הפקה וניתוח של פוספוליפידים מיקרוביאלית חומצות שומן בקרקעות
Summary
חומצות שומן פוספוליפידים לספק מידע על המבנה של קהילות חיידקי אדמה. אנו מציגים שיטות חילוץ מתוך דגימות קרקע בתערובת כלורופורם חד פאזיים, חלוקה של שומני חילוץ באמצעות עמודות מיצוי שלב מוצק, methanolysis לייצר אסטרים מתיל חומצות שומן, אשר מנותחים על ידי גז כרומטוגרפיה נימים.
Abstract
חומצות שומן פוספוליפידים (PLFAs) הם רכיבי מפתח של קרום התא של חיידקים. ניתוח PLFAs מופק קרקעות יכול לספק מידע על המבנה הכללי של קהילות מיקרוביאלי יבשתיות. פרופיל PLFA כבר נעשה שימוש נרחב במגוון של מערכות אקולוגיות כמדד ביולוגי של איכות קרקע הכולל, כאינדיקטור כמוני תגובת אדמה לנחות וניהול ולחצים סביבתיים אחרים.
הגישה הסטנדרטית המוצג כאן מתארת ארבעה שלבים עיקריים: 1. מיצוי שומנים מן דגימות קרקע בתערובת כלורופורם חד פאזיים, חלוקה 2. באמצעות עמודות מיצוי שלב מוצק לבודד פוספוליפידים מן שומני חילוץ אחרים, 3. methanolysis של פוספוליפידים לייצר חומצת שומן אסטרים מתיל (fames), ו -4 ניתוח FAME ידי גז כרומטוגרפיה נימים באמצעות גלאי יינון להבה (GC-FID). שני התקנים משמשים, כולל 1,2-dinonadecanoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (PC (19:0/19: 0)) כדי להעריך את ההתאוששות הכוללת של שיטת חילוץ, decanoate מתיל (MeC10: 0) כסטנדרט פנימי (ISTD) לניתוח GC.
Introduction
חומצות שומן פוספוליפידים (PLFAs) הם חלק של קרום התא של חיידקים מן חיידקים תחומים Eukarya. מיקרואורגניזמים לייצר PLFAs באורכי שרשרת שונים ורכב כאמצעי לשמור על שלמות תא קרום ותפקוד הסלולר בתגובה לתנאי הסביבה המיידית שלהם; ומכאן ניתן לטעון כי קהילות מיקרוביאלי כי הם מופרדים גיאוגרפית אלא כפופים לתנאי הקרקע דומה יביע PLFAs דומה. PLFAs קרקע עם אורך שרשרת בין 14 ו -20 אטומי C נחשב בדרך כלל להיות ממוצא חיידקים ופטריות בעיקר 1. בתרבויות מעורבות, ניתוח PLFA לא יכול לשמש לזיהוי מינים של חיידקים בודדים, אבל זה יכול לספק טביעת אצבע כוללת של קהילות חיידקים נמצאות באדמה. בנוסף, מאז PLFAs מפורק במהירות על מוות של תאים, הם יכולים להיחשב נציג של קהילת החיידקים בקרקע קיימא 2. tec זהhnique כבר נעשה שימוש נרחב כדי לאפיין את ההרכב המבני של קהילות חיידקים למצוא מגוון רחב של סביבות, החלו יערות 3-4 כדי Prairies 5-6 ושדות חקלאיים 7. זה כבר מיושם בהצלחה באפיון בתגובה אדמה לנחות שינויים בהנהלה, כולל יער ברור חיתוך 8 לסיד 9, טיוב 10-12, כמו גם הפרעות כגון אש 13, זיהום על ידי מתכות 14 ופחמימנים 15, ו -16 פרוץ חרקים .
שיטת האנליטית העכשווית PLFA התפתחה במהלך ששת העשורים האחרונים דרך התקדמות מרכזית על ידי מספר קבוצות מחקר. בשנת 1958, שיפור משמעותי נבע התאמת כלורופורם: מתנול: יחס מים בתמיסת החילוץ להעביר את התערובת מן monophasic למערכת diphasic 17. מיצוי השומנים אופטימיזציה זה ואת פרו בידוד המתוקןtocol נודע כשיטת בליי דייר. פרוטוקול אומצה על ידי מעבדות רבות בעשורים הקרובים, במהלך הזמן הזה, הלבן ועמיתיו תרמו שיפורים משמעותיים לשיטה; למשל, הם שיפרו את הצעד החילוץ על ידי החלפת חיץ פוספט למים, והם אופטימיזציה הניתוח על ידי גז כרומטוגרפיה (GC) באמצעות הזדהות השיא משופרת וכימות. אולי רלוונטי יותר מדעי קרקע, הם קבעו ב -1979 כי שומני החילוץ יכולים לשמש כמדד מבנה מיקרוביאלי כאשר הם בחנו את ביומסה מיקרוביאלית של משקעים ימיים 18.
התפתחויות נוספות שחלו בשנת 1980 כשיטה הפכה מנוצלת באופן נרחב יותר מדעי קרקע, במיוחד ביחס rhizosphere 19. באותו זמן, השיטה כללה מהתיל nonadecanoate (MeC19: 0) כסטנדרט פנימי 19 ושימוש טור חומצת silicic עבור חלוקת שומנים 21 </ Sup>. בעקבות עבודתו עם לבן 19,21, Tunlid חזר לשבדיה והחל מחקר משותף עם הבעת ו Frostegård. בחינת היעילות של מאגרי מיצוי שונים עבור חבילה של קרקעות הנבדלים בתכולת חומר אורגנית, הקבוצה הראתה כי חיץ ציטראט הגדיל את כמות הפוספט שומני חילוץ בהשוואה למאגר פוספט 22. יתר על כן, פרסומן 1993 23 על ההשפעה לסייד על קהילות חיידקי אדמה המשיך להיות קלסי ציטוט בביולוגית קרקע & ביוכימיה 24. החוקרים ניצלו ניתוח מרכיבים ראשיים בעיבוד הנתונים שלהם. ניתוח PLFA, כשיטה נקראת עכשיו, מייצר ערכות נתונים גדולות ושימוש נהלים סטטיסטיים רב משתנים לעבד נתונים אלה היה מאוד חדשני בפעם ומעוררת השראה לרבים. בד בבד עם העבודה הנעשית בשוודיה, שינויים בהליך PLFA נחקרים בגרמניה על ידי Zelles ועמיתיו 25-26. גרסתם של ההליך בלטה לשימושו של טור מיצוי מוצק שלב (SPE) במקום בעמודת silicic החומצה אבל, באופן כללי, הייתה יותר במעבדה אינטנסיבית.
23 הנייר של Frostegård, יחד עם מתודולוגיה מפורטת על ידי White & Ringelberg 27, היווה את בסיס פיצוץ השימוש בטכניקת PLFA לחקור שאלות יסוד במדע קרקע. מאז, ליטושים נוספים של שיטת פיירסטון ועמיתיו כללו הוספת תקן GC פנימי (C10: 0) ו C19: 0 כסטנדרט פונדקאי כדי לשפר כימות 28, ו החלפת השימוש separatory משפכים עבור צלוחיות תחתיות עגולות לפשט מיצוי 29. לאחרונה, Chowdhury ודיק 30 נחקר הצעד מתילציה דיווח כי שני ההליכים מתילציה בשימוש בספרות מדעי האדמה את הזיהוי בשיטה KOH / MeOHified מגוון של חומצות שומן גדול.
השיטה המוצגת מבוססת במידה רבה על השיטה המקורית שפותחה על ידי בליי דאייר, ומשלבת את השינויים שהוזכרו לעיל, כגון השימוש של KOH methanolic עבור שלב מתילציה. שני התקנים משמשים עבור כל דגימה: סטנדרט פונדקאי של 1,2-dinonadecanoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (PC (19: 0/19: 0)), אשר מתווסף דגימת הקרקע לפני החילוץ הראשון כדי להעריך את היעילות ואת ההתאוששות של הפרוטוקול כולו, ועל תקן מכשיר של decanoate מתיל (MeC10: 0), אשר מתווסף לפני זיהוי וכימות ידי GC.
אנו מכירים כי שיטת PLFA היא נפוצה על ידי מעבדות אקולוגיה מיקרוביאלית רבות ברחבי עולם, הועדה פעמים רבות, לרבות על ידי ארגון התקינה הבינלאומי 2. מטרת מאמר זה היא להציג פרוטוקול קל לעקוב ויציב שיכול להיות שימושי קרקעמדענים שמנסים ללמוד את טכניקת PLFA.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי למזער ולמנוע פרשנות שגויה של נתוני PLFA, הקרנת נתונים זהירה חייבת להיעשות, כי כמה PLFAs הנמצאים בקהילה אדמה החיידקים נמצא גם באורגניזמים איקריוטיים יחידים רבים-תאיים, כגון שורשי צמח, אצות, ובעלי חיים באדמה. בנוסף, קדומים אינם מכילים PLFAs; במקום, מורכבות ממברנות archaeal של שומנים אתר פוספוליפידים (PLELs). כתוצאה מכך, פרוטוקול PLFA לא יכול לשמש כדי לאפיין קהילות archaeal באדמה.
שיוך PLFAs פרט לקבוצות חיידקים ספציפיים יש להימנע ממתן בזהירות (ראה פרסום 2011 על ידי Frostegård ועמיתיו 34 עבור דיון מעולה של כמה מן המגבלות של שיטת PLFA). במקום זאת, הוא עשוי להיות מתאים יותר, כפי שנעשה באיור 2, לקבוצה PLFAs מבוסס על המבנה הכימי שלהם, למשל, אני) ישר ב"שרשרת PLFAs רווי, ii) PLFAs רווי אמצע צ'איn (10-מתיל) הסתעפות, iii) חומצות שומן רוויות קנים סופני, iv) בלתי רווי PLFAs, v) PLFAs רב בלתי רווי, ו- VI) חומצות שומן הידרוקסי.
משקל לדוגמא ייתכן שיהיה צורך מותאם על בסיס כמות PLFAs שניתן להפיק כלול דגימת אדמה נתונה. בכך שלא התאמת כמות קרקע חילוץ בקרקעות פעילות פחות microbially, משתמשים נמצאים בסיכון לא קבל מספר מספיק של תגובות PLFA (פסגות) לייצג את קהילת חיידקים באופן מדויק. בקרקעות מאוד microbially פעילים עם ריכוזים גבוהים של PLFAs, משתמשים נמצאים בסיכון של עומס יתר על עמודת GC, ובכך למנוע כימות מדויק של PLFAs. בשני המקרים, דגימות קרקע חייבות להיות מחדש נתחו עבור PLFAs. נקודת התחלה טובה היא להוסיף 0.5 גרם במשך דגימות קרקע אורגניות (כגון קומות יער), וכ -3 G עבור דגימות קרקע מינרליים. כיוון שכמות ה PLFAs שניתן להפיק בדרך כלל מתואמים עם כמות הפחמן האורגני הכלול אנו אדמה, מדגםight יכול להיות מותאם על בסיס תוכן הפחמן בקרקע; למשל, 1 גרם של דגימת קרקע מינרליים עשוי להיות מספיק כדי לקבל כימות טוב PLFA כאשר תוכן פחמן הוא 10-15%, בעוד> 5 גרם עשוי להיות נחוץ אם תוכן פחמן הוא ≤ 0.5 %. זה תמיד רעיון טוב לעשות משפט לרוץ עם כמה דוגמאות כדי לייעל משקל מדגם לפני הסט כולו מנוהל.
אסטרטגיות לפתרון בעיות נפוצות עבור פרוטוקול PLFA וניתוח GC הן כדלקמן. אם בסיס הכרומתוגרמה GC הוא גבוה מדי, בלון גז H 2 צריך להיות שונה. אם הפסגות הממסות או ISTD נעדרות מן הכרומתוגרמה, ייתכן שיש בעיה עם הזרקה מדגמת (למשל, מחובר מזרק, בעיה עם autosampler, בקבוקון ריק או חסר, שגיאה עם מיצוב בקבוקון). אם יותר משלוש פסגות מזוהות את חסר שיטה / מדגם, יש זיהום של ריק, ויש סבירות גבוהה כי באותו חומר מזהם (ים) יהיה נוכח ג GC מדגםhromatograms. מצא מקור הזיהום (בדרך כלל תקשורת מימית), או לכל הפחות, להבטיח כי הפסגות המתאימות המזהם יוסרו מן chromatograms מדגם וכי הפסגות האלה אינן כלולים בכל ניתוח סטטיסטי של נתוני PLFA. כמו כן, זה רעיון טוב כדי להפעיל הקסאן בשטיפות בין דגימות כאשר לשאת על פי החשד. פסגות נוספות שטיפת הקסאן תציינה carry-over (כלומר, רכיבים כבדים משחררים מהפעלה קודמת).
ליפידים הם רגישים במיוחד לחמצון, וטיפול בפרט צריך להיות מופעל ברחבי הפרוטוקול כדי להגן דגימות מחשיפת האוויר ואור, כגון אחסונם בחושך ולשמור אותם תחת חנקן. כל הדגימות ואת החסר חייבות להיות C19 מספיק: 0 סטנדרטי פונדקאי. C19 חסר: 0 שיא, בין אם דגימות או חסר, מצביע על התאוששות עניה או אובדן מוחלט של analytes. תגובה של C19: 0 בדגימות כי הוא נמוך משמעותית מחסר ethod / מדגם מצביע על פסד של analytes בשלב כלשהו המתודולוגיה PLFA. כאשר הוא מתמודד עם C19 עניים: 0 התאוששות, כל ההיבטים של התהליך צריך להישקל בזהירות ובחן כולל החילוץ הראשוני, בכל שלבי העברת מדגם, מיצוי SPE, מתילציה חומצת שומן, ייבוש, אחסון ומניפולציה מדגם על מנת לבודד את שלב או שלבים שבהם analytes אובדים. מצד השני, ייתכן כי החילוץ של כמה דגימות קרקע עשוי להניב C19: 0, שבו התאוששות במקרה של ההתקן הפונדקאי ניתן להפריז. בעת השימוש שני התקנים ((PC (19: 0/19: 0) ו MeC10: 0) אינה דרישה מוחלטת, שמצאנו זה להיות מאוד שימושי כאשר הזקוקים לפתרון כל עוד MeC10:. 0 בתגובה היא נאותה פתרון בעיות, יכול להתמקד על המדרגות לפני ניתוח GC.
כפי שצוין קודם לכן, יש להיזהר בשימוש כאשר לפרש יחסי משמעות אקולוגיים אקולוגיים המבוסס אך ורק על ביומרקרים לגזורד מנתונים PLFA, מכיוון שמחקרי תרבות טהורים עולים כי זני חיידקים בודדים יכילו קטגוריות שונות של PLFAs. במקום זאת, PLFAs סמן הביולוגי יש להשקיף כעל תוספת שימושית בסוויטה של ראיות כאשר הסקת מסקנות אקולוגיות רחבות. בספרות, PLFAs פרט הוצע מנוצל כסמנים ביולוגיים לקבוצות חיידקים שונות. PLFAs רווי בדרך כלל משמשים לייצוג חיידקים גראם-חיוביים בלתי רווי PLFA משמשים חיידקים גראם שליליים. ביומרקרים מוכר חיידקים גרם שליליים כוללות בלתי רווי חומצות שומן עם unsaturation בבית ω5 או העמדה ω7, כגון C16: 1ω7, C18: 1ω7, ו C18: 1ω5. בנוסף, חומצות שומן cyclopropyl יכולות להיות גם נציג של חיידקים גראם שלילי 35. לפיכך, PLFAs מחיידקים גראם שליליים ניתן לחשב את שווה לסכום של A: 1ω5 + A: 1ω7 + A: 0cyclo. ביומרקרים מוכר חיידקים חיוביים גרם הם מסועף סופני saחומצות שומן turated, קנים iso כגון C15: 0i, C16: 0i, C17: 0i; או anteiso קנים, כגון C15: 0a ו C17: 0a. רוויי PLFAs עם שרשרת באמצע (10-מתיל) הסתעפות, כגון 10Me16: 0 ו 10Me18: 0 נוכחים אופייניים ב actinomycetes 36. לפיכך, PLFAs מ חיידקים גראם חיוביים ניתן לחשב את שווה לסכום של A: 0 (ISO, ANTEISO, 10-מתיל).
סמנים ביולוגיים רבים הקשורים פטרייתי PLFA הם רבים בלתי רוויים לעתים קרובות, אבל כמה סמנים ביולוגי פטרייתיים בלתי רוויים. למשל, במונחים של סמנים ביולוגיים בלתי רווי פטרייתי, C16: 1ω5 זוהה כאינדיקטור של פטריות מיקוריזה arbuscular (AMF) 37, C18: 1ω9 נפוץ פטריות saprophytic, ו ectomycorrhizae בדרך כלל מכילים C16: 1ω9. הנוכחות של C18 בלתי רווי-די: 2ω6,9 מתרחשת לעתים קרובות בשילוב עם C18: 1ω9 וגם וקושר היטב עם ergosterol sterol פטרייתי, דבר שמצביע על כך C18: 2ω6,9 מספק יכול לייצג ectomycorrhizae ופטריות saprophytic 38. C18 תלת-בלתי רוויות: 3ω 6,9,12 שימש גם בתור סמן ביולוגי פטריות 10; עם זאת, C18: 3ω6c ניתן למצוא אורגניזמים איקריוטיים אחרים כולל צמחים ואצות, אם כי בדרך כלל לא נמצא חיידקים. בקדנציה של הפרוטיסטים אדמה, C20: 4ω6c הוכר ביומרקר לפרוטיסטים 39, אם כי, עבודה אחרת לא הצליחו לאתר C20: 4ω6c גם כאשר אוכלוסיות לפרוטיסטים קיימא אוששו באמצעות מיקרוסקופ אור ויזואלית 40.
מחקרים רבים להתייחס לשאלות אקולוגיות הקשורות קהילת חיידקי אדמה הכוללת ידי ניצול טכניקות סמיכות רב משתנה ככלי ניתוח נתוני PLFA. בעת השימוש בגישה זו, חלק מהחברים בחרו שלא לכלול PLFAs נדירה מן הנתונים על ידי הסרת PLFAs שנמצא בתוך פחות מ -5% מהדגימות 4. המרווה הרגילה C16: 0 ו C18: 0 נמצאת בשפע בכל מיקרואורגניזמים באדמה, כולל פרוקריוטים ו eukaryotes. לפיכך, כמה חוקרים לבחור להסיר PLFAs אלה לפני ניתוח סטטיסטי על הבסיס זה יכולים להיות שהם לא אינדיקטורים רגישים של רכב קהילת חיידקי אדמה – אם כי C16: 0 ו C18: 0 עדיין להיכלל כאשר סיכום כל PLFAs עבור אינדקס של ביומסה מיקרוביאלי. בקדנציה של ניתוחים סטטיסטיים, חוקרים רבים בוחרים לערוך שינוי גודל רב ממדי הלא מטרי (NMDS) סמיך כמו טכניקה זו היא גם מתאימה לנתונים אין להפיץ בדרך כלל 33. ניתוחים נוספים הקשורים משתנה קטגורים יכולים לכלול ניתוח מיני מחוון, אשר יכול להתייחס קרות PLFAs הספציפי קבוצות קטגורים ונהלי תמורת תגובה רבות (MRPP), אשר יכול לעזור לקבוע דמיון או שוני בין קהילות חיידקים שהוקצו לקבוצות קטגורים. בנוסף, עצי רגרסיה מרובים משתנים (MRT) יכולים להיות שימושיים במיוחד כאשר ההשפעה של משתנים ניסיוניים מרובים אוטיפולים צריכים להיבחן כמשתני פוטנציאל הסבר 5 (למשל, קרקע מרקם, לחות, גיל טיוב).
לאחר שהוקם, פרוטוקול PLFA הוא שיטה אנליטית יחסית פשוטה שיכול להיות מאוד שימושי כאשר לכימות בתגובת חיידקי אדמה לשינויים סביבתיים והפרעות אנתרופוגניים. בעוד בטכניקות מולקולריות כגון טביעת אצבע גנטית מתאימות יותר האפיון המפורט של קהילות מיקרוביאלי, שיטת PLFA מציגה את היתרון של מתן מידע כמוני על ביומסה חיידקים הכוללת 34. במעבדת המחקר שלנו, אדם אחד יכול לעבד סט בנוחות של 20 דגימות מ -4 ימים, מצאנו את הפרוטוקול המובא כאן כדי להיות טכניקה חזקה לשחזור להעריך את איכות קרקע ביולוגית.
כוחה של השיטה PLFA ניתן להרחיב באופן משמעותי על ידי צימוד זה ניתוח איזוטופ יציב 41, 42. באופן ספציפי, בנוסף of 13 מצעים שכותרתו C קרקעות מאפשרים כימות התאגדות מצע לתוך מיקרואורגניזמים באדמה אף ניתוח איזוטופי של PLFAs פרט 41. בנוסף, שיטה זו נראה כי כלי מבטיח מאוד להבהיר קישורים trophic ברשתות מזון אדמה 42.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was financed in part by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada. The authors acknowledge Jela Burkus, Donna Macey, and Jennifer Lloyd for their technical expertise and their contribution to the optimization of this method.
Materials
| Pierce Reacti-Vap III-evaporator gassing manifold with 27 ports | Used in Steps 1-3 | ||
| Compressed Nitrogen | Praxair | Ni-T | Dangerous: Use only after training and minimize contact and use; Used in Steps 1-3 |
| Disposable centrifuge tube and Teflon-lined cap | Fisher Scientific | 05-569-3 | Used for Step 1 (1 per sample) and Step 2 (1 per sample) |
| Disposable glass long-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | Used for Step 1 (2 per sample) |
| Disposable glass short-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-4 | Used for Step 2 (1 per sample), Step 3 (1 per sample), GC analysis (1 per sample),, and one for each type of solution dispensed during PLFA methods (~10 per batch of samples) |
| Elastic band | Grand & Toy | 42199 | 1 per sample for freeze drying |
| Freeze Dryer-Labconco 7806002 and 7753000 | Used for preparing samples for PLFA analysis – use whatever model your lab has | ||
| Freezer (-20 °C, -80 °C) | Revco | ULT2586-5-A36 | Minus 80 °C is used for freezing freshly collected soil samples, -20 °C is used for storing samples at end of each of 3 steps of PLFA analysis |
| Gas chromatograph – Agilent 6890 Series capillary gas chromatograph (GC;, Wilmington, DE) equipped with a 50 m Ultra 2 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane column | Agilent Technologies | Used for GC analysis, other models of GC could also be used (1 needed) | |
| Analytical column | Agilent Technologies | 19091B-105 | |
| Gas chromatograph insert | Agilent Technologies | 5183-4692 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| Gas chromatograph vial and lid | Agilent Technologies | 5188-6592 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| Hexanes | Fisher Scientific | H292-4 | Hazardous: use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 4 ml (2.0 ml + 2.0 ml (step 3) |
| Hot water bath -Isotemp 220 | Fisher Scientific | Used for Step 3 (1 per batch of samples) | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-2 | Used for freeze drying samples |
| KOH, ACS grade | Fisher Scientific | P250-500 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Used for making citrate buffer (used in Step 1) and methanolic KOH (step 3) |
| Lab quake end-over-end shaker for centrifuge tubes | Barnstead/Thermolyne | 3,625,485 | Used for Step 1 (1 per batch of samples of appropriate holding capacity) |
| MeC10:0 methyl decanoate internal standard | Sigma-Aldrich | 299030-2.5G | Used for GC analysis |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 15.5 ml (5 ml + 5 ml (step 1) + 5 ml (step 2) + 0.5 ml (step 3)) |
| MIDI Peak Identification Software | MIDI, Inc., Newark, DE | Used for interpreting GC analysis output | |
| MIDI Calibration Standard Mix for Microbial Identification System | Lab Sphere Inc | 1200-A | Used as a Calibration mix for TSBA 40 |
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | 27-058-52 | Used always when conducting PLFA lab work |
| pH Meter – Accumet XL200 | Fisher Scientific | Used for making citrate buffer | |
| Pipette (0.2 – 2 ml)- Socorex -Calibra Digital 832 Macropipette | Socorex | 832.02 | Used throughout Steps (1 per sample) |
| 250 µL gastight syringe | Hamilton | 1725 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| silver shield gloves | Sigma-Aldrich | Z529575 | For use when handling chloroform |
| solid phase extraction (SPE) column | Agilent Technologies | 5982-2265 | Used for Step 2 (1 per sample) |
| SPE glass column holder with spigots and vacuum apparatus attached | Sigma-Aldrich | Used for Step 2 (1 per batch of samples) | |
| Vortex – Barnstead International Maxi Mix II- M37615 | Barnstead International | M37615 | Used in Steps 1-3 |
| Water - ultra-pure and Chromosolv HPLC grade | Sigma-Aldrich | 270733-4L | Used throughout analysis |
| Whirl-Pak® bags | Fisher Scientific | 01-812-120 | Used in sample collection – 2 bags required per sample collected |
Referências
- Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biol. Fert. Soils. 29, 111-129 (1999).
- Swallow, M. J. B., Quideau, S. A. Moisture effects on microbial communities in boreal forest floors are stand-dependent. Appl. Soil Ecol. 63, 120-126 (2012).
- McIntosh, A. C. S., Macdonald, S. E., Quideau, S. A. Linkages between the forest floor microbial community and resource heterogeneity within mature lodgepole pine forests. Soil Biol. Biochem. 63, 61-72 (2013).
- Card, S. M., Quideau, S. A. Microbial community structure in restored riparian soils of the Canadian prairie pothole region. Soil Biol. Biochem. 42, 1463-1471 (2010).
- McKinley, V. L., Peacock, A. D., White, D. C. Microbial community PLFA and PHB responses to ecosystem restoration in tallgrass prairie soils. Soil Biol. Biochem. 37, 1946-1958 (2005).
- Bossio, D. A., Scow, K. M., Gunapala, N., Graham, K. J. Determinants of soil microbial communities: effects of agricultural management, season, and soil type on phospholipid fatty acid profiles. Microbial Ecol. 36, 1-12 (1998).
- Hannam, K. D., Quideau, S. A., Kishchuk, B. E. Forest floor microbial communities in relation to stand composition and timber harvesting in northern Alberta. Soil Biol. Biochem. 38, 2565-2575 (2006).
- Pettersson, M., Bååth, E. The rate of change of a soil bacterial community after liming as a function of temperature. Microbial Ecol. 46, 177-186 (2003).
- Degrood, S. H., Claassen, V. P., Scow, K. M. Microbial community composition on native and drastically disturbed serpentine soils. Soil Bio.l Biochem. 37, 1427-1435 (2005).
- Quideau, S. A., Swallow, M. J. B., Prescott, C. E., Grayston, S. J., Oh, S. -. W. Comparing soil biogeochemical processes in novel and natural boreal forest ecosystems. Biogeosciences. 10, 5651-5661 (2013).
- Hahn, A. S., Quideau, S. A. Long-term effects of organic amendments on the recovery of plant and soil microbial communities following disturbance in the Canadian boreal forest. Plant Soil. 363, 331-334 (2013).
- Swallow, M., Quideau, S. A., MacKenzie, M. D., Kishchuk, B. E. Microbial community structure and function: The effect of silvicultural burning and topographic variability in northern Alberta. Soil Biol. Biochem. 41, 770-777 (2009).
- Pennanen, T. Microbial communities in boreal coniferous forest humus exposed to heavy metals and changes in soil pH-a summary of the use of phospholipid fatty acids. Biolog (R) and H-3-thymidine incorporation methods in field studies. Geoderma. 100, 91-126 (2001).
- Margasin, R., Hämmerle, M., Tscherko, D. Microbial activity and community composition during bioremediation of diesel-oil-contaminated soil: effects of hydrocarbon concentration, fertilizers, and incubation time. Microbial Ecol. 53, 259-269 (2007).
- Štursová, M., Šnajdr, J., Cajthaml, T., Bárta, J., Šantrůčková, H., Baldrian, P. When the forest dies: the response of forest soil fungi to a bark beetle-induced tree dieback. ISME J. 8, 1920-1931 (2014).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction. Can. J. Biochem. Phys. 37, 911-917 (1959).
- White, D. C., Davis, W. M., Nickels, J. S., King, J. D., Bobbie, R. J. Determination of the sedimentary microbial biomass by extractible lipid phosphate. Oecologia. 40, 51-62 (1979).
- Tunlid, A., Hoitink, H. A. J., Low, C., White, D. C. Characterization of bacteria that suppress Rhizoctonia damping-off in bark compost media by analysis of fatty acid biomarkers. Appl. Environ. Microb. 55, 1368-1374 (1989).
- Bobbier, J., White, D. C. Characterization of benthic microbial community structure by high resolution gas chromatography of fatty acid methyl esters. Appl. Environ. Microb. 39, 1212-1222 (1980).
- Tunlid, A., et al. Determination of phospholipid ester-linked fatty acids and poly P-hydroxybutyrate for the estimation of bacterial biomass and activity in the rhizosphere of the rape plant Brassica napus (L.). Can. J. Microbiol. 31, 1113-1119 (1985).
- Frostegård, A., Tunlid, A., Bååth, E. Microbial biomass measured as total lipid phosphate in soils of different organic content. J. Microbiol. Meth. 14, 151-163 (1991).
- Frostegård, &. #. 1. 9. 7. ;., Bååth, E., Tunlid, A. Shifts in the structure of soil microbial communities in limed forests as revealed by phospholipid fatty acid analysis. Soil Biol. Biochem. 25, 723-730 (1993).
- Burns, R. G. Soil Biology and Biology Citation Classic X. Soil Biol. Biochem. 43, 1619-1620 (2011).
- Zelles, L., Bai, Q. Y., Beck, T., Beese, F. Signature fatty acids in phospholipid and lipopolysaccharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils. Soil Biol. Biochem. 24, 317-323 (1992).
- Zelles, L., Bai, Q. Y. Fractionation of fatty acids derived from soil lipids by solid phase extraction and their quantitative analysis by GC-MS. Soil Biol. Biochem. 25, 495-507 (1993).
- White, D. C., Ringelberg, D. B., Burlage, R. S., Atlas, R., Stahl, D., Geesey, G., Sayler, G. Signature lipid biomarker analysis. Techniques in Microbial Ecology. , 255-272 (1998).
- Bird, J. A., Herman, D. J., Firestone, M. K. Rhizosphere priming of soil organic matter by bacterial groups in a grassland soil. Soil Biol. Biochem. 43, 718-725 (2011).
- Waldrop, M. P., Firestone, M. K. Microbial community utilization of recalcitrant and simple carbon compounds: impact of oak-woodland plant communities. Oecologia. 138, 275-284 (2004).
- Chowdhury, T. R., Dick, R. P. Standardizing methylation method during phospholipid fatty acid analysis to profile soil microbial communities. J. Microbiol. Meth. 88, 285-291 (2012).
- Buyer, J. S., Sasser, M. High throughput phospholipid fatty acid analysis of soils. Appl. Soil Ecol. 61, 127-130 (2012).
- Christie, W. W., Han, X. Gas chromatographic analysis of fatty acid derivatives. Lipid analysis, isolation, separation, identification, and lipidomic analysis. , 159-180 (2010).
- McCune, B., Grace, J. B. . Analysis of ecological communities. , 300 (2002).
- Frostegård, A., Tunlid, A., Bååth, E. Use and misuse of PLFA measurements in soils. Soil Biol. Biochem. 43, 1621-1625 (2011).
- Högberg, M. N., Högberg, P., Myrold, D. D. Is microbial community composition in boreal forest soils determined by pH, C-to-N ratio, the trees, or all three. Oecologia. 150, 590-601 (2007).
- Brennan, P., Ratledge, C., Wilkinson, S. Mycobacterium and other actinomycetes. Microbial Lipids. , 203-298 (1988).
- Olsson, P. A. Signature fatty acids provide tools for determination of the distribution and interactions of mycorrhizal fungi in soil. FEMS Microbiol. Ecol. 29, 303-310 (1999).
- Frostegård, &. #. 1. 9. 7. ;., Bååth, E. The use of phospholipid fatty acid analysis to estimate bacterial and fungal biomass in soil. Biol. Fert. Soils. 22, 59-65 (1996).
- Myers, R. T., Zak, D. R., White, D. C., Peacock, A. Landscape-level patterns of microbial community composition and substrate use in upland forest ecosystems. Soil Sci. Soc. Am. J. 65, 359-367 (2001).
- Swallow, M. J. B., Quideau, S. A., Norris, C. E. Ciliate dependent production of microbial anthranilic acid occurring within aspen litter. Soil Biol. Biochem. 60, 113-121 (2013).
- Norris, C. E., Quideau, S. A., Macey, D. E. Processing of 13C glucose in mineral soil from aspen, spruce, and novel ecosystems in the Athabasca Oil Sands Region. Appl. Soil Ecol. 71, 24-32 (2013).
- Ruess, L., Chamberlain, P. M. The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature. Soil Biol. Biochem. 42, 1898-1910 (2010).
