Preparazione e applicazioni di colture organotipiche timica Slice

Cellule T differenziano attraverso una serie di intermedi di sviluppo nel timo durante i quali incontrano diversi controlli che assicurano la generazione di un funzionali, self-tolerant repertorio cellule T ^1-3. Selezione positiva favorisce la sopravvivenza dei timociti con i recettori delle cellule T (TCR) in grado di riconoscere, con una bassa a moderata affinità, peptide presentati da grandi molecole complesse di istocompatibilità (MHC) sulle cellule epiteliali del timo corticali (CTEC) ^2,3. Selezione negativa e lo sviluppo delle cellule T regolatorie (T _reg) contribuiscono alla creazione di auto-tolleranza attraverso l'eliminazione o la distrazione dei timociti che rispondono con forza di auto-peptide presentato da MHC ^2,4. Immaturo CD4 ⁺ CD8 ⁺ doppio positivo (DP) timociti che esprimono TCR che passano il processo di selezione si differenziano in sottopopolazioni di cellule T mature, la maggior parte dei quali sono di classe I-restricted MHC citotossici CD8 ⁺o MHC di classe II-ristretta singole cellule CD4 ⁺ helper positivi (SP) T, prima di uscire il timo per eseguire funzioni effettrici negli organi linfoidi secondari ^1-3.

Aggiungendo alla complessità dello sviluppo delle cellule T è la migrazione dinamica e incontri cellulari di sviluppare timociti tutta la rete cellule stromali ^5-9. Queste cellule stromali svolgono ruoli distinti nello sviluppo timocita e sono distribuiti in modo differenziale tra le regioni corticali e midollari timo dove positivo e selezione negativa si verificano ^10. Anche se la selezione positiva si svolge principalmente nella corteccia, c'è accumulando prove che timociti DP migrano verso il midollo e continuano a richiedere i segnali TCR prima che si differenziano in cellule T mature che suggeriscono che il midollo può fornire segnali aggiuntivi necessari per il completamento della selezione positiva e lignaggio differenziazione ^11,12. Ulteriore,nonostante la presenza di cellule specializzate midollari timiche epiteliali (MTEC) che esprimono e presentare gli antigeni tissutali-ristretto che facilitano l'eliminazione dei timociti autoreattivi ^13,14, una grande percentuale di selezione negativa si verifica nella corteccia in risposta a espressa ubiquitariamente auto-peptide presentato da dendritiche cellule ^15,16. Così, modelli accurati di sviluppo delle cellule T devono fornire un microambiente timico altamente organizzato, con corticale intatta e regioni midollari, che facilita l'interazione tra i timociti e cellule stromali, e supporta la migrazione thymocyte come queste cellule subiscono selezione positiva e negativa.

Per completare ex vivo analisi dei timociti come mezzo per studiare selezione positiva e negativa, un certo numero di in vitro, in situ, e de modelli in vivo di sviluppo delle cellule T sono stati sviluppati ^17-22. E 'stato notoriamente difficile ricapitolareselezione positiva in vitro, ma co-coltura di popolazioni di cellule staminali o precursori delle cellule T con cellule stromali che esprimono Notch ligando, in particolare OP9-DL1 / 4 celle, ha la capacità di supportare T lignaggio impegno e la selezione positiva limitata che lo rende un prezioso modello in vitro per studio sullo sviluppo delle cellule T ^23-25. Le limitazioni di questo sistema, tuttavia, includono il fatto che queste cellule hanno la macchine di trasformazione peptide unico trovato nelle cellule stromali del timo e il microambiente timico tridimensionale.

Anche se più tecnicamente ingombrante, in situ e de modelli in vivo di selezione timica può superare alcune delle barriere relative a sistemi in vitro. Reaggregate colture d'organo timo (RTOC) contengono miscele di timociti e cellule stromali del timo ^18,26,27 definiti. Questi reaggregates cellule epiteliali del timo mantengono MHC di classe I e II espressione e in grado di supportare SVILUPPOnt di entrambi i sottogruppi di cellule T convenzionali, ma mancano ancora definite strutture corticali e midollari. Fetale cultura organo timica (FTOC) è un modello popolare di sviluppo delle cellule T che possono essere testa di serie con timociti attraverso la cultura impiccagione-drop dei lobi timici lymphodepleted o tramite iniezione di timociti in lymphoreplete lobi del timo e sostenere lo sviluppo efficiente di CD4 ⁺ e CD8 ⁺ cellule nel tempo nella cultura ^18,28-31. Al l'inizio della cultura di lobi del timo fetale vi è una scarsità di mTECs, ma strutture corticali e midollari definiti può svilupparsi nel tempo a seconda delle condizioni. Una considerazione importante è che questo modello può preferenzialmente sostenere fetale contro lo sviluppo delle cellule T degli adulti. Infine, l'iniezione intratimica di precursori timici definiti in topi adulti è tecnicamente impegnativo, ma offre chiaramente un ambiente per sostenere Sviluppo delle cellule T in vivo. Questi in situ e de modelli in vivo sono ottimi strumenti to lo sviluppo delle cellule T di studio e il loro utilizzo devono essere considerati a titolo sperimentale-by-esperimento.

Fette timo, tuttavia, hanno recentemente emersi come un modello complementare versatile per studiare selezione timica in situ con la possibilità di ospitare unica, complessa, e gli esperimenti di throughput generalmente superiori. Fette timo mantengono l'integrità delle regioni corticali e midollari e forniscono un quadro di cellule stromali che supporta la migrazione thymocyte durante lo sviluppo, così come la selezione positiva e negativa efficiente ^11,32-39. Sottoinsiemi thymocyte aggiunti in cima a fette timo migrano nel tessuto e alla loro appropriata nicchia microambientali ^34,37. I timociti sovrapposti possono essere distinte dalle cellule endogene fetta del timo tramite marcatori congenic o etichette fluorescenti e possono essere mantenute in coltura per diversi giorni. culture timica fetta organotipica possono essere utilizzati per studiare i vari aspettidello sviluppo delle cellule T compresa la selezione del timo, il comportamento timociti (migrazione e interazioni cellulari), e la localizzazione thymocyte, tra gli altri. Data la capacità di generare ~ 20 fette del timo per il mouse, la scalabilità degli esperimenti è generalmente maggiore rispetto ad altri modelli in situ di selezione del timo. Sebbene la preparazione di fette timici richiede attrezzature specializzate, quali vibratome, e il tempo di vita di fette timici in coltura è limitata a causa della perdita di cellule nel tempo con morte cellulare e la mancanza di una membrana incapsulante, fette timici forniscono un eccellente modello per l'analisi di selezione del timo delle popolazioni sincronizzate di timociti all'interno di un microambiente timica maturo. Qui si descrive la preparazione di fette timici (compresa la raccolta il timo, l'incorporamento agarosio di lobi timo e vibratome sezionamento del tessuto incorporato), l'isolamento e la sovrapposizione di timociti, e la dissociazione di fette del timo per l'analisi di citometria di flusso.