.
PLFA 방법의 힘은 매우 안정 동위 원소 분석 41 (42)에 연결함으로써 확장 될 수있다. 특히, 부가 O를F 토양에 13 C 표지 기판 토양 미생물에 기판 통합의 정량화를 허용 개별 PLFAs (41)의 동위 원소 분석하지만. 또한,이 방법은 토양 먹이 사슬 42 영양 링크를 규명하는 도구 매우 유망한 것으로 보인다.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was financed in part by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada. The authors acknowledge Jela Burkus, Donna Macey, and Jennifer Lloyd for their technical expertise and their contribution to the optimization of this method.
Materials
| Pierce Reacti-Vap III-evaporator gassing manifold with 27 ports | Used in Steps 1-3 | ||
| Compressed Nitrogen | Praxair | Ni-T | Dangerous: Use only after training and minimize contact and use; Used in Steps 1-3 |
| Disposable centrifuge tube and Teflon-lined cap | Fisher Scientific | 05-569-3 | Used for Step 1 (1 per sample) and Step 2 (1 per sample) |
| Disposable glass long-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | Used for Step 1 (2 per sample) |
| Disposable glass short-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-4 | Used for Step 2 (1 per sample), Step 3 (1 per sample), GC analysis (1 per sample),, and one for each type of solution dispensed during PLFA methods (~10 per batch of samples) |
| Elastic band | Grand & Toy | 42199 | 1 per sample for freeze drying |
| Freeze Dryer-Labconco 7806002 and 7753000 | Used for preparing samples for PLFA analysis – use whatever model your lab has | ||
| Freezer (-20 °C, -80 °C) | Revco | ULT2586-5-A36 | Minus 80 °C is used for freezing freshly collected soil samples, -20 °C is used for storing samples at end of each of 3 steps of PLFA analysis |
| Gas chromatograph – Agilent 6890 Series capillary gas chromatograph (GC;, Wilmington, DE) equipped with a 50 m Ultra 2 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane column | Agilent Technologies | Used for GC analysis, other models of GC could also be used (1 needed) | |
| Analytical column | Agilent Technologies | 19091B-105 | |
| Gas chromatograph insert | Agilent Technologies | 5183-4692 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| Gas chromatograph vial and lid | Agilent Technologies | 5188-6592 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| Hexanes | Fisher Scientific | H292-4 | Hazardous: use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 4 ml (2.0 ml + 2.0 ml (step 3) |
| Hot water bath -Isotemp 220 | Fisher Scientific | Used for Step 3 (1 per batch of samples) | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-2 | Used for freeze drying samples |
| KOH, ACS grade | Fisher Scientific | P250-500 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Used for making citrate buffer (used in Step 1) and methanolic KOH (step 3) |
| Lab quake end-over-end shaker for centrifuge tubes | Barnstead/Thermolyne | 3,625,485 | Used for Step 1 (1 per batch of samples of appropriate holding capacity) |
| MeC10:0 methyl decanoate internal standard | Sigma-Aldrich | 299030-2.5G | Used for GC analysis |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 15.5 ml (5 ml + 5 ml (step 1) + 5 ml (step 2) + 0.5 ml (step 3)) |
| MIDI Peak Identification Software | MIDI, Inc., Newark, DE | Used for interpreting GC analysis output | |
| MIDI Calibration Standard Mix for Microbial Identification System | Lab Sphere Inc | 1200-A | Used as a Calibration mix for TSBA 40 |
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | 27-058-52 | Used always when conducting PLFA lab work |
| pH Meter – Accumet XL200 | Fisher Scientific | Used for making citrate buffer | |
| Pipette (0.2 – 2 ml)- Socorex -Calibra Digital 832 Macropipette | Socorex | 832.02 | Used throughout Steps (1 per sample) |
| 250 µL gastight syringe | Hamilton | 1725 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| silver shield gloves | Sigma-Aldrich | Z529575 | For use when handling chloroform |
| solid phase extraction (SPE) column | Agilent Technologies | 5982-2265 | Used for Step 2 (1 per sample) |
| SPE glass column holder with spigots and vacuum apparatus attached | Sigma-Aldrich | Used for Step 2 (1 per batch of samples) | |
| Vortex – Barnstead International Maxi Mix II- M37615 | Barnstead International | M37615 | Used in Steps 1-3 |
| Water - ultra-pure and Chromosolv HPLC grade | Sigma-Aldrich | 270733-4L | Used throughout analysis |
| Whirl-Pak® bags | Fisher Scientific | 01-812-120 | Used in sample collection – 2 bags required per sample collected |
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