Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) ve Taze ve Dondurulmuş Rat Beyin Dokusu gelen Fos-ifade nöronlar Gen İfadesi Analizi
Summary
Burada taze ve dondurulmuş hem de beyin dokusundan nöronal topluluklarından Fos-ifade moleküler değişiklikler incelemek için bir Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) protokol mevcut. dondurulmuş doku kullanımı değerli hayvan deneklerin kullanımını maksimize için birden fazla seans boyunca birçok beyin bölgelerinin FACS izolasyonu sağlar.
Abstract
nöroplastisite ve öğrenilmiş davranışların moleküler değişikliklerin çalışma dernekleri öğrenilen aracılık eden nöronal topluluklar olarak adlandırılan seyrek dağıtılan aktif nöronların spesifik setleri çalışmaya tüm beyin bölgelerinin çalışma geçiyor. (FACS) Kontrol THP-en son yetişkin fare beyin dokusu için optimize edilmiş ve nöronal marker NeuN ve fos protein güçlü aktif nöronların belirteci karşı antikorlar kullanılarak aktif nöronların izolasyonu izin verildi. Şimdiye kadar, Fos salgılayan nöronların ve diğer hücre tipleri uzun işlem günü ve uzun ve karmaşık davranış işlemlerinden sonra değerlendirilir beyin örnekleri izin çok kısıtlı gerektirdiği taze doku, izole edilmiştir. 21 gün – Burada dorsal striatum nöronlar ve Fos mRNA Fos-ifade verimleri 3 -80 ºC de donduruldu taze disseke doku ve doku arasındaki benzer olduğunu gördük. Buna ek olarak, fenotip teyitdondurulmuş doku, aynı zamanda, FACS izolasyonu için kullanılabileceğini gösterir nöronal değerlendirmek gen ifadesi (NeuN), astrositik (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) ve microgial (Iba1) işaretleri ile NeuN-pozitif ve NeuN negatif kriteri hücrelerin glial hücre türleri. Genel olarak, toplamak incelemek ve birden FACS oturumları için beyin dokusu dondurmak mümkün. Bu genellikle uzun ve karmaşık davranışsal prosedürleri geçirmiş değerli hayvan deneklerden elde edilen verilerin miktarını en üst düzeye çıkarır.
Introduction
öğrenme sırasında, hayvanlar son derece spesifik uyaranların karmaşık setleri arasındaki ilişkileri oluşturmaktadır. Bu yüksek çözünürlüklü bilgi nöronal topluluklar olarak adlandırılan seyrek dağıtılan nöronların belirli kalıpları içinde değişikliklerle tarafından kodlanan olduğu düşünülmektedir. Nöronal toplulukları son zamanlarda güçlü davranış veya isteka pozlama sırasında aktive edildi gibi Fos, Arc ve Zif268 ve nöronlarda protein ürünleri gibi hemen erken genlerin (Bacaklarını) indüksiyonu ile tespit edilmiştir. Özellikle içerik ve işaret özgü öğrenilen davranışlar 1-4 nedensel rol oynadığı gösterilmiştir nöronlar Fos-dile getirdi. Bu nedenle, bu aktive Fos-ifade nöronlar içinde benzersiz moleküler neuroadaptations madde bağımlılığı ve post-travmatik stres bozukluğu (TSSB) 5 normal öğrenme ve anormal öğrenme bozuklukları sırasında oluşan dernek, öğrenilen enkode nöral mekanizmalar için en iyi adaylardır.
Fluorescence Aktif Hücre Sıralama (FACS) son zamanlarda Fos-ifade nöronlar içinde benzersiz moleküler neuroadaptations analizi izin verdi. Flow sitometri ve hücre kendi ışık saçılması ve immunofluorescent özelliklerine göre hücre karakterize ve izole etmek için 1960 6,7 geliştirilmiştir sıralama ve uzun immünoloji ve kanser araştırmalarında kullanılmaktadır. Ancak akım sitometri ve FACS yetişkin beyin dokusundan elde etmek zordur ayrışmış tek hücreleri gerektirir. FACS birinci antikor etiketleme 8,9 gerektirmeyen transjenik farelerden striatal nöronlar -expressing izole etmek ve (GFP) yeşil floresan protein analiz etmek için kullanıldı. Bu izole edilmesi ve vahşi tip hayvanlara 11-15 ilaç ve / veya ipuçları ile aktive nöronlar Fos eksprese eden moleküler değişikliklerin değerlendirilmesi için antikor bazlı FACS metodu ile 10 geliştirilmiştir. güçlü nöronlar aktive ederken, bu yöntemde, nöronlar, genel nöronal belirteç neun karşı bir antikor ile etiketlenirFos karşı bir antikor ile etiketlenir. Başlangıçtaki yöntem, taze doku için örnek başına 10 sıçan havuzu gerekli olsa da, bir protokolün takip eden değişiklikler tek sıçan 13-15 ayrık beyin alanlarının Fos salgılayan nöronların ve kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) analizi FACS izole izin . Genel olarak, eşsiz moleküler değişiklikler bağımlılığı araştırma 12,14,15 yılında bağlam ve işaret aktive davranışlar çeşitli sırasında aktive nöronlar Fos-ifade bulundu.
Taze doku üzerinde FACS performans ile büyük lojistik sorun FACS ile doku ve süreci ayırmak bir bütün gün sürer olmasıdır. Buna ek olarak, sadece dört numune günde işlenebilir. Bu, genellikle tek bir beyin bölgesi Her beyinden gelen değerlendirilebilir ve kalan beyin bölgeleri iptal edilmesi gerektiği anlamına gelir. Bu tür öz-yönetim ve nesli trai gibi düşük verimlilik davranışsal işlemler için önemli bir sorundurcerrahi ve yoğun bir eğitim birçok hafta gerekir ning. Bundan başka, test gününde, uzun ve karmaşık bir davranış işlemler zor aynı gün FACS yapılmasını kolaylaştırır. Bu önemli bir avantaj hemen davranışsal test ettikten sonra hayvanlardan beyinleri dondurmak mümkün olacak, ve sonra araştırıcının seçeceği farklı zamanlarda bir veya birden fazla beyin bölgelerinden Fos-ifade nöronlar izole olacaktır.
Burada biz, FACS protokolü taze ve dondurulmuş, her iki beyin dokusundan Fos salgılayan nöronların (ve diğer hücre tipleri) izole etmek için kullanılabileceğini gösterir. Bir örnek olarak, akut metamfetamin enjeksiyondan sonra ve enjeksiyonlar (kontrol koşulu olmadan) naif sıçanların sıçan striatum nöronları Fos-ifade izole. Bununla birlikte, bu FACS protokolü bir davranış ya da farmakolojik tedavi sonrası kullanılabilir. Bizim örneklerin sonraki qPCR analizi bu hücre tiplerinden gen ifadesi simi ile değerlendirilebilir olabileceğini belirttitaze ve dondurulmuş hem dokudan lar verimliliği.
Protocol
Representative Results
Discussion
FACS, taze ya da dondurulmuş yetişkin beyin dokusundan nöronlar ve diğer hücre tipleri sıralamak için kullanılabilir. Girişte belirtildiği gibi, donmuş doku kullanma yeteneği gibi bağımlılık araştırma öz-yönetim ve nüks çalışmaları gibi karmaşık ve uzun süreli davranış prosedürleri geçirmiş hayvanlardan numune optimum kullanımını sağlar. 2 saat ya da daha uzun süre ve tüm hayvanları gerektiren – Bu davranış prosedürler genellikle 1 sürer – aynı gün 13,18 test edil…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NIDA Intramural Research Program (Bruce T. Hope, Yavin Shaham). F.J.R. was supported by an appointment to the NIDA Research Participation Program sponsored by the National Institutes of Health and administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education, and received additional financial support from a Becas-Chile scholarship managed by CONICYT and the Universidad de los Andes, Santiago, Chile. The Johns Hopkins FACS Core facility was supported by Award P30AR053503 from the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institute of Health.
Materials
| Brain matrix | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | to obtain coronal brain slices |
| Hibernate A low fluorescence | Brain Bits | HA-lf | Buffer A' in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Enzyme solution' in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | to prevent cell lost during the protocol |
| Cell Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | to filter cell suspension |
| Cell Strainer, 100 µm | BD Falcon | 352360 | to filter cell suspension |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | to do tissue trituration |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody | EMD Millipore | FCMAB317PE | antibody to detect neurons |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Cell Signaling Technology | 8677 | antibody to detect Fos-expressing cells |
| DAPI | Sigma | D8417 | to label nuclei |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells |
| Superscript III first strand cDNA synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | to synthesize cDNA from RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | to do targeted-preamplification from cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Applied Biosystems. | 4444963 | to do PCR using TaqMan probes |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Reverse primer | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker |
| iba-1 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan probe/primers for microglya gene marker |
| Gapdh TaqMan probe | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Oligo2 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker |
| P1000 pipettor | Rainin | 17014382 | It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells |
| 7500 Fast Real-time PCR system | Applied Biosystems. | 446985 | for quantitative PCR |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | for FACS sorting |
Referências
- Bossert, J. M., et al. Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin. Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).
- Cruz, F. C., et al. Role of nucleus accumbens shell neuronal ensembles in context-induced reinstatement of cocaine-seeking. J Neurosci. 34, 7437-7446 (2014).
- Fanous, S., et al. Role of orbitofrontal cortex neuronal ensembles in the expression of incubation of heroin craving. J Neurosci. 32, 11600-11609 (2012).
- Koya, E., et al. Targeted disruption of cocaine-activated nucleus accumbens neurons prevents context-specific sensitization. Nat Neurosci. 12, 1069-1073 (2009).
- Cruz, F. C., Rubio, F. J., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R. Spectrophotometric cell sorter. Science. 156, 1364-1365 (1967).
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R., Derman, H. Spectrophotometer: new instrument for ultrarapid cell analysis. Science. 150, 630-631 (1965).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9, 443-452 (2006).
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int Rev Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. J Neurosci Methods. 203, 10-18 (2012).
- Guez-Barber, D., et al. FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons. J Neurosci. 31, 4251-4259 (2011).
- Fanous, S., et al. Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking. J Neurochem. 124, 100-108 (2013).
- Liu, Q. R., et al. Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from a single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS). J Neurochem. 128, 173-185 (2014).
- Rubio, F. J., et al. Context-induced reinstatement of methamphetamine seeking is associated with unique molecular alterations in Fos-expressing dorsolateral striatum neurons. J Neurosci. 35, 5625-5639 (2015).
- Li, X., et al. Incubation of methamphetamine craving is associated with selective increases in expression of Bdnf and trkb, glutamate receptors, and epigenetic enzymes in cue-activated fos-expressing dorsal striatal neurons. J Neurosci. 35, 8232-8244 (2015).
- US National Research Council. . Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Koya, E., Margetts-Smith, G., Hope, B. T. Daun02 inactivation of behaviourally-activated Fos-expressing neuronal ensembles. Current Protocols. , (2016).
- Cruz, F. C., et al. New technologies for examining the role of neuronal ensembles in drug addiction and fear. Nat Rev Neurosci. 14, 743-754 (2013).
- Mardones, G., Gonzalez, A. Selective plasma membrane permeabilization by freeze-thawing and immunofluorescence epitope access to determine the topology of intracellular membrane proteins. J Immunol Methods. 275, 169-177 (2003).
- Molyneaux, B. J., et al. DeCoN: genome-wide analysis of in vivo transcriptional dynamics during pyramidal neuron fate selection in neocortex. Neuron. 85, 275-288 (2015).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. , e52537 (2015).
