JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia do Desenvolvimento

Kordalı embriyo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon<em> Ciona intestinalis</em

Published: October 16, 2016
doi:
10.3791/54313
, , , ,
1Department of Evolution and Developmental Biology, Zoological Institute,University Innsbruck

Summary

Biz Ciona intestinalis, mikroenjeksiyon ve elektroporasyon teknikleri kullanarak omurgalılar bir kordalısı kardeş grubunda, geçici transgenesis ve gen demonte sunuyoruz. Bu tür yöntemler Notokordun ve baş duyusal epitel ve insan hastalıklarla ilişkili genlerin pek ortologlar dahil omurgalıların ilkel özellikleri, özellikleri bu basit omurgasız fonksiyonel genomik kolaylaştırır.

Abstract

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Introduction

Son zamanlarda, genom sekansı ve transkripsiyon gen repertuarlarından model organizmaların bir dizi erişilebilir hale gelmiştir. Ancak, gen işlevsel bağlantılar belirlenmesi ve bu bağlantılar embriyonik zaman ve mekân boyunca transkripsiyonel aktiviteyi yürütmek için DNA'da kablolu nasıl, özellikle omurgalılarda, önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Özellikle omurgalılarda düzenleyici etkileşimlerin karmaşıklığı ve genomları 1,2 karmaşıklığı, in vivo DNA düzeyinde özellikle etkili fonksiyonel analizleri, yavaşlatmak. Nitekim, hiçbir GRN şu anda gelişmekte olan organizmanın nihai, terminal farklılaşmış duruma döllenme analiz edilir.

Ascidian C intestinalis gibi tam GRN mümkün olabilir analizleri bir model organizmayı temsil eder. Çok az gen yedekleme ile omurgasız tipik bir Yinelenmeyen genomu vardır. Omurgalılar, aksine hav genom duplications iki tur uğramıştıre büyük gen aileleri ve fonksiyonel çeşitlendirilmesi değil, aynı zamanda paraloglar arasındaki fazlalık oluşturdu. C kompakt cis -regulatory dizileri (GRNs kontrol birimi) intestinalis ve birkaç hücreleri değişmez embriyonik soy C andıran elegans. Ayrıca, omurgalılar içinde omurgalılar için bir omurgasız kardeş grubu olarak eşsiz filogenetik konumu oluşturan kordalı vücut planının 3-6, hücresel çözünürlükte, gelişimsel gözlem sağlar.

Model organizmaların fonksiyonel genomik gelecekteki başarısını garanti önemli mesele kantitatif in vivo tedirginlikler için embriyo çok sayıda nesil. Ciona yumurta 7 mikroenjeksiyon tekniği ve hızlı bir şekilde Ciona yüzlerce in vivo elektroporasyon birçok geçici transgenik hayvanlar elde etmek için olasılığı gelişimi 8,9 bir atılım olmuştur zigot <em> Ciona işlevsel genomik. Burada, ilk başta anne transkript, morfolino (MO) aracılı gen demonte tercih edilen bir yöntem olmaya devam bireysel genlerin hedef için daha zahmetli mikroenjeksiyon tekniği sunulmuştur. MO oligos tipik başlatıcı ATG veya RNA ekleme siteleri hedeflemek ve protein çeviri müdahale. Daha sonra bu şekilde olan, in vivo ve dokuya özel gain- veya işlev yaklaşımlar kaybı arasında arttırıcı etkin analizi açılımlar, Ciona döllenmiş yumurta elektroporasyon kantitatif bir tarzda, analiz edilecek embriyo çok sayıda olanak göstermek eşzamanlı manipülasyonlar ve analizler için olasılık. Biz daha Ciona topluluk araçları düzenleme bölümleri ve sentezleme vektörleri tam açık okuma çerçeveleri (ORF'ler), etkin klonlama in siliko kestirim için kullanılmaktadır gösterilmektedir. Son olarak, biz farklı hücre içi lokalizasyonu floresan etiketli göstermekveya elektroporasyon ile aşırı ekspresyonu üzerine proteinleri etiketli.

Protocol

Ciona Yumurta ve Zigotlar Mikroenjeksiyon ve elektroporasyon 1. Hazırlık embriyo kültür için HEPES (ASWh) 10 L yapay deniz suyu hazırlayın. 420 mM NaCI, 9 mM KCI çözülür, 10 mM CaCl2 · 2H 2, O, 24.5 mM MgCl2 · 6H 2, O, 25.5 mM MgSO 4 · 7H 2 O ve 2.15 mm çift damıtılmış su içinde NaHCO 3 (GKD 2 O) gece boyunca karıştırıldı. 5 mM HEPES pH 8.0 ekleyin ve doğrulamak / 8.0 pH ayarlamak. 4 ° C'de ASWh saklayın. 18 ° C ısınmasını ve kullanılmadan önce filtre kağıdı ile filtre. % 20 sodyum tioglikolat, ASWh% 1 pronase: 20x inaktif dechorionation çözeltisi hazırlayın. -20 ° C'de 500 ul alikotları saklayın ve kullanımdan önce 10 mi ASWh bir son hacme kadar seyreltin. yumurta / embriyoların 15 20 kültür yemekleri hazırlayın. 1-2 mm ince bir tabaka ile kaplanması, 3.5, 5, 9 ya da 15 cm Petri kutularına ASWh erimiş% 1 agaroz dökün.Agaroz katılaşmaya ve ASWh ile plakaları kapak olsun. 1-2 hafta maksimum 4 ° C'de bunları stok. Kullanmadan önce ASWh değiştirin. özel enjeksiyon yemekleri hazırlayın. agaroz 5 cm Petri kabı içine eritilmiş% 1 5-7 mm kalınlığında bir tabaka dökün ve agaroz katılaşma üzerine bir girinti üretmek için (örneğin bir plastik kapak kayma yapıştırılmış bir zip kilit kapatma gibi) agaroz üzerinde bir kalıp yerleştirin bu yumurta tutabilir. 5 enjeksiyon yemekleri 4 hazırlayın ve ASWh ile kaplayın. 4 ° C'de saklayın ve kullanmadan önce taze ASWh ile değiştirin. Enjeksiyon için sadece taze plakaları (en fazla bir gün eski) kullanın. 6H 2 O, 3 mM K 4 [Fe (CN) 6] · 3H 2 O, 3 mM K 3 [Fe (CN) 6] fosfat tamponlu 2 · 1 mM MgC: β-galaktosidaz (LacZ) boyama tamponu hazırlayın tuzlu su Tween ile (PBS) (PBT) (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na-2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4,% 0.05 Tween). Mağaza in, 4 ° C'de koyu renkli. LacZ alt-tabakanın hazırlanması 5-Bromo-4-kloro-3-indolil-beta-D-galaktopiranosit -20 ° C'de 40 mg / ml dimetilformamid (DMF) ve mağaza stoklar alikotları (X-gal, 10 U / ml) kadar kullanın. yapışmasını embriyolar önlemek için musluk suyu gecede Pasteur pipetler bekletin. enjeksiyon iğneleri hazırlayın. (415 filament rampa testi), 75 hız 75 ve saati 200 çekin gibi ısı 425 olarak koşullarda bir mikropipet çektirmenin ayarlayın. Normalde ucunda kapalı 8-10 uzunluğunda, ince iğneler üretmek için 5 Filament içeren cam kılcal 4 çekin. ipuçları kesmemek için, yükseltilmiş bir destek üzerinde yapışkan bant çift bağlı bir tozsuz iğne kutusu, iğne saklayın ve iğne doldurmak için uygun olan. NOT: (6. bölümde açıklandığı gibi) yeşil hayati boya ile birkaç yumurta enjekte edilerek elde edilen iğneler test ve ince ayarlı ve Repetit için izin veren bir ucu şeklini elde etmek için koşulları çekerek iğne ayarlamak6.6 de tarif edildiği gibi enjeksiyon ive. Enjeksiyon çözeltisi hazırlayın. 2 mM MO 1 ul, 10 ug 2 ul oluşan örneğin enjeksiyon çözeltisi 4 ul, Hazırlama / ml yeşil vital boya ve 1 ul GKD 2 O 0.05-0.5 mg / ml başlıklı mRNA veya deney soruya bağlı olarak plasmid DNA 20 ng / ul nihai konsantrasyona ekleyin. İyice karıştırın. çözüm mRNA içeriyorsa buz üzerinde tutun. Gamet 2. Koleksiyonu 18 ° C teşrih Ciona yetişkin embriyo oda soğutmalı. küçük bir makas kullanın ve alıp verme tarafında sifonlar karşı ucundan başlar (kısa) sifon altında yumurtalık ve sperm kanalı çalıştırın. yumurtalık Açığa ve ince makas ucunu kullanarak yumurtalık bir kesi yapmak. yavaşça, örneğin soyma kapalı makas ile yumurta kanalının basarak ASWh ihtiva eden bir 6-yuvalı plaka içine doğrudan akan yumurta bırakıngs. Pasteur pipeti ASWh ile önceden durulanmıştır kalan yumurta transferi. Farklı kuyularda farklı hayvanların yumurta yatırın. Diseksiyon kapsamında yumurta kalitesini gözlemlemek. NOT: İyi gelişmiş yumurta rengi hafif sarı yuvarlak ve pembe. Bir hücresel olmayan vitelline kat, yumurta etrafında iyi tanımlanmış bir perivitelline alanı oluşturan koryon ile çevrilidir. koryon onun dışında onun iç ve yıldız şeklinde folikül hücreleri test hücreleri ile ilişkilidir. düşük kaliteli Yumurta genellikle perivitelline boşluk veya folikül hücreleri yoksundur. Onlar daha az yuvarlak, daha granül veya renk farklı görünür. Olgunlaşmamış oositler küçüktür ve bir gümüş beyaz renge sahiptir. makasla sperm kanalı kesin ve ayrı bir Pasteur pipeti kullanarak bir 1.5 ml tüp içine konsantre sperm toplamak. Farklı hayvanlardan (en az iki) aynı tüp içine sperm havuz. Birkaç gün boyunca 4 ° C'de saklayın, sperm. 3..gübreleme Aşama 2'de tarif edildiği gibi 18 ° C 'de, sperm ve yumurta toplamak. sperm etkinleştirin. 1.5 ml bir tüp içinde 1 mi ASWh hazırlayın ve 1 M Tris pH 9.5, 50 ul ile karıştırın. Daha sonra konsantre sperm 20 ul ekleyin ve hafifçe tersini tüp karıştırın. küçük bir Petri kabı bir kapak veya bir cam slayt üzerine yerleştirilen sperm bir damla sperm aktivasyonunu doğrulamak ve diseksiyon kapsamında gözleyin. spermatozoidlerin deli yüzme olmalıdır. (100 ve 1000 yumurta arasındaki içeren) yumurta her kuyuya aktif sperm solüsyonu 100-200 ul ekleyin, yukarı ve aşağı pipetleme iyice karıştırın, bu yüzden yumurta ortamda yüzen. Embriyoların hareket etmeden 10 dakika bekleyin. Yumurta ve Embriyoların 4. dechorionation ASWh 10 ml 20x dechorionation çözeltisi 500 ul tablet seyreltilir. 2 200 ul damla damla ekleyerek dechorionation çözümü etkinleştirin.10 mi 1 x dechorionation çözeltisine 5 M NaOH. Bir sütlü çökelti oluşturacak. Yavaşça tersini tüp karıştırın. yumurta veya zigot toplamak Pasteur pipeti kullanarak cam tüpler içine (10 dakika sonra adım 3.3 beklemek). Bir tüp (1000-5000 civarında yumurta / tüp) içinde 2 ila 3 hayvanlardan yumurta havuz. yaklaşık 20 saniye boyunca yüksek hızda (1200 xg) iplik bir el santrifüj ile tortu tüpün dibinde bir embriyo pelet oluşturmak için. Yavaşça santrifüj durdurmak ve Pasteur pipeti ile ASWh çıkarın. Her bir tüp içinde topak haline yumurta / zigotların aktive dechorionation çözeltisi 4 ml. onları hafifçe yukarı pipetleme ve küçük bir lastik armut ile tepesinde bir musluk suyu ile tedavi edilen Pasteur pipeti kullanarak aşağı yumurta / zigot Askıya. Çözelti 1-3 dakika sonra sarımsı dönmelidir. Pasteur pipeti kullanarak dechorionating yumurta / zigot süspansiyon küçük bir kısım kaldırarak dechorionation izleyin. Bir slayt üzerinde bir damla yatırın ve diseksiyon s altında gözlemlemekbaş. yukarı ve aşağı yumurta / zigot pipetle tutun ve her 20-30 sn kontrol edin. NOT: İlk folikül hücreleri ayırmak, daha sonra koryon sarı ve opak döner ve nihayet zigotlardan ayrılıncaya. Pembe yumurta / zigot cam tüp dibine batar dechorionated. dechorionation max fazla almamalıdır. 5 dakika. Yumurta% 50 / zigotlar dechorionated kez ASWh ile tüp doldurun. NOT: yaklaşık 10-15 sn dechorionated yumurta / embriyo çöktürmek için yeterli çok düşük hıza karşılık gelen (8 xg) Çok nazikçe santrifüj. tüpün alt kısmında yumurta / zigot pelet perturb değil yavaş yavaş santrifüj durdurun. tam olarak dechorionated yumurta / zigotların yüzen madde içeren cam tüp hemen hemen bütün sıvı çıkarın ve ASWh ile değiştirin. Yavaş yavaş yıkayın ve yavaşça adım 4.2 olarak tekrar santrifüj aşağı yukarı pipetlemeyin ve. zigot yerçekimi tarafından yerleşmek için Alternatif olarak, bekleyin. Hiçbir koryon enkaz l kadar bir kez daha yıkayıneft. Aktarım yumurta / zigot taze Pasteur pipeti kullanarak kültür yemekleri durulanır için. Düşük yoğunlukta zigot (değil yumurta) tutun (10 cm çanak başına 200 embriyolar civarında) birlikte yapışmasını önlemek için. Kültür 13 ve 20 ° C arasındaki sıcaklıklarda, istenen aşamada embriyolar. Alternatif olarak, zigot (Adım 5) electroporate veya döllenmemiş yumurta (Adım 6) enjekte edilir. 5. Elektroporasyon yumurta döller ve bölümler 3'deki gibi 18 ° C 'de zigotların dechorionate ve 4 elektroporasyon numune başına 50 ila 400 yumurta sağlar. (50 ul GKD 2 O maks. 100 ug plazmit DNA), 1.5 ml tüp içinde 50 ul plazmit DNA hazırlanması ve 200 ul 0.95 M mannitol ekleyin. vorteks ile iyice karıştırın. Sevk ve yerçekimi silikonlu 1.5 ml tüpler içinde dechorionated zigot tortu. tüp 100 ul işaretine ASWh aşağı kaldırın. aşağıdaki gibi her zigot tüp için, art arda, Devam: eklemePasteur pipeti kullanılarak DNA / mannitol çözeltisi. Yavaşça zigotlardan ile karıştırın ve hemen 4 mm elektroporasyon küvetine DNA / mannitol / zigot süspansiyon ve transferini sürebilir. elektroporasyon tutucu içine hemen küvet yerleştirin ve 50 V 16 msn tek darbe vermek Aynı Pasteur pipeti kullanarak küvete gelen zigot çıkarın ve taze ve filtre ASWh içeren bir kültür çanak bunları yaymak. Onlar 18 ° C'de yaklaşık 1 saat sonra döllenme (hpf) yarılması başlamadan önce zigot pipetle. ASWh bir beher içinde örnekler arasında pipet durulayın. Kültür 10 cm çanak başına yaklaşık 200 embriyonun yeterince düşük yoğunlukta 15-20 ° C'de zigot birlikte yapışmasını önlemek için. 6. Mikroenjeksiyon Enjeksiyon için dechorionated Yumurta hazırlayın. Bölüm 4'de tarif edildiği gibi, 2-4 hayvandan, ayrı yumurta Dechorionate döllenmemiş ve dechorionated e tutunayrı küçük agaroz kaplı kültür kaplarına GGS. enkaz kaldırmak için yemekler yumurta birkaç kez yıkayın. Test her bireyden (50 civarında) dechorionated yumurta küçük gruplar halinde döller. her parti için ayrı bir 5 cm çanak kullanın ve 2 ul aktif sperm (adım 3.2) uygulanır. bulaşıkları dönen ile iyice karıştırın ve yanlara yemekleri hareket ettirerek çanak yumurtaları yayıldı. taşımadan yaklaşık 10 dakika sperm ve yumurta bir arada tutmak. aşağıdaki gibi sperm maksimum ortadan kaldırmak: Taze ASWh ile iki kez taze kültür çanak döllenmiş yumurta transferi veya durulayın. (Yaklaşık 3 saat sonra döllenme için 18 ° C'de) 32-hücre aşamasına kadar soğukkanlı yararak embriyolar bırakın. mikroenjeksiyon için gelişmekte olan en iyi parti (döllenme en iyi yüzdesi ve en düzenli bölünme modeli) yumurta seçin. Enjeksiyon iğneleri ayarlayın. FL ağırlık sağlamak için dik bir konumda 4 enjektör dolgufilamanın boyunca ow. İğne aşağı ucu konumlandırılmış iğneler arka ucunda yeşil hayati boya içeren Depozito 0.5 ul enjeksiyon solüsyonu (adım 1.8). altta iğne ucu doldurmak için sıvı bekleyin. yatay iğne konumlandırmak ve ince ve uzun metal veya plastik pipet kullanarak mineral yağ ile dolgu. Yavaşça iğneyi doldururken tüm hava kabarcıklarını kovma mineral yağ enjeksiyon çözümü kaplaması. Kur, bir 18 ° C Mikromanipülatör Odası Soğutmalı. Mineral yağ ile dolu bir 10 ml'lik bir cam şırıngaya iğne tutucusunun plastik boru bağlayın. boru ve yağ ile iğne tutucu dolgu ve herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak. İğne tutucu iğne takın ve mikromanipülatör tutucu yerleştirin. yüzeye 45 ° 'lik bir açı ile düz bir çizgi boyunca iğne tutucu hareket ayarlayın. dechoriona yönlendirmekYumurta diseksiyon mikroskobu altında tek tek enjekte edilir, böylece enjeksiyon çanağı agaroz girinti boyunca ted yumurta. Gerekirse hafifçe agaroz karşı veya agaroz üzerine yerleştirilen cam kapak slip bir parça karşı iğne iterek, iğne ucu kırın. Biraz iğne ucu açık (yeşil iğne içeriği çıkarmak olacaktır) olduğunu doğrulamak için şırınga topuzunu baskı. İlk yumurtanın içine iğne sokulması ve hafif enjeksiyon yoluyla takip yumurta zarı kırmak için aspire tek döllenmemiş yumurtalar tek enjekte edilir. hücre çapı 1/3 en fazla yumurta ortasına yeşil enjeksiyon solüsyonu enjekte edilir. (Bu, 140 um'lik bir yumurta çapı yaklaşık 30 ul) kullanılmıştır. taze bir kültür çanak enjekte döllenmemiş yumurta transferi ve gübreleme kadar 15-18 ° C'de inkübe. Test döllenmeler (adım 6.1.2) 'de olduğu gibi yeni aktive sperm enjekte yumurta döller. Eliminattaze bir kültür çanak zigot aktararak sperm ea maksimum. Embriyoların yayılmış ve (32-hücreli aşamaya kadar) bölünme aşamalarında bunları perturb yok. Kültür 13 ve 20 ° C arasındaki bir sıcaklıkta arzu edilen aşamaya embriyolar. plaka ortasına onları dönen ve silikonlu 1.5 ml tüpler içine aktararak embriyolar toplayın. Fix ve leke, ya da montaj (Adımlar 7 ve 8). Kontrol enjekte edilen embriyoların elde edilen fenotipleri karşılaştırın. NOT: özdeş fenotipleri elde etmek için aynı transkript hedefleyen bir ikinci, örtüşmeyen MO enjekte edilir. modifiye mRNA ilgi proteini kodlayan ama bu MOS tarafından tanınmayan belirli MO fenotip (ler) Kurtarma. Resim fenotipi veren bir kontrol MO enjekte edilir. 7. LacZ Boyama silikonlu 1.5 ml tüpler içinde arzu edilen bir aşamada embriyolar toplamak ve 15 için 1 mi ASWh% 0.2 glutaraldehid içinde düzeltin30 dakika maksimum. Yıkama 2x 1 ml 1x PBT 10 dk. 500 ul LacZ tampon boyama kez durulayın. X-Gal substrat ile takviye edilmiş 1 mi tampon boyama yerine (10 ul 40 mg / ml kullanmak / ml X-Gal stok). boyamanın daha iyi gözlem için bir 12 plaka içine embriyolar aktarın. karanlıkta inkübe edin. 0.5 saat inkübasyon Vary gece boyunca 4 ° C'de, LacZ ifade sürücünün gücüne bağlı olarak, oda sıcaklığında veya 37 ° C 'de. boyama tampon kaldırmak için 1 ml 1X PBT 4 kez embriyolar kadar yıkayın. Sonrası düzeltme% 2 1 ml paraformaldehid (PFA), 1x PBT ya da lekeli embriyoların yorumlanması ve görselleştirme için 1 mi 1 x PBT% 0.2 glutaraldehid ile oda sıcaklığında 10 dakika karıştırıldı. Floresan etiketlenmiş Wmbryos 8. Montaj 1 mi ASWh içinde% 2 PFA içinde 20 dakika süreyle istenilen bir gelişim safhasındaki embriyolar sabitleyin. Embriyolar 1 ml 1x PBT 2x yıkayın. herhangi bir ışık Fuar Görüntüleri kaçınınkaranlık koşullarda embriyolar tutarak ure. bir slayta 50 embriyolar kadar aktarın. kağıt havlu ile ilk önce bir pipet ile dikkatle PBT maksimum çıkarın. 20-25 ul montaj orta ekleyin. Örnek kaplıdır kadar kabarcıklar kaçınarak ince uçlu bir nesneyle (iğne, forseps, pipet ucu) ile alt yavaş yavaş (ilk bir taraftan) bir açı içinde konumlandırarak ve bir lamel ekleyin. şeffaf oje noktalar kullanarak kenarlarından lamel sabitleyin. kuruduktan sonra bir oje ile tüm lamel mühür. -20 ° C'de karanlıkta muhafaza edilmelidir.

Representative Results

Gen düzenleyici bir ağ çalışmaları için Mikroenjeksiyon Ascidian Embriyolar Ciona intestinalis hücre soyu seviyede gene işlevsel veya gen düzenleyici çalışmalar ve hücre çözünürlükte uygundur. mRNA'lar, MOs veya etiket döllenmemiş yumurtanın içine veya gübreleme aşağıdaki bireysel blastomer içine mikro enjekte edilebilir. mikroenjeksiyon tekniği kullanılarak demonte MO aracılı gen 6. MOs özel olarak seçilen genin hedef mRNA tarafından da protein, çeviri bilmek adımında tarif edilmektedir. MO genel embriyonik GRN 10 içine bir bakış ortaya kaybı fonksiyon-aşağı genlerin geniş bir dizi ifadesini değiştirir gelişimsel genlerin (LOF) aracılı. Ciona Böyle analizler metazoon 11 ilk tam embriyo düzenleyici planı sağladı. 1 görüntüler nasıl microinjecti bir örnek Şekililgili Ciona embriyo gastrula aşamasında muhafaza Cı -Myelin transkripsiyon faktörünün (Cı -MYT) ifadesinin yukan regülasyonu çalışma için kullanılmıştır. In situ hibridizasyon (ISH), (Şekil 1a 'şematize Şekil 1a), endojen ekspresyonu ile gözlenmiş özellikle beyin, 6 sıralı nöral plak öncüler gözlenmiştir (satırlar kırmızı III / IV) ve omurilik ( yeşil satır I). Buna ek olarak, Cı -MYT yukan regülasyonu ifade veya Cı -MYT sentezleme başlangıcından (Şekil 1b-G) önce nöral öncüler bitişik olan çeşitli faktörleri hedef alan MO enjekte edilerek analiz edilmiştir. Böyle Forkhead kutu Aa olarak erken embriyonik faktörlerin, MO demonte (Foxa-a) (sırasıyla Şekil 1b veya 1c) transkripsiyon faktörü ve fibroblast büyüme faktörü 9/16/20 (FGF9 / / 20 16) genel Ci -MYT ortadan kaldırır ifadesi. Diğer transkripsiyon faktörlerisadece kısmen (Şekil 1d, f ve g mavi ok başları), beyin öncüleri bir alt kümesi MO-aracılı baskılanması sonucu Ci -MYT ifadesini etkiler. Tersine, Ci -MYT ifade ektopik Nodal normalde bu yanal sinir kordonu öncüleri Ci -MYT ifadesini bastıran düşündüren, Nodal (Şekil 1e, kırmızı ok başları) baskılanması üzerine devreye girer. etkin bir şekilde gene işlevsel ve güçlendirici çalışmaları için Elektroporasyon Ciona zigotların plazmid DNA Elektroporasyon geçici transgenesis ve in vivo fenotipik değişikliklerin takip eden gözlem için etkili bir yöntemdir. mRNA mikroenjeksiyon farklı olarak, elektroporasyon geni kodlama bölgeleri (ORF, açık okuma çerçeveleri) kontrolü altında eksprese edildiği, dokuya özgü aşırı ekspresyonu sağlardokuya özgü sürücüleri. Bunlar, normal olarak (örneğin Notokordun öncüler 8 ekspresyon için brachyury güçlendirici gibi) iyi bilinen genlerin cis -regulatory bölgelerini oluşturmaktadır. Raportör genler (LacZ veya yeşil fluoresan proteini, GFP) bunların in vivo aktivitesi ortaya burada tersine, elektroporasyon, yeni düzenleyici bölgelerin etkili bir analizi için bir araç olup. Tanımlama ve yeni bir düzenleyici bölge daha sonra elektroporasyon aracılı analizi (Cı -MYT için) için iş akışı, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Yerinde İfade ve Embriyolojik Verileri (Anason) 23 için Ascidian Ağı gibi ascidian özel genom tarayıcılarda 12,13, kolayca erişilebilir Ciona topluluk verileri, bir geniş repertuarı, düzenleyici bölgeler (Şekil 2A) in siliko tespiti için denetlenir. Daha sonra polimeraz zincir reaksiyonu (PSentezleme vektörlerine bu bölgelerin CR) göre klonlama in vivo elektroporasyon aracılı testleri için izin verir. (Şekil 2B). Şekil 2A genom tarayıcı screen-shot (turuncu, ilk üç ekson ve iki intronlar görülebilir) Ci -MYT için KH transkript modelinin yukarı bölgesini gösterir. Farklı genom tarayıcı parçaları fonksiyonel genom veriler, kromatin immunoprecipitation (ChIP) (burada ZicL, beyincik L Ci -çinko parmak için gösterilen) verilerine 14, iki ilişkili Ciona türlerinin 15,24 veya nükleozom arasındaki sekans korunması gibi, bu bölge için öngörülen açıklama doluluk 16,17 (üstten Şekil 2A aşağıya). Genel olarak, egzonik protein kodlama bölgeleri yüksek (Şekil 2A'da hizalama parça) muhafaza edilir. Ek yüksek koruma tepe memba kodlayıcı olmayan bölgeler ve birinci intronu görünür. Bunlardan ikisi nükleozom ücretsiz olduğu tahmin edilmektedirtranskripsiyon faktörlerine erişilebilirlik düşündüren bir dizi tabanlı algoritma 16,17 (Şekil 2A kırmızı kare) için şeklinizi ona göre. Nitekim, bağlayıcı Ci -ZicL transkripsiyon faktörü Chip-on-chip sinyalleri 14 (Şekil 2A yeşil çubuklar) bu iki korunmuş bölgelerde zenginleştirilmiştir. Ayrıca, potansiyel transkripsiyon faktörü bağlanma bölgeleri arar bir arabirim 25 kullanılarak, biz Ci -ZicL ChIP kümeleri (altı çizili ZIC-çekirdek, Şekil 2A ile turuncu oklar ve dizilerin) ile işaretlenmiş genom dizilerinin içinde yer alan ZIC siteleri belirledi. Ci -MYT ücretsiz düzenleyici bölgeler tahmin edilebileceği gibi ZicL (Şekil 1d) hedefleyen MO-enjeksiyon aracılı demonte deneylerinde gözlenen Ci -MYT ekspresyonunda azalma ile tutarlı olduğu nucleosome korunmuş olarak Ci -ZicL transkripsiyon faktörü bağlayıcı ve. sonra caydırmakCi -MYT ekspresyon için in silico olası cis -regulatory bölgeleri, maden Bu PCR Ciona genomik DNA'dan amplifiye edilir ve 19 plazmidler LacZ haberci klonlama rekombinasyon ile yerleştirilir. Yapıları daha sonra döllenmiş yumurta Ciona (Şekil 2B), elektroporasyona ve LacZ boyama ile aktiviteleri (Şekil 3) için analiz edilir. Şekil 3, siliko yaklaşım, böyle bir BT Cı -MYT mRNA ifade etki (Şekil 1a karşılaştırın) özetlemek iki ayrı sis -regulatory sekansları tanımlamak mümkün olduğunu göstermektedir. Genellikle geçici transgenik embriyolar DNA dahil yalnızca bu hücrelerde plazmid DNA gösterisi mozaik ifade ile electroporated. Mozaik LacZ ifadesi bu şekilde pmyt-R3 tarafından tahrik edilir ve Ci eksprese eden öncüler bulunabilir </em> -MYT MRNA yani arka sıra I nöral plak öncüleri ve ön sıraları gastrula ve erken neurula aşamalarında (sırasıyla Şekil 3a, b, mor ve kırmızı ok başları) de III / IV. Buna karşılık, pmyt-R5 sadece posterior (satır I) nöral plak öncüleri ve daha sonra neurula aşamasında (Şekil 3c, kırmızı ok başları) başlayan etkindir. Iki bölge böylece Ci-myt gen regülasyonu iki ayrı mekansal ve zamansal açıdan kodlamak. İlginçtir ki, her ikisi de düzenleyici bölgeler de (sırasıyla Şekil 3a, b, pembe, beyaz ve sarı ok başları) özellikle ön ve yan nöral plaka ve kasta, ISH görülmeyen ek öncüleri leke. Böyle geniş anlatım (lateral sinir kaderi bastıran gibi düğüm için Şekil 1e bakınız) izole düzenleyici parçaları yer almayan unsurları baskıcı işaret biriken ile saptanan düşük ekspresyon düzeyleri ya da olabilirLacZ enzimatik sinyali. Güçlendirici çalışmalara ek olarak, Ciona elektroporasyonla ayrıca aşırı ifadesi ile Ciona kodlayan genlerin işlevsel analizleri kolaylaştırır. Ciona tam uzunlukta ORF büyük bir koleksiyon topluma mevcuttur ve ayrıca hastalıkla ilişkili genlerin 18 dahil olmak üzere insan ortologlar için açıklamalı edildi. Bağımsız genler veya bu rekombinasyon klonlama tam uyumlu ORF cDNA kütüphanesinden (Şekil 2B) genlerin gruplar da embriyolar ifade edilmesi uygun sürücülerin içeren hedef vektörleri içine aktarılır. Elde edilen ifade klonlar ayrıca cis -regulatory muhabiri ile birlikte electroporated olabilir artırıcı aktivasyonu kendi varsayılan rol test oluşturur. Şekil 2B transkripsiyon için tam ORF klonlarının izolasyonu göstermektedir Ci -ZicL ve JJ.Ci- GATAa ve recombinatio faktörlerin, erken pan-ektodermal ifadesi 15 Gata düzenleyici bölge (pfog sürücüsü) Of Arkadaşlar Arasına translasyonel etiketleri 19 (örneğin yeşil floresan Venüs veya viral hemaglütinin (HA) Etiketleme-) ve bir doku özel bir sürücü içerebilir uyarlanmış hedef vektörleri içine Bu çalışmada kullanılan. Ektodermal ve nöroektodermal dokularda Ci -ZicL aşırı ifadesinin etkisi pmyt-R3> LacZ ve pmyt-R5> LacZ muhabir eş elektroporasyon (Şekil 3b ', B' ve C ', C' ', sırasıyla) ile analiz edilmiştir. Bizim elektroporasyon analizleri ve ', B' ve C-Cı -ZicL pmyt-R3 ile Ci -MYT sentezlenmesini aktive edebildiğine ve her iki raportör yapı olarak pmyt-R5 arttırıcı bölgeleri ektodermal bölgelerinde dış lacZ ekspresyonu (Şekil 3b'de yeşil ok başları olduğunu düşündürmektedir# 39;, c '). Şekil 3d'de gösterildiği gibi, Ciona yumurta yüzlerce plazmid DNA, elektroporasyon, konsantrasyona bağlı pan-ektodermal Cı -ZicL tanımlanması üzerine ektopik pmyt-R3> LacZ ifadesi için gösterilen sentezleme değişiklikler istatistiksel olarak ilgili ölçümü sağlar. In vivo hücre içi lokalizasyonu için Elektroporasyon (Şekil 2B şematize) uyarlanmış ifade yapıları kullanarak ektodermal blastomer olarak elektroporasyon üzerine ifade edildiğinde Şekil 4 etiketlenmiş transkripsiyon faktörlerinin hücre içi lokalizasyonu göstermektedir. Venüs etiketi (Şekil 4b) ya da bir HA-etiketi (Şekil 4C) ve ektodermal dokularında onlara aşırı ifade ile (örneğin, Cı -GATAa gibi) C-terminal ile etiketleme transkripsiyon faktörleri (pfog tarafından) Bir transkripsiyon faktörü beklendiği gibi Venüs ifade sitoplazma dahil her yerde ise in vivo, 'Ci -GATAa çoğunlukla, çekirdeklerin lokalize olduğunu görebiliyoruz. Benzer deneyler, muhtemelen farklı etiketler ile birlikte-lokalizasyonunu ortaya bireysel ya da transkripsiyon faktörleri kombinasyonlarının, zaman içinde hücre içi lokalizasyon dinamiklerini incelemek için gerçekleştirilebilir. Şekil 1:. WT ve Morfolino (MO) 'de Ciona yumurta mikroenjeksiyon Ci -MYT düzenleme değerlendirilmesi Ci -MYT mRNA ifade embriyolar enjekte. Sinir plaka Ci -MYT (a) WT salgılama modeli. (A '), nöral plakasına (NP) lekeli öncüleri şematik temsili. Satır I / II: Posterior nöral kaderi; Satır III / IV: ön nöral kaderi; Satır V / VI: palp kader. ( <stron.. g> b – g) Imai ve diğ uyarlanan erken Ciona GRN (resim katılmak belirtilen genleri aşağı vurma için çeşitli MOS mikroenjeksiyon üzerine Ci -MYT ifade 2006) 11 Ci -MYT, Ci transkripsiyon faktörü -myelin; WT, vahşi tip; mavi ok uçları: Ci -MYT sinyal kaybı; Kırmızı ok uçları: ektopik Ci -MYT sinyali. = 100 mikron tüm görüntüleri atıfta Ölçek çubuğu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2: siliko arttırıcı bölgelerin arama ve rekombinasyon Ciona embriyolar elektroporasyon ile geçici transgenesis için klonlama için iş akışı (A) anason 23 asci A anlık.MİT – dian genom tarayıcı Ci yukarı akışlı düzenleyici sekanslar tanımlar. Kırmızı çerçeveleri, iki olası cis -regulatory bölge işareti pmyt-R3 (scaffold_196: 76883..77079) ve pmyt-R5, (scaffold_196: 75856..76041) elektroporasyon ile analiz için seçildi. Parça isimleri: ZicL sondalar: ChIP-on-Chip verileri 14; KH2012 Tutanaklar: Ciona transkript modelleri intestinalis; Hizalama Skor Cs / Ci LastZ: Ciona savignyi (Cs) / Ciona intestinalis (Ci) 15,24 arasındaki dizi korunumu; . Segal 2006 nucleosome doluluk sürüm 1 tahmin Yönetim tarafından Segal ve ark hesaplama algoritması eğitimli civciv, 2006 16 Khoueiry olarak Ci uygulanan ark 2010 17 Yeşil çubuklar.:. Ci -ZicL ChIP 14 zirveleri; turuncu oklar: ZIC siteleri tahmin; GCTG: Çekirdek ZIC bağlama bölgesi. Bir soy gelen aşırı yapıları oluşturmak için (B) Şema. Daha sonra, in vivo saati CI (örneğin pmyt-R3> LacZ veya pmyt-R5> LacZ gibi) raportör yapılan ile birlikte elektropore dokuya özgü sürücüleri (pfog) ve protein etiketleri içeren hedef vektörleri içine rekombine tam uzunlukta bir ORF cDNA kütüphanesi, – MYT, Ci -myelin transkripsiyon faktörü, Ci -ZicL, beyincik L transkripsiyon faktörü Ci -çinko parmak;. pfog, GATA Ci -arkadaşlarlar düzenleyici bölgesi bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. . Şekil 3: orta gastrul de Ci -MYT LacZ lekeli embriyoların Ci -ZicL uyarılabilir uzay-zamansal sis -Yönetmeliği gösteren Electroporated Ciona embriyolarbir (mG) / geç gastrula (LG) veya erken neurula (eN) aşama bu da pmyt-R3> LacZ veya pmyt-R5> LacZ ve bir kontrol yapısı (pfog> mCherry) ya da pfog ile birlikte electroporated gösterilmiştir> ZicL. Pfog sürücüsü 19 ektoderm ve nöroektoderm ektopik (pan-hayvan) ZicL ifadesini aracılık ve bu hücrelerde ektopik LacZ leke neden olur. MG / lG sahne embriyoların (küçük ok başları, sol panel) veya buna renkli şematik topraklarında (a) pmyt-R3 LacZ aktivitesi (mavi çevreler, sağ panel); bitkisel görünüm (vg). Satır I / II: Posterior nöral kaderi; Satır III / IV: ön nöral kaderi; Satır V / VI: palp kader. A gibi dokularda eN aşamada (b) pmyt-R3 aktivitesi. Cı -ZicL eş elektroporasyon durumunda (B '), dış pmyt-R3'ün aktivitesi yeşil ok uçları ile gösterilir. (B '' b) 'de olduğu gibi aynı embriyo, yönelik hayvan kutup kadar (bir). ( <strOng> tr aşamaları (c ') Cı -ZicL eş elektroporasyon üzerine Ektopik pmyt-R5, etkinliği, c) pmyt-R5, lacZ faaliyetinin yeşil ok uçları ile gösterilir. (C '') c aynı embriyolar 'ancak odaklı hayvan kutup kadar (bir). Ci -ZicL için Örnek deneylerin (d) Niceleme düşük konsantrasyonlarda pmyt-R3 aktive aşırı. Bir biyolojik tekrar temsil edilir Ci -MYT, Ci -myelin transkripsiyon faktörü;. Ci -ZicL, beyincik L transkripsiyon faktörü Ci -çinko parmak, Ci -FOG, GATA Ci -arkadaşlarlar; WT, vahşi tip; mG, orta gastrula; lG, geç gastrula; eN erken neurula; Bir hayvan görünümü; vg, bitkisel görünümü; NLS LacZ, LacZ için nükleer lokalizasyon sinyali. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız. Şekil 4:. Venüs-etiketli veya Hemagglutinin- (HA) elektroporasyon Yerelleştirme üzerine proteinlerin Diferansiyel hücre içi lokalizasyonu pfog sürücüsü 19 kullanılarak ektodermal hücrelerinde aşırı proteinleri etiketli. (A – c) DIC görüntüleri. Floresans görüntüleri ilgili (A ', B'). TRITC ile bağışıklık histolojik etiketleme üzerine floresan görüntü İlgili (c '). Ölçek çubuğu = 100 mikron tüm görüntüleri anlamına gelir. DIC, Diferansiyel Girişim Kontrast. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

RNA ya da DNA ve DNA elektroporasyon, mikroenjeksiyon: Transgenik Ciona embriyolar oluşturmak için iki ana teknik vardır. Ciona embriyolar gen pertürbasyon için bu teknikler ilk 1990'larda 7,8 kullanılan ve o andan itibaren arka arkaya geliştirilmiş ve şu anda dünya çapında Ciona (ve diğer ascidian cins) 20 yararlanılmıştır.

Protokolde kritik adımlar

Kolayca yetişkin hayvanların toplanan Ciona gamet içinde başarılı transgenezi kritik bir dizi faktöre bağlıdır. gamet kalitesi (yetişkinler 2-4 hafta boyunca sağlıklı kalmak doğru tuzluluk at) akvaryumlarda deniz suyu kalitesine, (su sıcaklığı ve oksijenasyon ile değişen, Kuzey Atlantik'te genellikle Mayıs-Aralık) yumurtlama sezonu bağlıdır ve nihayet çeşitli adımlar için aşağıda detaylı olarak yetişkinlerden çıkarma üzerine gamet doğru kullanımı üzerindeprotokol.

Hazırlık aşamaları sırasında, musluk suyu ile Pasteur pipetler kuluçka agaroz salınan zehirli maddeleri kaldıracak yapışmasını ve agaroz kaplı petri kutularının deniz suyu ön inkübasyon embriyolar önleyecektir. Genel olarak, yemekler bakteri gelişimini önlemek için 4 ° C'de saklandı kullanımdan önce 2 hafta kadar hazırlanabilir ve kullanımdan önce taze durulanmıştır. Eski Bir gün, küçük yemekler enjeksiyonlar için en görünmektedir.

dechorionation Verimlilik ve uzunluk gelişimine zarar edecek yumurta / embriyo uzun süreli tedavisinde protokolde çok önemli bir adımdır. Dikkatli hazırlanması (Resim sarsıntı) ve (en fazla bir hafta boyunca 4 ° C'de) doğru depolama dechorionation çözeltisi kalitesini korur. Her iki uzun saat / gün boyunca oda sıcaklığında tutuldu, özellikle, eğer, hazırlama veya zaman içinde çok şiddetle karıştırılır, eğer çözelti içinde proteazlar verim kaybı. Biz uygun taze dechorionation çözümü kullanarak bu kritik adımı optimize20x stok çözeltisi donmuş madde şişeleri hazırlanabilir.

pipet zararlı olacak ise kırılgan dechorionated yumurta / embriyo doğru kullanımı önemlidir ve kesme ya da embriyoların bıçaklama olduğunu. pipetleme, embriyolar süspansiyon içinde yatay konumda yerine dikey cam pipet tutarken, (hafifçe yumuşak ama hızlı pipetleme ardından onları girdap sıvıyı 'esen') tarafından mümkün olduğunca muhafaza edildiğinde. Bu tür bakım yıkama, tabanda ve yumurta transferi için tüm pipetleme adımları için geçerlidir / embriyo ve tüpler, küvetleri ya da plakalar, dışarı tespit öncesi ve sonrası içinde. Sabit embriyoların karşı canlı fiksatif kalıntılarından herhangi bir toksisite önlemek için fiksasyon üzerine, özel bakım da ayrı pipetleme cihazlarına alınmalıdır.

Mikroenjeksiyon nedeniyle küçük boyutu ve vitellin membran sağlamlığına Ciona yumurta / embriyolarda oldukça zor ve kritik bir optimize edilmiş uç boyutuna bağlıdırenjeksiyon iğne, (yumurta yarıçap boyunca tek bir satırda iğne hareketi) enjeksiyonu mükemmel bir açı ve (enjeksiyon için önce aspirasyon emme ile) vitellin membran ince ayarlı bir manuel kırılma. hava kabarcıkları tamamen emme / enjeksiyon basıncını yumuşatma için mineral yağ içeren enjeksiyon tüp elendiği takdirde ikinci mümkündür. Buna ek olarak, toz veya yumurta enkaz küçük parçaları iğne tıkayabilir olacak ve kolayca temiz çalışma koşulları ve enjeksiyon yemeğin transferden önce yumurta durulama adımlarla önlenir. Mesaj enjeksiyon, taze yemekler üzerine yumurta transferi enjeksiyon prosedürü hayatta sahip değil ölü embriyo toksik etkilerini önlemek olacaktır.

Sorun giderme

prosedür Potansiyel sorunları Aşağıdaki çözümlerle ele alınabilir. Düşük fertilizasyon oranları yetersiz sperm aktivasyonu düşük yumurta temizlik veya büyük gübreleme miktarlar ortaya çıkabilir. freshl kullanınY bir araya toplanmış ve daha sperm seyreltilmiştir. aktivasyon üzerine sperm hareketini kontrol edin. Adım 4.2'de tarif edildiği gibi, döllenme öncesi ASWh yumurta yıkayın. su hacmini azaltmak ve / kuyu gübreleme tabak başına yumurta miktarını azaltır. Hazırlık adımları sırasında kaybetme embriyolar daha verimli undechorionated yumurta / embriyoların aşağı santrifüj dechorionation çözümün bir damla ekleyerek önlenebilir. Dechorionation zamanı değil sediment ve uzun süreli dechorionation, toksik embriyolar patlamaya neden olacak kısmen dechorionated yumurta gibi optimize edilmelidir.

Asenkron gelişme diseksiyonu sırasında ortaya çıkan artık sperm kaynaklanabilir. Kontrolsüz çapraz döllenme önlemek için farklı hayvanların ayrılan yumurta toplu tutun. Anormal gelişim çeşitli nedenleri olabilir. Başlangıçta ve sezon sonunda ayrılmış farklı bireylerin embriyo tuttuktan sonra, en iyi toplu seçilebilir. için embriyolar karışmasını önlemekdöllenme izleyin 10 dakika kendi ooplazmik ayrışma girişimi önlemek için. pipet kısmi embriyolar kardeş blastomer ve sonuçları ayıran olarak transfer edilirken embriyolar bölünmesi başlamadı emin olun. polyspermy önlemek için dechorionated yumurta daha az sperm kullanın. taze hazırlanmış ancak durulanır agaroz yemekleri kullanın. pipet cihazı fiksatif serbest olduğundan emin olun. dechorionated değil ve kesintiye hangi adım gelişimi de tespit electroporated değil kontrol embriyolar tutun. kirlenme ve ayrışma meydana gelirse antibiyotiklerle embriyolar tamamlar.

enjeksiyon cihazı 'tıkanmış,' Eğer enjeksiyon iğnesi açılışı, lekeli bazı içerik kovma tarafından doğrulanmadı olabilir. Tıkanma malzeme dikkatlice agaroz yoluyla iğne ucu sürükleyerek sildi olabilir. Hava enjeksiyon borusunun kabarcıkları ve / veya iğne çıkarılmalıdır. nee olarak enjeksiyon hacminin daha iyi kontrol için iğne değiştirmedle ucu kırmak ya da enjeksiyon boyunca tıkayabilir. yumurta durulayın ve enkaz tabağına birikmiş ise, temiz bir enjeksiyon tabağına yerleştirin. Herhangi bir küçük parçacık veya kristalleri çökeltmek için taze iğneler doldurulmadan önce enjeksiyon solüsyonu santrifüjleyin. Ayrıca yararlı sadece hayati boya ile enjeksiyon uygulamaktadır. Enjekte ve olmayan enjekte yumurta gübreleme ile enjeksiyon tekniği doğrulayın. Son olarak, tecrübeli bir meslektaşı ile danışmanlık enjeksiyon tekniğini geliştirmek için yararlı olabilir.

Off-hedef etkilerini kontrol için ikinci bir örtüşmeyen sadakatle Ciona içinde belirsiz fenotipik etkiler ekarte edebilir MOS tarafından tanınmayan bir modifiye mRNA ile MO ve kurtarma.

Mikroenjeksiyon: önemi ve sınırlamalar

Ciona Mikroenjeksiyon bir kordalı 11 bütün bir embriyo gen düzenleyici ağ (GRN) ilk planı oluşturmak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, böyle bir Rema rağmenCiona embriyolar rkable kazanılan, mikroenjeksiyon bağlı Ciona yumurta nispeten küçük (çapı 0.14 mm), bir sınırlama vardır. Yabancı DNA / mRNA microinjections tarafından tanıtılan diğer kordalı türlerinin kıyasla, Ciona yumurta işlemek için nispeten zordur ve deney başına enjekte Ciona embriyo oranı kantitatif analizleri engelleyen, (deney başına ortalama 30 ile 50 embriyolar üzerinde) düşük kalmaktadır. Bununla birlikte, Ciona içinde bozucu anne faktörleri, MOS mikroenjeksiyon de 16 ila 32 hücreden gelişme zigotik başlangıcı katılımlarını 15 aşamaları incelemek için tercih edilen bir yöntemdir. Buna ek olarak, çok daha zor, 16-32 hücre aşamasına kadar olan ayrı ayrı blastomerlerdir Microinject olsa mümkündür. Son olarak, mikro-enjeksiyon, Ciona dışında ascidian türlerinde (mRNA veya DNA enjeksiyon) transgenik embriyo üretilmesi için en etkili yöntem olmaya devam etmektedir, tam Optimi olanzed elektroporasyon protokolleri yoktur.

Elektroporasyon: önemi ve sınırlamalar

Geliştirdiği ve Zeller ark optimize edilmiş ve standart protokolü olarak yayımlanan bu yana az sayıda ve mikroenjeksiyon diğer kısıtlamaları aşmak için, Ciona toplumun en plazmid DNA elektroporasyon kullandı. 2004 yılında 9. Nitekim, transgenik Ciona embriyoların binlerce eş zamanlı olarak, bir küvet içinde elektroporasyona 500 embriyolar 16 msn tek bir 50 V darbesi kullanılarak bir saat içinde oluşturulabilir. Transgenik embriyoların büyük sayıda üretme yaklaşımı hala kordalı model organizmalar arasında benzersizdir. Hızla in vivo gerçekleştirmek için güçlü bir model sistem olarak kabul edilmesi için buraya örneklendiği gibi bu potansiyel sis -regulatory bölgeler ve hücre içi / hücre lokalizasyonu analizleri Ciona açmıştı.

electroporati rağmenCiona zigotlardan temelde kordalı GRN araştırma alanını devrim üzerine, teknik yine bazı sınırlamalar ile karşı karşıya. İlk olarak, plazmidler geçici Ciona embriyolar sokulur ve büyük olasılıkla spekülatif plazmıd DNA kararlılığını hale ekstrakromozomal dizileri devralınır. Bundan başka, nedenle fenotipik dalgalanmalar sonucu, zigot başına alınacaktır elektroporasyona plazmid kopyalarını kontrol etmek için, belki de hatta imkansız, çok zordur. elektroporasyon sonuçları yorumlamak zor yapan bir başka sorun, biz Mozaiklik dediğimiz bir olgudur. Plazmıd DNA, tek hücreli aşamada embriyo farklı pozisyonlarda alınmış olabilir; hangi soyundan blastomer tarafından devralınacak olan ve zigot birçok dörtte plazmid alacaksınız nasıl belirler. Bu varyasyonlar açıkça nicel etkilerinin yorumlanması daha da zorlaştırmaktadır. Ancak, electropora en sorunları gelmekyon değişkenliği sayma ve tek bir toplu kolayca elde edilebilir LacZ (ya da GFP) pozitif hücreler, istatistikler, biyolojik numunelerin uygun bir miktarda çözülür.

Çok yönlülük ve genetik mühendisliği için elektroporasyon potansiyeli

Elektroporasyon sonunda kez raportör veya ekspresyon plazmidleri klonlanmıştır olası cis -regulatory bölgeler ve gen fonksiyonunun kantitatif analiz orta verimli tarama sağlar. Kompakt Ciona genomuna, tanımlama ve potansiyel düzenleyici bölgelerin klonlama 3 oldukça basittir. Yorumu veri zenginliği kullanılması için bir strateji, Şekil 2A'da gösterilmiştir. Muhabir ve gen kodlayan plazmid klonlanması daha Ciona nesil tarafından adapte kolaylaştırılır, GATEWAY uyumlu vektör suit 19 ve uyumlu bir tam uzunlukta ORF kütüphane 18. Her iki araç topluma mevcuttur veŞekil 2B'de gösterildiği gibi, düzenleme sürücüleri ve kodlama bölgelerinin verimli kısıtlayıcı enzim içermeyen rekombinasyon için izin verir.

Son yıllarda, elektroporasyon başarılı dokuya özgü sürücüsü 21,22 kontrolü altında CRISPR / Cas9 bileşenleri gibi gen düzenleme araçları ifade plazmid doku-hedefli gen manipülasyonu elde etmek için uyarlanmıştır. Bu tür yaklaşımlar hızla transkripsiyon faktörü doku oluşumunda rol oynayan kodları ve pluripotensin gelen kademeli çıkış dahil GRNs dinamikleri ve potansiyel korunmuş sinyal mekanizmaları, anlayışımızı ilerler. Ayrıca, elektroporasyon kullanarak doku-spesifik kaybı: ya da (CRISPR / Cas9 veya aşırı ifadesi ile) elde fonksiyon-yaklaşımları insan hastalıkla ilişkili genlerin Ciona ortologlarını incelemek için vesile olacaktır. Nitekim, klonlar kodlama Ciona insan hastalık genlerinin ortologlar ve onların tam uzunlukta ORF için kataloglar kolayca uygunlğ vardırCiona 1 8 analizi için le. Omurgalıların genom mükerrer yürütülmesi nedeniyle, çoğu insan genleri gen fonksiyonu 1 analizlerini karmaşık hale işlevsel gereksiz paraloglar sahiptirler. Ciona gibi önemli, genellikle işlevsel korunmuş genlerin temel rollerini ortaya çıkarmak gerekir larva tipik kordalı doku düzenleme ile daha basit bir sistem olma.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the University of Innsbruck, Austria, and the Austrian Academy of Sciences (ÖAW).

Materials

Lab with constant temp. (~ 18°C)  For embryo work
Ciona intestinalis adults UPMC – Station Biologique,
Roscoff, France		 For collecting gametes
NaCl Roth 3957.1 For ASWH
KCl Roth 6781.1 For ASWH
CaCl2x2H2O Roth A119.1 For ASWH
MgCl2x6H2O Roth 2189.1 For ASWH
MgS04x7H2O Roth P027.2 For ASWH
NaHCO3 Roth 6885.1 For ASWH
Hepes  Roth HN78.3 For ASWH
Sodium thioglycolate  Sigma MZ-6 For Dechorionation
Pronase  Sigma T0632-100G For Dechorionation
D-Mannitol  Sigma Aldrich M9546-250G For electroporation
Plasmid DNA (prep >1µg/µl) Macherey-Nagel 740410.100 For electroporation or microinjection
Agarose any supplier For coating embryo culture dishes
Plastic petri dishes VWR 612-2079 Coated with 1% Agarose in ASWH, covered with ASWH
Small scissors any supplier For dissecting gametes
NaOH  Roth 6771.1 For activating dechorionation solution
Tris  Roth 5429.3 1M pH9.5, for sperm activation
Pasteur pipettes  VWR 612-1701 Treated by immersion in tap water for at least 12h
Hand centrifuge Hettich Zentrifugen 1011 Use glass centrifuge tubes
1.5ml Eppendorf tubes Sigma T3406-250EA
2ml Eppendorf tubes Sigma T3531-200EA
Square electroporator Bio Rad Gene Pulser Xcell
Electroporation cuvettes 4 mm Eurogentec CE-0004-50
Coverslips Sto Premium PR248212600
Glass slides VWR ECN 613-1551
Glutaraldehyde Sigma G6257-10ML For fixation in LacZ staining
Paraformaldehyde Sigma  P6148-500G For fixation of fluorescent samples
Vectashield Vector H-1000 For mounting of fluorescent samples
X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-Galactopyranoside) Roth 2315.2 LacZ substrate; stock in 40mg/ml DMF (Dimethylformamide)
K5Fe(CN)6 Merck 4984 For LacZ staining buffer
K3Fe(CN)6 Merck 4973 For LacZ staining buffer
Na22HPO4 Roth 4984.2 For PBT
KH2PO4 Roth 3904.2 For PBT
Tween  Sigma SLBJ5103V For PBT
Mineral Oil Sigma M8410 Embryo culture tested
Green Vital Dye Fast Green Sigma  F7251 for microinjection; 10µg/µl
Micropipette Puller (Flaming/Brown) Sutter Instruments Model P-97 For pulling injection needles
Borosilicate glass capillaries GC100TF-10 Harvard Apparatus Ltd. UK 30-0038 1.0mm O.D. x0.78mm I.D., containing filament, for microinjection
Micromanipulator Narishige MWS-2 Three-axis Oil Hydraulic System; for 3D fine movement during injection
Injection holder Narishige 1M-H1 For holding injection needles, entire system filled with mineral oil
All Glass Syringe Walter Graf & Co GmbH & Co. KG  No. 95199.10427A4 10ml FortunaOptima; filled with mineral oil, for fine tuning of microinjection pressure 
Morpholinos  GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA Injection at 0.25-0.5mM
Capped mRNA Ambion mMessage mMashine kit Injection at 0.05-0.5µg/µl 
Plasmid DNA Injection at 20 ng/µl
Recombination cloning kit Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen 11789-013
Recombination cloning kit Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen 11791-019
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Holland, P. W., Garcia-Fernandez, J., Williams, N. A., Sidow, A. Gene duplications and the origins of vertebrate development. Dev Suppl. 120 (1), 125-133 (1994).
  2. Simmen, M. W., Leitgeb, S., Clark, V. H., Jones, S. J., Bird, A. Gene number in an invertebrate chordate, Ciona intestinalis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (8), 4437-4440 (1998).
  3. Dehal, P., et al. The draft genome of Ciona intestinalis: insights into chordate and vertebrate origins. Science. 298 (5601), 2157-2167 (2002).
  4. Satoh, N., Satou, Y., Davidson, B., Levine, M. Ciona intestinalis: an emerging model for whole-genome analyses. Trends Genet. 19 (7), 376-381 (2003).
  5. Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
  6. Lemaire, P. Unfolding a chordate developmental program, one cell at a time: invariant cell lineages, short-range inductions and evolutionary plasticity in ascidians. Dev Biol. 332 (1), 48-60 (2009).
  7. Hikosaka, A., Satoh, N., Makabe, K. Regulated spatial expression of fusion gene constructs with the 5′ upstream region of Halocynthia roretzi muscle actin gene in Ciona savignyi embryos. Roux’s Arch Dev Biol. 203 (1-2), 104-112 (1993).
  8. Corbo, J. C., Levine, M., Zeller, R. W. Characterization of a notochord-specific enhancer from the Brachyury promoter region of the ascidian, Ciona intestinalis. Development. 124 (3), 589-602 (1997).
  9. Zeller, W. R. Generation and use of transgenic ascidian embryos. Methods Cell Biol. 74 (74), 13-30 (2004).
  10. Satou, Y., Imai, K. S., Satoh, N. Action of morpholinos in Ciona embryos. Genesis. 30 (3), 103-106 (2001).
  11. Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312 (5777), 1183-1187 (2006).
  12. Tassy, O., et al. The ANISEED database: digital representation, formalization, and elucidation of a chordate developmental program. Genome Res. 20 (10), 1459-1468 (2010).
  13. Brozovic, M., et al. ANISEED 2015: a digital framework for the comparative developmental biology of ascidians. Nucleic Acids Res. , (2015).
  14. Kubo, A., et al. Genomic cis-regulatory networks in the early Ciona intestinalis embryo. Development. 137 (10), 1613-1623 (2010).
  15. Rothbächer, U., Bertrand, V., Lamy, C., Lemaire, P. A combinatorial code of maternal GATA, Ets and β-catenin-TCF transcription factors specifies and patterns the early ascidian ectoderm. Development. 134 (22), 4023-4032 (2007).
  16. Segal, E., et al. A genomic code for nucleosome positioning. Nature. 442 (7104), 772-778 (2006).
  17. Khoueiry, P., et al. A cis-regulatory signature in ascidians and flies, independent of transcription factor binding sites. Curr Biol. 20 (9), 792-802 (2010).
  18. Gilchrist, M. J., et al. A pipeline for the systematic identification of non-redundant full-ORF cDNAs for polymorphic and evolutionary divergent genomes: Application to the ascidian Ciona intestinalis. Dev Biol. 404 (2), 149-163 (2015).
  19. Roure, A., et al. A multicassette Gateway vector set for high throughput and comparative analyses in ciona and vertebrate embryos. PLoS One. 2 (9), e916 (2007).
  20. Kumano, G., Takatori, N., Negishi, T., Takada, T., Nishida, H. A maternal factor unique to ascidians silences the germline via binding to P-TEFb and RNAP II regulation. Curr Biol. 21 (15), 1308-1313 (2011).
  21. Sasaki, H., Yoshida, K., Hozumi, A., Sasakura, Y. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the ascidian Ciona intestinalis. Dev Growth Differ. 56 (7), 499-510 (2014).
  22. Stolfi, A., Gandhi, S., Salek, F., Christiaen, L. Tissue-specific genome editing in Ciona embryos by CRISPR/Cas9. Development. 141 (21), 4115-4120 (2014).

Tags

Ciona IntestinalisEmbryo MicroinjectionEmbryo ElectroporationGene RegulationChordate DevelopmentMolecular GeneticsStem Cell ResearchDrug DiscoveryDechorionationZygoteSperm Activation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Kari, W., Zeng, F., Zitzelsberger, L., Will, J., Rothbächer, U. Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis. J. Vis. Exp. (116), e54313, doi:10.3791/54313 (2016).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image