استخراج وتحليل الميكروبية الفوسفوليبيدية الأحماض الدهنية في التربة
Summary
توفر الأحماض الدهنية فوسفورية المعلومات حول بنية المجتمعات الميكروبية التربة. نحن نقدم طرق لاستخراج عينات من التربة مع الكلوروفورم الخليط على مرحلة واحدة، تجزئة الدهون المستخرجة باستخدام الأعمدة استخراج المرحلة الصلبة، وتحلل الميثانول لإنتاج استرات الميثيل الأحماض الدهنية، والتي يتم تحليلها من قبل اللوني للغاز الشعرية.
Abstract
الأحماض الدهنية فوسفورية (PLFAs) هي المكونات الرئيسية لأغشية الخلايا الميكروبية. تحليل PLFAs المستخرجة من التربة يمكن أن توفر معلومات عن الهيكل العام للالمجتمعات الميكروبية الأرضية. وقد استخدم PLFA التنميط على نطاق واسع في مجموعة من النظم الإيكولوجية باعتبارها المؤشر البيولوجي للجودة التربة الشاملة، وكمؤشر كمي للاستجابة التربة لإدارة والضغوطات البيئية الأخرى بالهبوط.
الطريقة القياسية المعروضة هنا يحدد أربع خطوات رئيسية: 1. استخراج الدهون من عينات التربة مع مرحلة واحدة الكلوروفورم خليط، 2. تجزئة باستخدام الأعمدة استخراج المرحلة الصلبة لعزل الدهون الفوسفاتية من الدهون المستخرجة أخرى، 3. تحلل الميثانول من الدهون الفوسفاتية لإنتاج الأحماض الدهنية استرات الميثيل (جوع)، و4. تحليل FAME بواسطة اللوني للغاز الشعرية باستخدام كاشف اللهب التأين (GC-ااا). اثنين من المعايير المستخدمة، بما في ذلك 1،2-dinonadecanoyl- التعطيل -glycero-3-phosphocholine (PC (19:0/19: 0)) لتقييم الانتعاش العام للطريقة استخراج، وديكانوات الميثيل (MeC10: 0) كمعيار داخلي (ISTD) لتحليل GC.
Introduction
الأحماض الدهنية فوسفورية (PLFAs) هي جزء من الأغشية الخلوية الجرثومية من البكتيريا المجالات وحقيقيات النوى. الكائنات الحية الدقيقة تنتج PLFAs من أطوال سلسلة مختلفة والتكوين كوسيلة للحفاظ على سلامة خلايا الغشاء وظيفة الخلوية في استجابة للظروف البيئية فورية لهم. ومن هنا يمكن القول أن المجتمعات الميكروبية التي يتم فصلها جغرافيا ولكن يتعرضون لظروف التربة مماثلة والتعبير عن PLFAs ما شابه ذلك. تعتبر PLFAs التربة مع طول سلسلة بين 14 و 20 ذرة C عادة ما تكون في الغالب بكتيريا والفطريات أصل 1. في ثقافات متباينة، لا يمكن أن تستخدم تحليل PLFA لتحديد الأنواع الميكروبية الفردية، ولكنها يمكن أن توفر بصمة الشاملة للمجتمعات الميكروبية الموجودة في التربة. وبالإضافة إلى ذلك، منذ PLFAs ويتحلل سريعا على موت الخلايا، فإنها يمكن أن تعتبر ممثلة للمجتمع الميكروبية التربة قابلة للحياة 2. هذا تكوقد استخدم على نطاق واسع hnique لتوصيف التركيب الهيكلي من المجتمعات الميكروبية وجدت في مجموعة واسعة من البيئات، بدءا من الغابات 3-4 إلى 5-6 البراري والحقول الزراعية 7. وقد تم تطبيقه بنجاح في وصف استجابة التربة على الأرض التغييرات الإدارية، بما في ذلك الغابات إزالة الأشجار 8، 9 التجيير واستصلاح 10-12، فضلا عن الاضطرابات مثل الحرائق 13، التلوث بالمعادن 14 والهيدروكربونات 15، وتفشي الحشرات 16 .
تطور المنهج التحليلي المعاصر PLFA خلال العقود الستة الماضية من خلال العديد من التطورات الرئيسية من قبل عدد من المجموعات البحثية. في عام 1958، نشأ تحسنا كبيرا من ضبط الكلوروفورم: الميثانول: نسبة الماء في الحل استخراج لتحويل خليط من الطور إلى نظام ثنائي الطور 17. هذا الاستخلاص الدهون الأمثل وعزل المنقحة المواليةtocol أصبح يعرف باسم طريقة بلي وداير. اعتمد البروتوكول من قبل العديد من المختبرات على مدى العقود القليلة المقبلة، وخلال هذا الوقت، ساهمت الأبيض وزملاؤه التقدم الكبير للطريقة. على سبيل المثال، فإنها تحسن الخطوة الاستخراج عن طريق تبادل عازلة الفوسفات للمياه، وأنها الأمثل التحليل اللوني للغاز (GC) من خلال تحديد الذروة تعزيز وتقدير. ولعل من أكثر ملاءمة لعلوم التربة، وهي التي تحدد في عام 1979 أن نسبة الدهون المستخرجة يمكن أن تستخدم بمثابة مؤشر للبنية الجراثيم عندما درست الكتلة الحيوية الميكروبية من الرواسب البحرية 18.
حدثت تطورات أخرى في 1980s وأصبحت الطريقة المستخدمة على نطاق واسع في علوم التربة، وتحديدا فيما يتعلق ريزوسفير 19. في ذلك الوقت، وشملت طريقة nonadecanoate الميثيل (MeC19: 0) كمعيار داخلي 19 واستخدام عمود حمض السلسيليك لدهن تجزئة 21 </ سوب>. وبعد عمله مع الأبيض 19،21، عاد Tunlid إلى السويد والتي البحوث التعاونية مع البعث وFrostegård. عن طريق فحص كفاءة مخازن استخلاص مختلفة لمجموعة من التربة متفاوتة في محتوى المادة العضوية، وأظهرت المجموعة التي المخزن المؤقت سترات زيادة كمية الفوسفات الدهون المستخرجة مقارنة عازلة الفوسفات 22. وعلاوة على ذلك، على نشر 1993 23 بشأن تأثير الجير على المجتمعات الميكروبية التربة ذهب الى ان تصبح الكلاسيكية الاقتباس في علم الأحياء التربة والكيمياء الحيوية 24. تستخدم الباحثون تحليل المكون الرئيسي في معالجة البيانات الخاصة بهم. تحليل PLFA، كما تسمى الطريقة الآن، يولد مجموعات البيانات الكبيرة وكان استخدام الإجراءات الإحصائية المتغيرات المتعددة لمعالجة هذه البيانات المبتكرة للوقت وملهمة للكثيرين. وبالتزامن مع العمل الذي يجري في السويد، يجري التحقيق التعديلات على إجراء PLFA فيألمانيا Zelles وزملاؤه 25-26. والنسخة الخاصة من إجراء بارزة لاستخدامها للعمود استخراج المرحلة الصلبة (SPE) بدلا من العمود حمض السيليكونى ولكن، عموما، كان أكثر مختبر مكثفة.
ورقة Frostegård البالغ عددهم 23، جنبا إلى جنب مع منهجية مفصلة الأبيض وRingelberg 27، قدم الأساس للانفجار في استخدام تقنية PLFA للتحقيق في المسائل الأساسية في علوم التربة. ومنذ ذلك الحين، وشملت التحسينات مزيد من الطريقة التي فايرستون وزملاؤه إضافة معيار GC الداخلي (C10: 0) وC19: 0 كمعيار بديل لتحسين الكمي 28، والاستعاضة عن استخدام separatory مداخل للقارورة أسفل جولة لتبسيط استخراج 29. وفي الآونة الأخيرة، تشودري وديك 30 التحقيق في خطوة مثيلة وذكرت أن إجراءات مثيلة اثنين المستخدمة في أدبيات العلوم التربة KOH / MeOH طريقة الرمزified مجموعة أكبر من الأحماض الدهنية.
وتستند هذه الطريقة قدمت إلى حد كبير على طريقة الأصلي الذي وضعه بليغ وداير، ويتضمن التعديلات المذكورة أعلاه، مثل استخدام بالميثانول KOH للخطوة مثيلة. وتستخدم معيارين لكل عينة: معيار مركب 1،2-dinonadecanoyl- التعطيل -glycero-3-phosphocholine (PC (19: 0/19: 0))، والذي يضاف إلى عينة التربة قبل استخراج الأول لتقييم الكفاءة واسترداد البروتوكول بكامله، ومعيار صك ديكانوات الميثيل (MeC10: 0)، الذي يضاف قبل تحديد وتقدير من قبل القيادة العامة.
ونحن نعترف بأن طريقة PLFA يستخدم عادة من قبل العديد من المختبرات البيئة الميكروبية في جميع أنحاء العالم، ولقد تم توثيق عدة مرات، بما في ذلك من قبل المنظمة الدولية للتوحيد القياسي (2). الهدف من هذه الورقة هو تقديم وسيلة سهلة لمتابعة وقوية بروتوكول يمكن أن تكون مفيدة للتربةالعلماء الذين يحاولون معرفة تقنية PLFA.
Protocol
Representative Results
Discussion
لتقليل وتجنب سوء تفسير البيانات PLFA، ويجب أن يتم فحص البيانات الحذر لأن بعض PLFAs التي توجد في المجتمع الميكروبي للتربة موجودة أيضا في الكائنات حقيقية النواة واحدة ومتعددة الخلايا، مثل جذور النباتات والطحالب، والحيوانات التربة. وبالإضافة إلى ذلك، العتائق لا تحتوي على PLFAs. بدلا من ذلك، وتتكون الأغشية archaeal من الدهون الأثير فوسفورية (PLELs). وبالتالي، فإن بروتوكول PLFA لا يمكن أن تستخدم لوصف المجتمعات archaeal في التربة.
ربط PLFAs فرد إلى مجموعة ميكروبات معينة يجب أن تمارس بحذر (انظر النشر 2011 من قبل Frostegård وزملاؤه 34 لمناقشة ممتازة من بعض القيود المفروضة على طريقة PLFA). بدلا من ذلك، قد يكون من الأنسب، كما حدث في الشكل 2، لPLFAs مجموعة على أساس التركيب الكيميائي لها، على سبيل المثال، ط) بالسلاسل مستقيم PLFAs المشبعة، والثاني) PLFAs مشبعة منتصف تشاين (10-الميثيل) المتفرعة، ج) متفرعة من شفائهم الأحماض الدهنية المشبعة، والرابع) PLFAs غير المشبعة الاحادية، والخامس) PLFAs المتعددة غير المشبعة، والسادس) الأحماض الدهنية هيدروكسي.
قد تحتاج إلى تعديل بناء على كمية من PLFAs للاستخراج الواردة في عينة تربة معينة وزن العينة. من خلال عدم ضبط كمية من التربة المستخرجة في أقل بالميكروبات التربة النشطة، مستخدمين معرضون لخطر عدم الحصول على عدد كاف من الردود PLFA (قمم) لتمثيل بدقة المجتمع الميكروبي بشكل عام. في التربة عالية النشطة بالميكروبات مع تركيزات عالية من PLFAs، المستخدمين معرضون لخطر الحمل الزائد العمود GC، وبالتالي منع التقدير الدقيق PLFAs. في كلتا الحالتين، وعينات من التربة ويجب إعادة تحليل لPLFAs. وهناك نقطة انطلاق جيدة لإضافة 0.5 غرام لعينات التربة العضوية (مثل الأرضيات الغابات)، وحوالي 3 جم للعينات التربة المعدنية. منذ كمية PLFAs للاستخراج عادة المترابطة لكمية الكربون العضوي الواردة في التربة، عينة نحنآيت يمكن تعديلها بناء على محتوى الكربون في التربة، على سبيل المثال، 1 غرام من عينة التربة المعدنية قد تكون كافية للحصول على القياس الكمي PLFA جيد عندما محتوى الكربون هو 10-15٪، في حين> 5 ز قد يكون ضروريا إذا كان محتوى الكربون ≤ 0.5 ٪. هو دائما فكرة جيدة للقيام التشغيل التجريبي مع بعض العينات لتحسين وزن العينة قبل تشغيل المجموعة بالكامل.
استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها مشتركة لبروتوكول PLFA وتحليل GC هي على النحو التالي. إذا كان خط الأساس GC اللوني مرتفع جدا، يجب تغيير اسطوانة غاز H 2. إذا القمم المذيبات أو ISTD مفقودة من اللوني، قد يكون هناك مشكلة مع حقن عينة (على سبيل المثال، توصيل حقنة، مشكل مع الاوتوماتيكى، قارورة فارغة أو في عداد المفقودين، خطأ مع المواقع قارورة). إذا تم الكشف عن أكثر من ثلاث قمم الفراغ طريقة / عينة، هناك تلوث فارغة، وهناك احتمال كبير أن نفس المادة الملوثة (ق) وسوف تكون موجودة في عينة GC جhromatograms. العثور على مصدر للتلوث (وسائل الإعلام عادة مائي)، أو على أقل تقدير، وضمان أن تتم إزالة قمم المقابلة لالملوث من الاستشرابية العينة والتي لا يتم تضمين هذه القمم في أي تحليل إحصائي للبيانات PLFA. أيضا، انها فكرة جيدة لتشغيل الهكسان يشطف بين العينات عند الاشتباه المرحل. سوف قمم إضافية في شطف الهكسان تشير المرحل (أي المكونات الأثقل يبلغ حجمه من تشغيل سابق).
الدهون هي عرضة بشكل خاص للأكسدة، وتحتاج إلى عناية خاصة لأن تمارس في جميع أنحاء بروتوكول لحماية عينات من التعرض للهواء والضوء، مثل تخزينها في الظلام وابقائها تحت النيتروجين. جميع العينات والفراغات يجب أن يكون C19 كاف: 0 معيار بديل. وC19 مفقود: 0 الذروة، في أي عينات أو الفراغات، ويشير إلى انتعاش الفقراء أو خسارة كاملة من التحاليل. رد من C19: 0 في العينات التي هي أقل بكثير من مالفراغات ethod / عينة تشير إلى فقدان التحاليل في مرحلة ما في منهجية PLFA. عندما تواجه مع الفقراء C19: 0 الانتعاش، وجميع جوانب الإجراء يجب أن تكون مدروسة بعناية وفحصت بما في ذلك استخراج الأولي، جميع مراحل نقل العينات وSPE، الأحماض الدهنية مثيلة، والتجفيف والتخزين والتلاعب عينة من أجل عزل مرحلة أو مراحل حيث خسر التحاليل. من ناحية أخرى، قد يكون من أن استخراج بعض عينات من التربة قد تسفر C19: 0، التي قد تكون المبالغة الانتعاش حالة معيار بديل. أثناء استخدام معيارين ((PC (19: 0/19: 0) وMeC10: 0) ليس شرطا مطلقا، وجدنا أن تكون مفيدة جدا عند الحاجة إلى استكشاف الأخطاء وإصلاحها طالما أن MeC10: 0 استجابة كافية ، يمكن استكشاف الأخطاء وإصلاحها التركيز على الخطوات السابقة لتحليل GC.
كما ذكر سابقا، يجب توخي الحذر عند تفسير البيئية أهمية والنظام البيئي علاقات تستند فقط على المؤشرات الحيوية تنبعد من البيانات PLFA، لأن الدراسات ثقافة نقية تكشف عن أن سلالات بكتيرية معزولة سيحتوي فئات مختلفة من PLFAs. بدلا من ذلك، ينبغي أن ينظر PLFAs العلامات البيولوجية باعتباره إضافة مفيدة في مجموعة من الأدلة عند اتخاذ الاستدلالات البيئية الأوسع. في الأدب، وقد اقترحت PLFAs الفرد والاستفادة منها المؤشرات الحيوية للمجموعات الميكروبات المختلفة. وتستخدم PLFAs المشبعة عادة لتمثيل البكتيريا إيجابية الجرام وغير المشبعة الاحادية PLFA تستخدم لالبكتيريا سالبة الجرام. وتشمل المؤشرات الحيوية المعترف بها للبكتيريا سالبة الجرام غير المشبعة الاحادية الأحماض الدهنية مع التشبع في ω5 أو موقف ω7، مثل C16: 1ω7، C18: 1ω7، وC18: 1ω5. وبالإضافة إلى ذلك، قد تكون الأحماض الدهنية cyclopropyl أيضا ممثل من البكتيريا سالبة الجرام 35. وبالتالي، يمكن حساب PLFAs من البكتيريا سالبة الجرام كما يساوي مجموع A: 1ω5 + A: 1ω7 + A: 0cyclo. المؤشرات الحيوية المعترف بها للبكتيريا إيجابية الغرام وتشعبت عضال ساالأحماض الدهنية turated، مثل C15-تشعبت ايزو: 0I، C16: 0I، C17: 0I. أو anteiso-تشعبت، مثل C15: 0A وC17: 0A. المشبعة PLFAs مع منتصف سلسلة (10-الميثيل) المتفرعة، مثل 10Me16: 0 و10Me18: 0 موجودة مميز في الشعاعية 36. وهكذا، PLFAs من البكتيريا إيجابية الجرام يمكن أن تحسب على قدم المساواة لمجموع A: 0 (ISO، ANTEISO، 10-الميثيل).
في كثير من الأحيان غير مشبع العديد من المؤشرات الحيوية المرتبطة الفطرية PLFA، ولكنها غير المشبعة الاحادية بعض المؤشرات الحيوية الفطرية. على سبيل المثال، من حيث المؤشرات الحيوية غير المشبعة الاحادية الفطرية، C16: تم التعرف 1ω5 كمؤشر على الفطريات كببياوات (AMF) 37، C18: 1ω9 هو شائع في الفطريات بالارتمام، وectomycorrhizae تحتوي عادة على C16: 1ω9. وجود دى غير المشبعة C18: 2ω6،9 غالبا ما يحدث بالتزامن مع C18: 1ω9 وأيضا يرتبط بشكل جيد مع إرغوستيرول ستيرول الفطرية، مما يدل على أن C18: 2ω6،9 يمكن أن تمثل على نحو كاف ectomycorrhizae والفطريات بالارتمام 38. والثلاثية غير المشبعة C18: 3ω 6،9،12 كما تم استخدام العلامات البيولوجية للفطريات 10؛ ومع ذلك، C18: 3ω6c يمكن العثور عليها في الكائنات الحية حقيقية النواة الأخرى بما في ذلك النباتات والطحالب، وعلى الرغم من أنه عادة لا توجد في البكتيريا. في فترة الأولانيات التربة، C20: لقد تم الاعتراف 4ω6c والعلامات البيولوجية أولاني 39، على الرغم من أعمال أخرى فشلت في كشف C20: 4ω6c حتى عندما تأكدت السكان أولاني قابلة للحياة بصريا باستخدام المجهر الضوئي 40.
وتتناول العديد من الدراسات البيئية الأسئلة المتعلقة المجتمع الميكروبي للتربة العام من خلال الاستفادة من تقنيات التنسيق متعدد المتغيرات كأداة تحليل البيانات PLFA. عند استخدام هذا النهج، وقد اختار بعض الكتاب لاستبعاد PLFAs نادرة من مجموعة البيانات عن طريق إزالة PLFAs التي تكون موجودة في أقل من 5٪ من العينات 4. والتشبع العادية C16: 0 و C18: 0 وفيرة في جميع الكائنات المجهرية في التربة، بما في ذلك بدائيات النوى وeukaryotes. وبالتالي، واختيار بعض الباحثين لإزالة هذه PLFAs قبل التحليل الإحصائي على أساس أنها قد لا تكون مؤشرات حساسة من تكوين المجتمع الميكروبي للتربة – على الرغم من C16: 0 و C18: 0 لا تزال ليتم تضمينها عند تلخيص كل PLFAs ل مؤشر الكتلة الحيوية الميكروبية. في المدى التحليلات الإحصائية، واختيار العديد من الباحثين لإجراء غير متري التوسع متعدد الأبعاد (المأخوذة على صعيدي) التنسيق لأن هذا الأسلوب هو مناسبة تماما للبيانات التي قد لا تكون موزعة بشكل عادي 33. ويمكن أن تشمل تحليلات إضافية تتعلق المتغيرات الفئوية تحليل أنواع المؤشرات، التي يمكن أن تتصل وقوع PLFAs الخاصة التجمعات الفئوية وإجراءات الاستجابة التقليب متعددة (MRPP)، والتي يمكن أن تساعد في تحديد أوجه التشابه أو الاختلاف بين المجتمعات الميكروبية المخصصة للمجموعات الفئوية. بالإضافة إلى ذلك، وأشجار الانحدار متعدد المتغيرات (MRT) يمكن أن يكون مفيدا بشكل خاص عندما يكون تأثير المتغيرات التجريبية متعددة أوالعلاج يجب تقييم كمتغيرات تفسيرية محتملة 5 (على سبيل المثال، قوام التربة والرطوبة، عمر استصلاح).
بمجرد إنشائه، وبروتوكول PLFA هي طريقة تحليلية بسيطة نسبيا والتي يمكن أن تكون مفيدة جدا عند قياس استجابة ميكروبات التربة للتغيرات البيئية واضطراب البشري. في حين التقنيات الجزيئية مثل البصمة الوراثية هي أكثر ملاءمة لتوصيف مفصل من المجتمعات الميكروبية، ويعرض طريقة PLFA ميزة توفير معلومات كمية عن إجمالي الكتلة الحيوية الميكروبية 34. في مختبر أبحاث لدينا، شخص واحد يمكن تجهيز مريح مجموعة من 20 عينات على مدى 4 أيام، وقد وجدنا بروتوكول المقدمة هنا أن تكون تقنية قوية وقابلة للتكرار لتقييم الجودة البيولوجية للتربة.
قوة طريقة PLFA يمكن تمديدها إلى حد كبير من قبل اقتران ذلك إلى تحليل النظائر المستقرة 41، 42. وعلى وجه التحديد، بالإضافة سو 13 ركائز المسمى C إلى التربة تسمح لتقدير التأسيس الركيزة في الكائنات المجهرية في التربة على الرغم من تحليل النظائر من PLFAs فرد 41. وبالإضافة إلى ذلك، يبدو أن هذا الأسلوب ليكون أداة واعدة جدا لتوضيح الروابط الغذائية في التربة شبكات الأغذية 42.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was financed in part by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada. The authors acknowledge Jela Burkus, Donna Macey, and Jennifer Lloyd for their technical expertise and their contribution to the optimization of this method.
Materials
| Pierce Reacti-Vap III-evaporator gassing manifold with 27 ports | Used in Steps 1-3 | ||
| Compressed Nitrogen | Praxair | Ni-T | Dangerous: Use only after training and minimize contact and use; Used in Steps 1-3 |
| Disposable centrifuge tube and Teflon-lined cap | Fisher Scientific | 05-569-3 | Used for Step 1 (1 per sample) and Step 2 (1 per sample) |
| Disposable glass long-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | Used for Step 1 (2 per sample) |
| Disposable glass short-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-4 | Used for Step 2 (1 per sample), Step 3 (1 per sample), GC analysis (1 per sample),, and one for each type of solution dispensed during PLFA methods (~10 per batch of samples) |
| Elastic band | Grand & Toy | 42199 | 1 per sample for freeze drying |
| Freeze Dryer-Labconco 7806002 and 7753000 | Used for preparing samples for PLFA analysis – use whatever model your lab has | ||
| Freezer (-20 °C, -80 °C) | Revco | ULT2586-5-A36 | Minus 80 °C is used for freezing freshly collected soil samples, -20 °C is used for storing samples at end of each of 3 steps of PLFA analysis |
| Gas chromatograph – Agilent 6890 Series capillary gas chromatograph (GC;, Wilmington, DE) equipped with a 50 m Ultra 2 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane column | Agilent Technologies | Used for GC analysis, other models of GC could also be used (1 needed) | |
| Analytical column | Agilent Technologies | 19091B-105 | |
| Gas chromatograph insert | Agilent Technologies | 5183-4692 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| Gas chromatograph vial and lid | Agilent Technologies | 5188-6592 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| Hexanes | Fisher Scientific | H292-4 | Hazardous: use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 4 ml (2.0 ml + 2.0 ml (step 3) |
| Hot water bath -Isotemp 220 | Fisher Scientific | Used for Step 3 (1 per batch of samples) | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-2 | Used for freeze drying samples |
| KOH, ACS grade | Fisher Scientific | P250-500 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Used for making citrate buffer (used in Step 1) and methanolic KOH (step 3) |
| Lab quake end-over-end shaker for centrifuge tubes | Barnstead/Thermolyne | 3,625,485 | Used for Step 1 (1 per batch of samples of appropriate holding capacity) |
| MeC10:0 methyl decanoate internal standard | Sigma-Aldrich | 299030-2.5G | Used for GC analysis |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 15.5 ml (5 ml + 5 ml (step 1) + 5 ml (step 2) + 0.5 ml (step 3)) |
| MIDI Peak Identification Software | MIDI, Inc., Newark, DE | Used for interpreting GC analysis output | |
| MIDI Calibration Standard Mix for Microbial Identification System | Lab Sphere Inc | 1200-A | Used as a Calibration mix for TSBA 40 |
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | 27-058-52 | Used always when conducting PLFA lab work |
| pH Meter – Accumet XL200 | Fisher Scientific | Used for making citrate buffer | |
| Pipette (0.2 – 2 ml)- Socorex -Calibra Digital 832 Macropipette | Socorex | 832.02 | Used throughout Steps (1 per sample) |
| 250 µL gastight syringe | Hamilton | 1725 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| silver shield gloves | Sigma-Aldrich | Z529575 | For use when handling chloroform |
| solid phase extraction (SPE) column | Agilent Technologies | 5982-2265 | Used for Step 2 (1 per sample) |
| SPE glass column holder with spigots and vacuum apparatus attached | Sigma-Aldrich | Used for Step 2 (1 per batch of samples) | |
| Vortex – Barnstead International Maxi Mix II- M37615 | Barnstead International | M37615 | Used in Steps 1-3 |
| Water - ultra-pure and Chromosolv HPLC grade | Sigma-Aldrich | 270733-4L | Used throughout analysis |
| Whirl-Pak® bags | Fisher Scientific | 01-812-120 | Used in sample collection – 2 bags required per sample collected |
Referências
- Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biol. Fert. Soils. 29, 111-129 (1999).
- Swallow, M. J. B., Quideau, S. A. Moisture effects on microbial communities in boreal forest floors are stand-dependent. Appl. Soil Ecol. 63, 120-126 (2012).
- McIntosh, A. C. S., Macdonald, S. E., Quideau, S. A. Linkages between the forest floor microbial community and resource heterogeneity within mature lodgepole pine forests. Soil Biol. Biochem. 63, 61-72 (2013).
- Card, S. M., Quideau, S. A. Microbial community structure in restored riparian soils of the Canadian prairie pothole region. Soil Biol. Biochem. 42, 1463-1471 (2010).
- McKinley, V. L., Peacock, A. D., White, D. C. Microbial community PLFA and PHB responses to ecosystem restoration in tallgrass prairie soils. Soil Biol. Biochem. 37, 1946-1958 (2005).
- Bossio, D. A., Scow, K. M., Gunapala, N., Graham, K. J. Determinants of soil microbial communities: effects of agricultural management, season, and soil type on phospholipid fatty acid profiles. Microbial Ecol. 36, 1-12 (1998).
- Hannam, K. D., Quideau, S. A., Kishchuk, B. E. Forest floor microbial communities in relation to stand composition and timber harvesting in northern Alberta. Soil Biol. Biochem. 38, 2565-2575 (2006).
- Pettersson, M., Bååth, E. The rate of change of a soil bacterial community after liming as a function of temperature. Microbial Ecol. 46, 177-186 (2003).
- Degrood, S. H., Claassen, V. P., Scow, K. M. Microbial community composition on native and drastically disturbed serpentine soils. Soil Bio.l Biochem. 37, 1427-1435 (2005).
- Quideau, S. A., Swallow, M. J. B., Prescott, C. E., Grayston, S. J., Oh, S. -. W. Comparing soil biogeochemical processes in novel and natural boreal forest ecosystems. Biogeosciences. 10, 5651-5661 (2013).
- Hahn, A. S., Quideau, S. A. Long-term effects of organic amendments on the recovery of plant and soil microbial communities following disturbance in the Canadian boreal forest. Plant Soil. 363, 331-334 (2013).
- Swallow, M., Quideau, S. A., MacKenzie, M. D., Kishchuk, B. E. Microbial community structure and function: The effect of silvicultural burning and topographic variability in northern Alberta. Soil Biol. Biochem. 41, 770-777 (2009).
- Pennanen, T. Microbial communities in boreal coniferous forest humus exposed to heavy metals and changes in soil pH-a summary of the use of phospholipid fatty acids. Biolog (R) and H-3-thymidine incorporation methods in field studies. Geoderma. 100, 91-126 (2001).
- Margasin, R., Hämmerle, M., Tscherko, D. Microbial activity and community composition during bioremediation of diesel-oil-contaminated soil: effects of hydrocarbon concentration, fertilizers, and incubation time. Microbial Ecol. 53, 259-269 (2007).
- Štursová, M., Šnajdr, J., Cajthaml, T., Bárta, J., Šantrůčková, H., Baldrian, P. When the forest dies: the response of forest soil fungi to a bark beetle-induced tree dieback. ISME J. 8, 1920-1931 (2014).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction. Can. J. Biochem. Phys. 37, 911-917 (1959).
- White, D. C., Davis, W. M., Nickels, J. S., King, J. D., Bobbie, R. J. Determination of the sedimentary microbial biomass by extractible lipid phosphate. Oecologia. 40, 51-62 (1979).
- Tunlid, A., Hoitink, H. A. J., Low, C., White, D. C. Characterization of bacteria that suppress Rhizoctonia damping-off in bark compost media by analysis of fatty acid biomarkers. Appl. Environ. Microb. 55, 1368-1374 (1989).
- Bobbier, J., White, D. C. Characterization of benthic microbial community structure by high resolution gas chromatography of fatty acid methyl esters. Appl. Environ. Microb. 39, 1212-1222 (1980).
- Tunlid, A., et al. Determination of phospholipid ester-linked fatty acids and poly P-hydroxybutyrate for the estimation of bacterial biomass and activity in the rhizosphere of the rape plant Brassica napus (L.). Can. J. Microbiol. 31, 1113-1119 (1985).
- Frostegård, A., Tunlid, A., Bååth, E. Microbial biomass measured as total lipid phosphate in soils of different organic content. J. Microbiol. Meth. 14, 151-163 (1991).
- Frostegård, &. #. 1. 9. 7. ;., Bååth, E., Tunlid, A. Shifts in the structure of soil microbial communities in limed forests as revealed by phospholipid fatty acid analysis. Soil Biol. Biochem. 25, 723-730 (1993).
- Burns, R. G. Soil Biology and Biology Citation Classic X. Soil Biol. Biochem. 43, 1619-1620 (2011).
- Zelles, L., Bai, Q. Y., Beck, T., Beese, F. Signature fatty acids in phospholipid and lipopolysaccharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils. Soil Biol. Biochem. 24, 317-323 (1992).
- Zelles, L., Bai, Q. Y. Fractionation of fatty acids derived from soil lipids by solid phase extraction and their quantitative analysis by GC-MS. Soil Biol. Biochem. 25, 495-507 (1993).
- White, D. C., Ringelberg, D. B., Burlage, R. S., Atlas, R., Stahl, D., Geesey, G., Sayler, G. Signature lipid biomarker analysis. Techniques in Microbial Ecology. , 255-272 (1998).
- Bird, J. A., Herman, D. J., Firestone, M. K. Rhizosphere priming of soil organic matter by bacterial groups in a grassland soil. Soil Biol. Biochem. 43, 718-725 (2011).
- Waldrop, M. P., Firestone, M. K. Microbial community utilization of recalcitrant and simple carbon compounds: impact of oak-woodland plant communities. Oecologia. 138, 275-284 (2004).
- Chowdhury, T. R., Dick, R. P. Standardizing methylation method during phospholipid fatty acid analysis to profile soil microbial communities. J. Microbiol. Meth. 88, 285-291 (2012).
- Buyer, J. S., Sasser, M. High throughput phospholipid fatty acid analysis of soils. Appl. Soil Ecol. 61, 127-130 (2012).
- Christie, W. W., Han, X. Gas chromatographic analysis of fatty acid derivatives. Lipid analysis, isolation, separation, identification, and lipidomic analysis. , 159-180 (2010).
- McCune, B., Grace, J. B. . Analysis of ecological communities. , 300 (2002).
- Frostegård, A., Tunlid, A., Bååth, E. Use and misuse of PLFA measurements in soils. Soil Biol. Biochem. 43, 1621-1625 (2011).
- Högberg, M. N., Högberg, P., Myrold, D. D. Is microbial community composition in boreal forest soils determined by pH, C-to-N ratio, the trees, or all three. Oecologia. 150, 590-601 (2007).
- Brennan, P., Ratledge, C., Wilkinson, S. Mycobacterium and other actinomycetes. Microbial Lipids. , 203-298 (1988).
- Olsson, P. A. Signature fatty acids provide tools for determination of the distribution and interactions of mycorrhizal fungi in soil. FEMS Microbiol. Ecol. 29, 303-310 (1999).
- Frostegård, &. #. 1. 9. 7. ;., Bååth, E. The use of phospholipid fatty acid analysis to estimate bacterial and fungal biomass in soil. Biol. Fert. Soils. 22, 59-65 (1996).
- Myers, R. T., Zak, D. R., White, D. C., Peacock, A. Landscape-level patterns of microbial community composition and substrate use in upland forest ecosystems. Soil Sci. Soc. Am. J. 65, 359-367 (2001).
- Swallow, M. J. B., Quideau, S. A., Norris, C. E. Ciliate dependent production of microbial anthranilic acid occurring within aspen litter. Soil Biol. Biochem. 60, 113-121 (2013).
- Norris, C. E., Quideau, S. A., Macey, D. E. Processing of 13C glucose in mineral soil from aspen, spruce, and novel ecosystems in the Athabasca Oil Sands Region. Appl. Soil Ecol. 71, 24-32 (2013).
- Ruess, L., Chamberlain, P. M. The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature. Soil Biol. Biochem. 42, 1898-1910 (2010).
