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Biologia do Desenvolvimento

La microinyección de embriones y la electroporación en el Chordate<em> Ciona intestinalis</em

Published: October 16, 2016
doi:
10.3791/54313
, , , ,
1Department of Evolution and Developmental Biology, Zoological Institute,University Innsbruck

Summary

Presentamos la transgénesis y transitoria gen desmontables en Ciona intestinalis, un grupo hermano cordado a los vertebrados, utilizando técnicas de microinyección y electroporación. Tales métodos facilitan la genómica funcional en este sencillo de invertebrados que cuenta con características rudimentarias de vertebrados, incluyendo notocorda y epitelios sensoriales cabeza, y muchos ortólogos de genes de enfermedades humanas asociadas.

Abstract

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Introduction

Recientemente, la secuencia del genoma y repertorios de genes transcritos se han hecho accesibles en una serie de organismos modelo. Determinar enlaces funcionales de genes, sin embargo, y cómo estas conexiones están cableados en el ADN para ejecutar la actividad transcripcional a través del tiempo y el espacio embrionario, siendo un reto importante, especialmente en los vertebrados. La complejidad de las interacciones reguladoras y la complejidad de los genomas de 1,2, en particular en los vertebrados, ralentizan análisis funcionales eficientes, en particular a nivel del ADN in vivo. De hecho, ningún GRN se analiza la actualidad desde la fertilización hasta el estado final, diferenciación terminal del organismo en desarrollo.

La ascidia C. intestinalis representa un organismo modelo en el que tan completa GRN analiza puede ser posible. Tiene un genoma no duplicado típico de invertebrados con poca redundancia génica. Vertebrados, por el contrario han sido objeto de dos rondas de duplicaciones del genoma que have genera grandes familias de genes y la diversificación funcional, sino también la redundancia entre parálogos. Las secuencias cis-regulador compactas (las unidades de control de GRNs) de C. intestinalis, y un linaje embrionario invariable con pocas células son una reminiscencia de C. elegans. Por otra parte, su posición filogenética única como un grupo hermano de invertebrados a los vertebrados dentro de los cordados permite la observación del desarrollo, con una resolución celular, del plan corporal cordado formando 3-6.

La cuestión clave que garantiza el éxito futuro de la genómica funcional en organismos modelo es la generación de un gran número de embriones para cuantitativos en vivo perturbaciones. El desarrollo de la técnica de microinyección en huevos Ciona 7, y la posibilidad de obtener rápidamente muchos animales transgénicos transitoriamente por electroporación in vivo en cientos de Ciona cigotos 8,9 ha sido un gran avance en <em> Genómica funcional Ciona. Aquí, primero presentamos la técnica de microinyección más laborioso para la orientación genes individuales que sigue siendo el método de elección para morfolino (MO) desmontables gen mediada, en particular de los transcritos maternos. oligos MO suelen centrarse en el iniciador ATG o los sitios de empalme de ARN e interfieren con la traducción de proteínas. A continuación, muestran cómo la electroporación en huevos fertilizados de Ciona permite un gran número de embriones para ser analizados de una manera cuantitativa, abriendo así las vías de análisis eficiente de los potenciadores in vivo y de ganancia-específica de tejido o pérdida de función de los enfoques, con el posibilidad de manipulaciones y análisis simultáneos. Además, demuestran cómo se utilizan las herramientas de la comunidad Ciona para la predicción in silico de las regiones reguladoras y la clonación eficiente de los marcos de lectura abierta (ORFs) completos en vectores de expresión. Por último, demostrar diferenciales localizaciones subcelulares de fluorescencia etiquetadoso proteínas a la sobreexpresión marcada por electroporación.

Protocol

1. Preparativos para la microinyección y electroporación en Ciona Huevos y cigotos Preparar 10 L de agua de mar artificial con HEPES (ASWH) para el cultivo de embriones. Disolver mM NaCl 420, 9 mM KCl, 10 mM de CaCl2 · 2H 2 O, mM MgCl 24,5 2 · 6H 2 O, 25,5 mM de MgSO4 · 7H 2 O y 2,15 mM de NaHCO3 en agua doblemente destilada (ddH2O) por agitación durante la noche. Añadir 5 mM HEPES pH 8,0, y verificar / ajustar el pH a 8,0. Almacenar el ASWH a 4 ° C. Deje que se caliente a 18 ° C y filtrar con papel de filtro antes de su uso. Preparar 20x solución dechorionation inactivada: 20% tioglicolato de sodio, 1% en pronasa ASWH. Almacenar 500 ml de alícuotas a -20 ° C, y se diluye hasta un volumen final de 10 ml ASWH antes de su uso. Preparar 15 a 20 placas de cultivo de los huevos / embriones. Verter fundida de agarosa al 1% en ASWH en 3,5, 5, 9 ó 15 cm de petri platos, recubrimiento con una capa delgada de 1-2 mm.Deje que la agarosa solidifique y cubrir las placas con ASWH. Existencias de las mismas a 4 ° C durante 1-2 semanas como máximo. Vuelva a colocar la ASWH antes de su uso. Preparar platos especiales de inyección. Verter una capa gruesa de 5-7 mm de fundido 1% de agarosa en una placa de Petri de 5 cm, y colocar un molde en la agarosa (tal como un cierre de bloqueo de cremallera, pegada a una hoja de la cubierta de plástico) para producir una muesca a la solidificación de la agarosa que pueden contener los huevos. Preparar 4 a 5 platos de inyección y cubrir con ASWH. Almacenar a 4 ° C y reemplazar con ASWH fresca antes de su uso. Utilice únicamente placas nuevas para inyección (máximo un día de edad). Preparar β-galactosidasa (LacZ) tampón de tinción: mM MgCl 1 2 · 6H 2 O, 3 mM de K 4 [Fe (CN) 6] · 3H 2 O, 3 mM K 3 [Fe (CN) 6] en tampón fosfato- de solución salina (PBS) con Tween (PBT) (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, 0,05% de Tween). i tiendan la oscuridad a 4 ° C. Preparar sustrato LacZ ß-D-galactopiranósido 5-Bromo-4-cloro-3-indolilo (X-gal, 10 U / ml) en alícuotas de 40 mg / ml en dimetilformamida (DMF) y las existencias almacenar a -20 ° C hasta utilizar. Remojar pipetas Pasteur de grifo agua durante la noche para evitar que los embriones se peguen. Preparar agujas de inyección. Configurar un extractor de micropipeta en condiciones tales como calor 425, tire 75, la velocidad y la hora 75 200 (a partir de un ensayo de la rampa de filamento de 415). Tire de 4 a 5 capilares de vidrio que contiene filamentos para producir 8 a 10 agujas largas y finas normalmente cerrados en la punta. Almacenar las agujas en la caja de aguja libre de polvo, que se adjunta para doblar la cinta adhesiva sobre un soporte elevado, para evitar romper las puntas y que es conveniente para el llenado de la aguja. NOTA: Prueba de las agujas obtenidos mediante la inyección de un par de huevos con colorante vital verde (como se describe en la sección 6) y ajustar la aguja tirando de las condiciones para obtener una forma de punta que permite afinado y repetitive inyección como se describe en 6.6. Preparar la solución de inyección. Preparar 4 l de solución de inyección, por ejemplo, compuesto de 1 l de MO 2 mM, 2 l de 10 mg / l colorante vital verde y 1 l ddH2O Añadir una concentración final de 0,05 a 0,5 g / l capsulado mRNA o 20 ng / l de ADN plásmido de acuerdo con la pregunta experimental. Mezclar bien. Mantener en hielo si la solución contiene ARNm. 2. Recolección de gametos Dissect Ciona adultos en un 18 ° C enfriaron habitación embrión. Utilice pequeñas tijeras y empezar desde el extremo que se opone a los sifones en el lado de la exhalación (más corto) de sifón según el cual el oviducto y el tramo de conducto de esperma. Exponer el oviducto y delicadamente hacer una incisión en el oviducto usando la punta de las tijeras. Caída de los huevos que fluye hacia fuera directamente en una placa de 6 pocillos que contiene ASWH presionando suavemente el oviducto con las tijeras cerradas despojándose de la p.ej.gs. La transferencia de los huevos restantes con una pipeta Pasteur pre-aclaró con ASWH. Depositar los huevos de diferentes animales en diferentes pozos. Observe la calidad de los huevos bajo el microscopio de disección. NOTA: los huevos bien desarrollados son redondos y de color rosa con un color ligeramente amarillento. Están rodeados por una capa vitelina no celular, el corion que se forma un espacio perivitelino bien definido alrededor del huevo. El corion se asocia con células de prueba en sus células del folículo dentro y en forma de estrella en su exterior. Huevos de baja calidad a menudo carecen del espacio perivitelino o las células del folículo. Aparecen menos redonda, más granular o de diferente color. ovocitos inmaduros son más pequeños y tienen un color blanco plateado. Cortar el conducto de espermatozoides con las tijeras y recoger esperma concentrado en un tubo de 1,5 ml usando una pipeta Pasteur separada. En común el esperma de diferentes animales (al menos dos) en el mismo tubo. espermatozoides se almacenan a 4 ° C durante varios días. 3.Fertilización Recoger esperma y los huevos a 18 ° C como se describe en el paso 2. Activar el esperma. Preparar 1 ml ASWH en un tubo de 1,5 ml y se mezcla con 50 l de 1 M Tris pH 9,5. A continuación, añadir 20 l de esperma concentrado y mezclar suavemente invirtiendo el tubo. Verificar la activación de espermatozoides en una gota de esperma se coloca sobre una cubierta de una pequeña placa de Petri o un portaobjetos de vidrio y observar bajo el microscopio de disección. Los espermatozoides deben nadar frenéticamente. Añadir 100 a 200 l de la solución de esperma activado a cada pocillo de huevos (que contienen entre 100 y 1.000 huevos), se mezclan bien pipeteando arriba y abajo, por lo que los huevos están flotando en el medio. Esperar durante 10 minutos sin mover los embriones. 4. dechorionation de huevos y embriones Diluir una alícuota de 500 l de solución de dechorionation 20x a 10 ml en ASWH. Activar la solución dechorionation mediante la adición gota a gota 200 l de 2.M NaOH 5 a la solución dechorionation 10 ml 1x. se forma un precipitado lechoso. mezclar suavemente invirtiendo el tubo. Recoger los huevos o zigotos (después de la 10 min esperar en el paso 3.3) en tubos de vidrio usando una pipeta Pasteur. Agrupar los huevos de 2 a 3 animales en un tubo (alrededor de 1.000-5.000 huevos / tubo). Los sedimentos con una centrífuga mano haciendo girar a alta velocidad (1.200 xg) durante aproximadamente 20 segundos para formar un pellet de embriones en la parte inferior del tubo. suspenderlo en forma gradual la centrífuga y retire la ASWH con una pipeta Pasteur. Añadir 4 ml de solución dechorionation activado para los huevos / cigotos sedimentadas en cada tubo. Suspender los huevos / cigotos pipeteando suavemente arriba y abajo con una pipeta Pasteur del grifo tratada con agua rematado con una pequeña pera de goma. La solución debe girar amarillento después de 1-3 min. Siga el dechorionation mediante la eliminación de una pequeña alícuota de la suspensión de huevos dechorionating / cigoto con la pipeta Pasteur. Depositar una gota en un portaobjetos y observar bajo la s diseccióncapa pluvial. Mantenga el pipeteado de huevos / cigotos arriba y abajo y comprobar cada 20-30 segundos. NOTA: Las primeras células del folículo se desprenden, a continuación, el corion se vuelve amarillo y opaco, y, finalmente, que se separe de los zigotos. Pink dechorionated huevos / cigotos se hundirán hasta el fondo del tubo de vidrio. El dechorionation no debería tomar más de máx. 5 minutos. Llenar el tubo con ASWH vez el 50% de los huevos / cigotos se dechorionated. NOTA: Muy suavemente centrífuga (8 x g) durante aproximadamente 10-15 segundos correspondiente a una velocidad muy baja lo suficiente para sedimentar los huevos / embriones dechorionated. detener lentamente la centrífuga como para no perturbar el pelet de huevos / cigotos en la parte inferior del tubo. Retirar casi todo el líquido desde el tubo de vidrio que incluye el material flotante con huevos / cigotos incompletamente dechorionated y reemplazar con ASWH. Lentamente pipetear arriba y abajo para lavar y centrifugar suavemente de nuevo como en el paso 4.2. Como alternativa, espere cigotos que se establecen por la gravedad. Lavar una vez más hasta que no haya residuos corion es lEFT. Huevos / cigotos de transferencia a placas de cultivo utilizando una pipeta Pasteur recién enjuagarse. Mantenga los cigotos (no huevos) a baja densidad (alrededor de 200 embriones por placa de 10 cm) para evitar que se peguen entre sí. La cultura de los embriones a la etapa deseada a temperaturas entre 13 y 20 ° C. Alternativamente, electroporate los cigotos (paso 5) o inyectar los huevos no fecundados (Paso 6). 5. La electroporación Fertilizar los huevos y dechorionate los cigotos a 18 ° C como en las secciones 3 y 4. Proporcionan entre 50 y 400 huevos por muestra electroporación. Preparar 50 l de ADN plásmido en un tubo de 1,5 ml (máx. 100 g de ADN plásmido en 50 l de ddH2O) y añadir 200 l 0,95 M manitol. Mezclar bien con un vórtex. Despacho y la gravedad sedimentan los cigotos dechorionated en siliconados tubos de 1,5 ml. Retire el ASWH hasta la marca de 100 l en el tubo. Procederá, de forma consecutiva, para cada tubo cigoto de la siguiente manera: añadirsolución de ADN / manitol usando una pipeta Pasteur. Mezclar suavemente con los cigotos y de inmediato tomar el manitol suspensión cigoto ADN / / y la transferencia a una cubeta de electroporación de 4 mm. Colocar la cubeta inmediatamente en el soporte de la electroporación y dar un único pulso de 16 ms a 50 V. Retire los cigotos de la cubeta utilizando la misma pipeta Pasteur y los extendió sobre una placa de cultivo que contiene ASWH fresca y filtrada. Pipetear los cigotos antes de empezar a escindir alrededor de 1 hora después de la fecundación (HPF) a 18 ° C. Enjuague la pipeta entre las muestras en un vaso de precipitados de ASWH. Cultura los cigotos a 15-20 ° C a baja densidad suficiente de alrededor de 200 embriones por placa de 10 cm para evitar que se peguen entre sí. 6. La microinyección Preparar dechorionated huevos para la inyección. Dechorionate los huevos por separado, a partir de 2-4 animales, tal como se describe en la sección 4. Mantener el no fertilizado y dechorionated correoGGS en placas de cultivo recubiertas de agarosa pequeña separados. Lavar los huevos varias veces en los platos para remover los escombros. Prueba de fertilizar pequeños lotes de los huevos dechorionated (alrededor de 50) de cada individuo. Use un plato separado 5 cm para cada lote y aplicar 2 l de esperma activado (paso 3.2). Mezclar bien por agitación los platos y hacia fuera los huevos en el plato moviendo los platos de lado. Mantener el esperma y los huevos juntos durante unos 10 minutos sin moverse. Eliminar a un máximo de esperma de la siguiente manera: transferir los huevos fertilizados de una placa de cultivo fresco o enjuagar dos veces con ASWH fresco. Deje los embriones de escisión no perturbadas hasta la fase de 32 células (a 18 ° C durante aproximadamente 3 horas después de la fecundación). Elija los huevos de la mejor desarrollo de lotes (mejor porcentaje de la fecundación y la mayor división patrón regular) para la microinyección. Configurar las agujas de inyección. Rellene 4 agujas de inyección en una posición vertical para permitir la gravedad flow a lo largo del filamento. Depósito de 0,5 l solución inyectable (paso 1.8) que contiene colorante vital verde en la parte de atrás de las agujas que se colocan punta abajo aguja. Esperar a que el líquido para llenar la punta de la aguja en la parte inferior. Volver a colocar las agujas en horizontal y rellenar con aceite mineral utilizando un metal fino y largo o puntas de pipeta de plástico. superponer lentamente la solución de inyección con aceite mineral expulsando todas las burbujas de aire mientras se llena la aguja. Configuración del Micromanipulador en un 18 ° C refrigerado por habitación. Conectar el tubo de plástico del soporte de la aguja a una jeringa de vidrio de 10 ml lleno de aceite mineral. Rellene el tubo y el soporte de la aguja con aceite y expulsar cualquier burbuja de aire. Insertar la aguja en el soporte de la aguja y la posición del soporte en el micromanipulador. Ajustar el movimiento de soporte de la aguja a lo largo de una línea recta en un ángulo de 45 ° respecto a la superficie. Orientar la dechorionahuevos TED a lo largo de la muesca de agarosa del plato de inyección de modo que los huevos se pueden inyectar uno a uno bajo el microscopio de disección. Romper la punta de la aguja, si es necesario, empujando suavemente la aguja contra la agarosa o en contra de un pedazo de hoja de la cubierta de vidrio colocado en la agarosa. presionar ligeramente el mando de la jeringa para comprobar que la punta de la aguja está abierta (contenidos de agujas verdes expulsarán). Inyectar el huevos no fecundados de uno en uno mediante la introducción primero la aguja en el huevo y ligeramente aspiración para romper la membrana del huevo seguido de la inyección. Inyectar solución de inyección verde en medio del huevo a un máximo de 1/3 del diámetro de la célula. (Esto corresponde a aproximadamente 30 pl para un diámetro de los huevos de 140 micras). La transferencia de los huevos no fertilizados inyectados a una placa de cultivo fresco y incubarlos a 15-18 ° C hasta el momento de la fecundación. Fertilizar los óvulos inyectados con espermatozoides recién activado como en las fertilizaciones de prueba (paso 6.1.2). Eliminatea máximo de los espermatozoides mediante la transferencia de los cigotos a una placa de cultivo fresco. Extender los embriones y no perturbar ellos durante las etapas de escisión (hasta la fase de 32 células). Cultura los embriones a la etapa deseada a una temperatura comprendida entre 13 y 20 ° C. Recoger los embriones de remolinos de ellos en el centro de la placa y transferir los mismos en siliconados tubos de 1,5 ml. Corregir o mancha, o monte (Pasos 7 y 8). Comparar los fenotipos obtenidos para los embriones de control inyectado. NOTA: Se inyecta un segundo que no se solapan MO, que se dirige a la misma transcripción para obtener fenotipos idénticos. Rescatar el fenotipo MO específica (s) con un ARNm modificado que codifica su proteína de interés, pero que no es reconocido por el OM. MO inyectar un control que no da ningún fenotipo. 7. LacZ tinción Recoger los embriones en una etapa deseada en siliconados tubos de 1,5 ml y fijarlos en glutaraldehído al 0,2% en 1 ml de 15 ASWHa 30 min como máximo. Lavar 2x 10 min con 1 ml de 1x PBT. Enjuagar una vez en 500 l de tampón de tinción de LacZ. Reemplazar con sustrato X-Gal complementado tampón de tinción 1 ml (utilizar 10 l / ml de 40 mg / ml de solución madre de X-Gal). La transferencia de los embriones en una placa de 12 pocillos para una mejor observación de la tinción. Incubar en la oscuridad. Variar la incubación de 0,5 hr a durante la noche a 4 ° C, a temperatura ambiente o a 37 ° C dependiendo de la fuerza del conductor que expresa LacZ. Lavar los embriones hasta 4 veces en 1 ml de 1X PBT para eliminar tampón de tinción. Después de la corrección durante 10 minutos a temperatura ambiente con 2% de paraformaldehído (PFA) en 1 ml de 1x PBT o glutaraldehído al 0,2% en 1 ml 1x PBT para la interpretación y visualización de los embriones teñidos. 8. Montaje de manera fluorescente etiquetadas Wmbryos Fijar los embriones de una etapa de desarrollo deseada durante 20 min en un 2% PFA en 1 ml ASWH. Lavar los embriones 2x en 1 ml 1x PBT. Evitar cualquier exposiciones de luzUre al mantener los embriones en condiciones de oscuridad. Transferir hasta 50 embriones a una diapositiva. Retirar un máximo de PBT en primer lugar con una pipeta y cuidadosamente con una toalla de papel. Añadir 20-25 l de medio de montaje. Añadir un cubreobjetos posicionándolo en un ángulo (de un lado primero) y baje lentamente con un objeto punzante (agujas, pinzas, puntas de pipeta) evitando las burbujas hasta que la muestra se cubre. Fijar el portaobjetos en sus bordes utilizando puntos de un esmalte de uñas transparente. Sellar todo el cubreobjetos con un esmalte de uñas después del secado. Almacenar en la oscuridad a -20 ° C.

Representative Results

La microinyección de estudios de redes de regulación de genes Los embriones de la ascidia Ciona intestinalis son muy adecuados para los estudios de genes reguladores funcionales o genes a nivel linaje celular y con la resolución celular. ARNm, OM o etiquetas pueden ser insertados por microinyección en el óvulo no fertilizado o en blastómeros individuales después de la fertilización. MO génica mediada desmontables mediante la técnica de microinyección se describe en el paso 6. OM se dirigen específicamente el ARNm de los genes seleccionados y prevenir su traducción en proteínas. MO la pérdida de función (LOF) de los genes de desarrollo cambia la expresión de una amplia variedad de genes abajo mediada, en general revelando una ojeada en el embrionaria GRN 10. Tales análisis en Ciona presentó el primer modelo regulatorio toda embrión en un 11 metazoos. La figura 1 muestra un ejemplo de cómo microinjectien se utilizó para estudiar la regulación aguas arriba de la expresión del conservada Ci -Myelin factor de transcripción (Ci -MYT) en la etapa de gástrula embriones de Ciona. Supervisado por hibridación in situ (ISH), la expresión endógena (Figura 1a, se esquematiza en la Figura 1a ') se observa en los 6 fila de precursores de placa neural, en especial, del cerebro (filas III / IV, en rojo) y la médula espinal ( fila I, en verde). Además, Ci -MYT regulación aguas arriba se analizó mediante inyección MO focalización varios factores que se expresan en o adyacentes a los precursores neurales antes de la aparición Ci expresión -MYT (Figura 1b-g). MO desmontables de factores embrionarias tempranas, tales como el cuadro de Aa Forkhead (Foxa-a) factor de transcripción y el factor de crecimiento de fibroblastos 09/16/20 (FGF9 / 16/20) (Figura 1b o 1c, respectivamente) elimina general Ci -MYT expresión. Otros factores de transcripciónsólo afectan parcialmente expresión -MYT Ci resultando en la regulación negativa mediada por MO en un subconjunto de los precursores del cerebro (cabezas de flecha azul en la Figura 1d, f y g). Por el contrario, la expresión -MYT Ci se activa ectópica a regulación a la baja de Nodal (Figura 1e, puntas de flecha de color rojo), lo que sugiere que Nodal normalmente reprime la expresión -MYT Ci en estos precursores cordón nervioso laterales. La electroporación para los estudios funcionales y potenciadoras de genes eficiente La electroporación de ADN de plásmido en cigotos Ciona es un método eficiente para la transgénesis transitoria y posterior observación de los cambios fenotípicos en vivo. A diferencia de la microinyección de mRNA, electroporación permite la sobreexpresión específica de tejido, en el que las regiones de codificación de genes (ORFs, marcos de lectura abiertos) se expresan bajo el controlde controladores específicos de tejido. Estos normalmente constituyen regiones cis-regulador de genes conocidos (tales como el potenciador de brachyury para la expresión de precursores notocorda 8). Por el contrario, la electroporación es instrumental para el análisis eficiente de regiones reguladoras novedosos donde genes informadores (lacZ o proteína fluorescente verde, GFP) revelan su actividad in vivo. El flujo de trabajo para la identificación y posterior análisis mediada por electroporación de una región reguladora de tales novela (por Ci -MYT) se muestra en la Figura 2. Un vasto repertorio de datos de la comunidad Ciona, de fácil acceso en la ascidia genoma navegadores específicos 12,13, como la Red de ascidia para la expresión in situ y embriológico de datos (ANIS) 23, se inspecciona para la identificación in silico de las regiones reguladoras (Figura 2A). reacción en cadena de la polimerasa posterior (PCR) basado en la clonación de estas regiones en vectores de expresión permite el ensayo electroporación mediada in vivo. (Figura 2B). El genoma navegador captura de pantalla en la figura 2A muestra la región aguas arriba de la transcripción modelo KH para Ci -MYT (primeros tres exones, de color naranja, y dos intrones son visibles). Diferentes pistas navegador genoma anotaciones funcionales del genoma de datos pronosticados para esta región, como por ejemplo la inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) de datos 14 (aquí se muestran para ZicL, Ci de cinc dedo del cerebelo L), conservación de secuencia entre dos especies Ciona relacionados 15,24 o nucleosoma 16,17 ocupación (de arriba a abajo en la figura 2A). En general, las regiones codificantes de proteínas exonic están muy conservadas (pista de alineación en la Figura 2A). picos adicionales alta conservación aparecen en las regiones no codificantes corriente arriba y en el primer intrón. Dos de ellos se prevé que ser un nucleosoma libree acuerdo con un algoritmo basado en la secuencia de 16,17 (marcos rojos en la Figura 2A), sugiriendo la accesibilidad a los factores de transcripción. De hecho, las señales de Chip-on-chip 14 de factor de transcripción Ci -ZicL unión (barras verdes en la Figura 2A) se enriquecen en estas dos regiones conservadas. Además, utilizando una interfaz 25 que busca los posibles sitios de unión de factor de transcripción, se identificaron sitios ZIC situadas dentro de las secuencias del genoma marcados por grupos Ci -ZicL chip (flechas de color naranja y secuencias con subrayado ZIC-núcleo, la Figura 2A). La unión del factor de transcripción Ci -ZicL en conserva y predecible nucleosoma regiones reguladoras libres de Ci -MYT es consistente con la regulación a la baja de la expresión Ci -MYT observado en experimentos de inyección de MO-mediada desmontables de orientación ZicL (Figura 1d). después de disuadirminería potenciales regiones cis-regulador in silico para la expresión Ci -MYT, éstos se amplificaron por PCR a partir de ADN genómico Ciona y se insertan mediante recombinación clonación en plásmidos reportero LacZ 19. Las construcciones son luego a electroporación en huevos fertilizados Ciona (Figura 2B) y se analizaron para su actividad por la tinción de LacZ (Figura 3). Figura 3 muestra que por tal un enfoque in silico que era posible identificar dos secuencias cis-regulador separadas que recapitular Ci -MYT de ARNm de los dominios de expresión (comparar Figura 1a). En general, los embriones transgénicos transitoriamente a electroporación con el plásmido de ADN muestran expresión mosaico en sólo aquellas células que han incorporado el ADN. Expresión mosaico LacZ es así impulsado por pmyt-R3 y se puede encontrar en todos los precursores que también expresan Ci </em> -MYT ARNm es decir, precursores de placa neural de la línea posterior I y de las filas anteriores III / IV en gástrula etapas y Néurula tempranas (Figura 3a, b, puntas de flecha de color púrpura y rojo, respectivamente). Por el contrario, pmyt-R5 está activo sólo en posterior (fila i) precursores de placa neural y comenzando en la etapa posterior Néurula (Figura 3c, puntas de flechas rojas). Así, las dos regiones que codifican dos aspectos espaciales y temporales separadas de la regulación de genes Ci-myt. Curiosamente, ambas regiones reguladoras también se tiñen de precursores adicionales que no se ve en el ISH, sobre todo en la parte anterior y lateral y placa neural en el músculo (Figura 3a, b, rosa, blanco, amarillo y puntas de flechas, respectivamente). Tal expresión más amplia puede apuntar a elementos represivos que no están contenidos en los fragmentos aislados de regulación (como por nodal que reprime el destino de los nervios laterales, véase la figura 1e) o bajos niveles de expresión detectados con la acumulaciónseñal enzimática LacZ. Además de los estudios potenciador, la electroporación in Ciona también facilita los análisis funcionales de Ciona codificación de los genes por su sobreexpresión. Una gran colección de Ciona ORF de longitud completa está disponible para la comunidad, y fue anotado además de ortólogos humanos, incluidos los genes asociados a la enfermedad 18. Genes o grupos de genes de esta biblioteca completa ORF cDNA compatible recombinación de clonación (Figura 2B) individuales se transfieren fácilmente en vectores de destino que contienen controladores apropiados para ser expresados en los embriones. Resultantes clones de expresión pueden además ser co-electroporación con el reportero de cis-regulador construye para probar su supuesto papel en la activación de potenciador. La Figura 2B ilustra el aislamiento de clones completos de ORF para los factores de transcripción Ci -ZicL y Ci- Gataa y su recombination en vectores de destino adaptados que pueden contener etiquetas de traslación 19 (por ejemplo, verde fluorescente o Venus- hemaglutinina viral (HA) -tag) y un controlador específico de tejido, como el amigo de Gata región reguladora (controlador pfog) para la expresión temprana pan-ectodérmica 15 utilizado en el presente estudio. El efecto de Ci -ZicL sobreexpresión en tejidos ectodérmicas y neuroectodérmicos se analizó por co-electroporación de pmyt-R3> LacZ y pmyt-R5> reporteros LacZ (Figura 3B ', b' 'y c', c '', respectivamente). Nuestros análisis sugieren que la electroporación Ci -ZicL puede activar la expresión Ci -MYT través pmyt-R3 y regiones potenciadoras pmyt-R5 como ambas construcciones reportero LacZ mostraron expresión ectópica en las regiones del ectodermo (puntas de flecha verde en la Figura 3b ', b' 'y C &# 39;, c '',). Como se muestra en la figura 3d, la electroporación de ADN de plásmido en cientos de huevos Ciona permite la cuantificación estadísticamente relevante de los cambios de expresión, ilustrados por> expresión ectópica R3 pmyt-LacZ a, la expresión dependiente de la concentración pan-ectodérmica Ci -ZicL. La electroporación in vivo para la localización subcelular La Figura 4 representa la localización subcelular de factores de transcripción cuando se expresa en la categoría a la electroporación en blastómeros ectodérmicas usando construcciones de expresión adaptadas (esquematizados en la Figura 2B). Por factores de C-terminal de marcado de transcripción (tales como Ci -GATAa) con una etiqueta de Venus (Figura 4b) o una HA-tag (Figura 4c) y la sobreexpresión de ellos en los tejidos del ectodermo (pfog) Pudimos observar que, in vivo, 'Ci -GATAa se localiza sobre todo a los núcleos, como se esperaba para un factor de transcripción, mientras que la expresión de Venus está en todas partes, incluyendo el citoplasma. Experimentos similares se pueden realizar para estudiar la dinámica de la localización subcelular en el tiempo, de la persona o combinaciones de factores de transcripción, posiblemente revelar su co-localización con diferentes etiquetas. Figura 1:. La evaluación de la regulación -MYT Ci por microinyección en huevos Ciona expresión Ci -MYT mRNA en WT y morfolino (MO) inyectaron embriones. (A) patrón de expresión de WT Ci -MYT en la placa neural. (A ') Representación esquemática de los precursores manchadas en la placa neural (NP). Fila I / II: el destino neuronal posterior; fila III / IV: el destino neural anterior; fila V / VI: palpo destino. ( <stron.. g> b – g) la expresión Ci -MYT tras la microinyección de diversos MOS para derribar genes indicados que participan en la temprana Ciona GRN (adaptado de imágenes Imai et al, 2006) 11 Ci -MYT, Ci -myelin factor de transcripción; WT, de tipo salvaje; puntas de flecha azul: pérdida de señal -MYT Ci; puntas de flechas rojas: ectópico señal Ci -MYT. Barra de escala = 100 micras se refiere a todas las imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Flujo de trabajo para la búsqueda in silico de las regiones potenciadoras y recombinación de clonación para la transgénesis transitoria mediante electroporación en embriones de Ciona (A) Una instantánea de los ascos ANIS 23.dian genoma navegador identifica secuencias de regulación aguas arriba de Ci – myt. Marcos rojos marcan dos posibles regiones cis-regulador, pmyt-R3 (scaffold_196: 76883..77079) y pmyt-R5 (scaffold_196: 75856..76041) que fueron seleccionados para el análisis mediante electroporación. Los nombres de las pistas: sondas ZicL: Chip-a-chip de datos 14; Las transcripciones KH2012: Ciona intestinalis modelos de transcripción; Puntuación de alineación Cs / Ci LastZ: conservación de la secuencia entre Ciona savignyi (Cs) / Ciona intestinalis (Ci) 15,24; . Segal 2006 predijo nucleosoma ocupación versión 1: polluelo entrenado algoritmo computacional por Segal et al, 2006 16 aplicado a Ci como en Khoueiry et al, 2010 17: Las barras verdes. Ci. -ZicL Chip Picos de 14; flechas de color naranja: predijeron sitios ZIC; GCTG: sitio de unión del núcleo ZIC. (B) Esquema para la generación de constructos de sobreexpresión de una Ciónuna biblioteca ORF cDNA de longitud completa, recombinado en destino vectores que contienen los conductores de tejidos específicos (pfog) y etiquetas de proteínas posteriormente co-electroporación con construcciones de reportero (como pmyt-R3> LacZ o pmyt-R5> lacZ) para in vivo lectura Ci. – MYT, Ci factor de transcripción -myelin; Ci -ZicL, dedo Ci -Zinc del cerebelo factor de transcripción L;. pfog, región reguladora de Ci -Amigo de GATA Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: embriones a electroporación Ciona que muestran Ci -ZicL inducible -Reglamento cis espacio-temporal de embriones teñidos Ci -MYT LacZ a media gastrul.un (mg) / tardío-gástrula (LG) o Néurula temprana etapa (ES) se muestra que fueron co-electroporación, ya sea con pmyt-R3> LacZ o pmyt-R5> lacZ y una construcción de control (pfog> mCherry) o pfog> ZicL. El conductor pfog 19 media ectópico (pan-animal) ZicL expresión en el ectodermo y neuroectodermo y causa la mancha LacZ ectópico en estas células. (A) La actividad pmyt R3-lacZ en embriones en etapa mg / lg (pequeñas puntas de flecha, panel izquierdo) o en los territorios esquemáticas correspondientemente coloreados (círculos azules, panel derecho); Ver vegetal (VG). Fila I / II: el destino neuronal posterior; Fila III / IV: el destino neural anterior; Fila V / VI: palpo destino. (B) la actividad pmyt-R3 en las etapas NE en tejidos como en una. (B ') ectópico actividad pmyt-R3 en Ci -ZicL co-electroporación se indica por puntas de flecha verde. (B '') Los mismos embriones como en b ', polo animal orientado hacia arriba (a). ( <strong> c) la actividad pmyt-R5 LacZ en las etapas (c ') la actividad ectópica pmyt-R5 en Ci -ZicL co-electroporación se indica por puntas de flecha verde. (C '') Los mismos embriones como en C ', pero orientado hacia arriba polo animal (a). (D) Cuantificación de experimentos representativos para Ci -ZicL sobre-activación de pmyt-R3 a bajas concentraciones. Una repetición biológica está representado Ci -MYT, Ci factor de transcripción -myelin;. -ZicL Ci, Ci dedo -Zinc del factor de transcripción L cerebelo; Ci -FOG, Ci -Amigo de GATA; WT, de tipo salvaje; MG, a mediados de gástrula; lg, tarde en la gástrula; EN, Néurula temprana; una vista de los animales; vg, vista vegetal; nls LacZ, señal de localización nuclear para LacZ. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4:. Localización subcelular diferencial de proteínas a la electroporación de localización de Venus con etiquetas o Hemagglutinin- (HA)-etiquetados proteínas sobreexpresados en las células ectodérmicas utilizando el controlador pfog 19. (A – c) imágenes DIC. (A ', b') correspondientes imágenes de fluorescencia. (C ') Imagen de fluorescencia correspondiente al etiquetado histológico inmune con TRITC. Barra de escala = 100 micras se refiere a todas las imágenes. DIC, contraste de interferencia diferencial. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Hay dos técnicas principales para generar embriones transgénicos Ciona: microinyección de ARN o ADN y la electroporación de ADN. Estas técnicas para la perturbación de genes en embriones Ciona se utilizaron por primera vez en la década de 1990 y 7,8 a partir de entonces mejoraron sucesivamente, y ahora utilizan en Ciona (y otros géneros ascidia) 20 en todo el mundo.

Los pasos críticos en el protocolo

Transgénesis éxito en gametos Ciona que se recogen fácilmente de animales adultos depende de una serie de factores críticos. La calidad de los gametos depende de la época de desove (en general, de mayo a diciembre en el Atlántico Norte, que cambia con la temperatura del agua y la oxigenación), sobre la calidad del agua de mar en los acuarios (en la salinidad correcta, adultos sanos durante 2-4 semanas) y, finalmente, en la correcta manipulación de los gametos sobre la extracción de los adultos, como se detalla a continuación para los diversos pasos en elprotocolo.

Durante las etapas de preparación, la incubación de pipetas Pasteur con agua del grifo evitará que los embriones se peguen y agua de mar pre-incubación de placas de Petri de agarosa recubiertas de eliminará sustancias tóxicas liberadas de la agarosa. En general, los platos se pueden preparar hasta 2 semanas antes de su uso, almacenados a 4 ° C para evitar el crecimiento bacteriano y se aclararon justo antes de su uso. Un día de edad, pequeños platos parece mejor para inyecciones.

La eficiencia y la longitud de dechorionation es un paso crucial en el protocolo como el tratamiento prolongado de huevos / embriones dañará el desarrollo. La preparación cuidadosa (sin agitación) y el almacenamiento correcto (a 4 ° C durante un máximo de una semana) preservan la calidad de la solución dechorionation. Proteasas en la solución pierden eficacia si, ya sea mezclado con demasiada violencia en la preparación o el paso del tiempo, sobre todo si se mantiene a temperatura ambiente durante largos horas / días. Hemos optimizado este paso crítico mediante el uso de una solución fresca convenientemente dechorionationpreparado a partir de alícuotas congeladas de 20x solución madre.

La correcta manipulación de los frágiles huevos / embriones dechorionated es esencial y cizallamiento o punzante de los embriones durante el pipeteado será perjudicial. Cuando pipeteado, los embriones se mantienen lo más posible en suspensión (por suavemente 'soplado' líquido a girar hacia arriba seguido de suave pero rápido de pipeteo), mientras sostiene la pipeta de vidrio en vertical en lugar de horizontal. Tal cuidado aplica a todos los pasos de pipeteado para el lavado, resuspensión y transferencia de huevos / embriones dentro y fuera de los tubos, cubetas o placas, antes y después de la fijación. Tras la fijación, cuidados especiales también se debe tomar para pipetas separadas para los embriones vivos versus sujetos para evitar la toxicidad de los restos de fijadores.

La microinyección es bastante complicado en Ciona huevos / embriones debido a su pequeño tamaño y la resistencia de la membrana vitelina y críticamente depende de un tamaño de la boquilla optimizada dela aguja de inyección, un ángulo perfecto de la inyección (movimiento de la aguja en una línea, a lo largo del radio de huevo) y un afinado, rotura manual de la membrana vitelina (por succión antes de la aspiración por inyección). Esta última sólo es posible si las burbujas de aire están completamente eliminados de la tubería de inyección que contiene aceite mineral para suavizar la presión de succión / inyección. Además, las piezas más pequeñas de polvo o restos de huevos va a obstruir la aguja, y son fácilmente evitado por las condiciones de trabajo limpio y pasos de lavado de los huevos antes de su transferencia en el plato de la inyección. después de la inyección, la transferencia de huevos en platos frescos evitará los efectos tóxicos de los embriones muertos no haber sobrevivido al procedimiento de inyección.

Solución de problemas

Los problemas potenciales en el procedimiento pueden ser abordadas por las siguientes soluciones. Las bajas tasas de fertilización pueden surgir de la activación de los espermatozoides insuficiente, baja la limpieza de huevo o de volúmenes grandes de fertilización. utilice freshly agruparon y menos diluyó esperma. Verificar el movimiento de los espermatozoides después de la activación. Lavar los huevos con ASWH antes de la fertilización como se describe en el paso 4.2. Reducir el volumen de agua y reducir la cantidad de huevos por plato fertilización / pocillo. La pérdida de embriones durante las etapas de preparación se pueden evitar mediante la adición de una gota de solución dechorionation para centrifugar de manera más eficiente hacia abajo los huevos / embriones undechorionated. Dechorionation tiempo debe ser optimizado como los huevos parcialmente dechorionated será no sedimentos y dechorionation prolongada es tóxico, causando los embriones para explotar.

desarrollo asincrónico puede surgir de esperma residual liberado durante la disección. Mantener los lotes de huevos separados de diferentes animales para evitar incontrolada fertilización cruzada. El desarrollo anormal puede tener varias causas. Al principio y al final de la temporada, después de mantener el embrión de diferentes individuos separados, se pueden seleccionar los mejores lotes. Debe evitar las interrupciones de los embriones para la10 minutos que siguen a la fertilización para evitar la interferencia con su segregación ooplasmic. Asegúrese de que los embriones no comenzaron dividiendo mientras se transfiere en forma de pipeteado separa los blastómeros hermanas y los resultados en embriones parciales. Use menos espermatozoides para los huevos para evitar dechorionated polyspermy. Utilice platos recién preparados de agarosa, pero se aclararon. Asegúrese de que el dispositivo de pipeta es libre de fijador. Mantener control de los embriones que no fueron dechorionated y no a electroporación para detectar por lo cual el desarrollo paso fue interrumpido. Complementar los embriones con antibióticos si se produce contaminación y descomposición.

Si el dispositivo de inyección ha 'tapado', la abertura de la aguja de inyección puede ser verificada mediante la expulsión de algunos de sus contenidos manchado. material de obstrucción puede ser borrado arrastrando con cuidado la punta de la aguja a través de la agarosa. Las burbujas de aire en el tubo de inyección y / o la aguja debe ser eliminado. Cambie la aguja para un mejor control del volumen de inyección como el neepunta dle puede romper o atascar a lo largo de la inyección. Lavar los huevos y colocarlos en una placa de inyección estéril si los desechos se han acumulado en el plato. Centrifugar la solución de inyección antes de llenar agujas frescas con el fin de sedimentar las partículas pequeñas o cristales. También es útil la inyección está practicando solamente con colorante vital. Verificar la técnica de inyección mediante la fertilización de los huevos inyectados y no inyectados. Por último, el consultar con un colega con experiencia puede ser útil para mejorar la técnica de inyección.

Para controlar los efectos fuera de la meta un segundo que no se solapan MO y rescate con un ARNm modificado que no es reconocido por los OM puede descartar fielmente efectos fenotípicos inespecíficos en Ciona.

Microinyección: significado y limitaciones

La microinyección en Ciona se utilizó para generar el primero modelo para una red de regulación de genes embrión conjunto (GRN) en un cordado 11. Sin embargo, a pesar de una rema taleslogro rkable, microinyección en embriones de Ciona tiene limitaciones, debido al tamaño relativamente pequeño (0,14 mm de diámetro) de los huevos de Ciona. En comparación con los de otras especies de cordados, donde ADN extraño / ARNm se introduce mediante microinyecciones, huevos Ciona son relativamente difíciles de manejar y la tasa de embriones Ciona inyectados por experimento sigue siendo baja (una media de 30 a 50 embriones por experimento), impidiendo análisis cuantitativos. Sin embargo, para factores maternos perturbadores en Ciona, la microinyección de las OM es el método de elección también para estudiar su implicación en la aparición cigóticos de desarrollo de la célula de 16 a 32 etapas 15. Además, es posible aunque mucho más difícil de microinyectar blastómeros individuales hasta la etapa de 16 a 32 células. Por último, la microinyección sigue siendo la técnica más eficiente para la producción de embriones transgénicos (por mRNA o la inyección de ADN) en especies distintas de ascidia Ciona, para lo cual totalmente optimino existen protocolos de electroporación Zed.

La electroporación: significado y limitaciones

Para superar los números bajos y otras condiciones de la microinyección, la mayor parte de la comunidad Ciona ha utilizado la electroporación de ADN plásmido desde que fue desarrollado y publicado como un protocolo optimizado y estandarizado por Zeller et al. En 2004 9. De hecho, miles de embriones Ciona transgénicos puede ser generada dentro de una hora con hasta 500 embriones electroporadas simultáneamente en una cubeta usando una sola 50 V de pulso de 16 mseg. El enfoque de generar un número masivo de embriones transgénicos sigue siendo único entre los organismos modelo cordados. Esto ha llevado a Ciona ser rápidamente reconocido como un poderoso sistema modelo para la realización de los análisis in vivo de potenciales regiones cis-regulador y localización celular / subcelular, como se ejemplifica aquí.

Aunque electroporatien cigotos en Ciona ha revolucionado el campo de investigación fundamentalmente cordado GRN, la técnica, sin embargo, se enfrenta a algunos límites. En primer lugar, los plásmidos se introducen de forma transitoria en embriones de Ciona y es más probable heredan como extracromosómicos arrays, por lo que la estabilidad del plásmido de ADN a electroporación especulativo. Por otra parte, es muy difícil, incluso imposible, controlar las copias de plásmidos electroporación que serán absorbidos por cigoto, lo que resulta en fluctuaciones fenotípicas. Un problema adicional que hace que sea difícil de interpretar los resultados de electroporación es un fenómeno que llamamos mosaicismo. ADN plásmido electroporación puede ser tomado en diferentes posiciones de la etapa de embrión de una célula; que determina cuáles y cuántos cuartos del cigoto recibirán plásmido para ser heredado por los descendientes blastómeras. Tales variaciones claramente hacen que la interpretación de los efectos cuantitativos más difícil. Sin embargo, la mayoría de los problemas que vienen con electroporavariabilidad ción son resueltos por una cantidad apropiada de muestras biológicas, con el conteo y estadísticas de LacZ (o GFP) células positivas, que es fácil de obtener en un solo lote.

La versatilidad y el potencial de electroporación para la ingeniería genética

Electroporación, finalmente, permite la detección de mitad de rendimiento de las posibles regiones cis-regulador y análisis cuantitativos de la función de genes clonados en vez de actas o de plásmidos de expresión. Debido al genoma Ciona compacto, la identificación y clonación de posibles regiones reguladoras es bastante sencillo 3. Una estrategia para el uso de la gran cantidad de datos de la comunidad se demuestra en la Figura 2A. La clonación de genes informadores y plásmidos que codifican se facilita aún más la generación de Ciona adaptado, Gateway Suites vector compatible 19 y una longitud total compatibles biblioteca ORF 18. Ambas herramientas están disponibles para la comunidad ypermitir la restricción de la recombinación eficiente, libre de enzimas de los conductores reguladoras y regiones de codificación, como se muestra en la Figura 2B.

En los últimos años, la electroporación fue adaptado con éxito para lograr la manipulación dirigida de genes de tejidos con plásmidos que expresan las herramientas de edición de genes como los componentes CRISPR / Cas9 bajo el control de controladores específicos de tejido 21,22. Tales enfoques avanzarán rápidamente nuestra comprensión de la dinámica de GRNs y los mecanismos de señalización potencialmente conservadas, incluyendo códigos de factor de transcripción implicados en la formación de tejidos y la salida escalonada de pluripotencia. Por otra parte, deficitaria de tejidos específicos o enfoques de ganancia de función (por CRISPR / Cas9 o por la sobreexpresión) mediante electroporación serán fundamentales para el estudio de los genes ortólogos Ciona asociadas a la enfermedad humana. De hecho, los catálogos de ortólogos de Ciona genes de enfermedades humanas y su longitud ORF clones de codificación son fácilmente disponLe para el análisis en Ciona 1 8. Debido a la amplia duplicaciones del genoma en los vertebrados, la mayoría de los genes humanos poseen parálogos funcionalmente redundantes que complican los análisis de la función del gen 1. Ciona ser un sistema más simple con la disposición típica tejido cordado en larvas debe descubrir papeles fundamentales de tales genes importantes, a menudo conservadas funcionalmente.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the University of Innsbruck, Austria, and the Austrian Academy of Sciences (ÖAW).

Materials

Lab with constant temp. (~ 18°C)  For embryo work
Ciona intestinalis adults UPMC – Station Biologique,
Roscoff, France		 For collecting gametes
NaCl Roth 3957.1 For ASWH
KCl Roth 6781.1 For ASWH
CaCl2x2H2O Roth A119.1 For ASWH
MgCl2x6H2O Roth 2189.1 For ASWH
MgS04x7H2O Roth P027.2 For ASWH
NaHCO3 Roth 6885.1 For ASWH
Hepes  Roth HN78.3 For ASWH
Sodium thioglycolate  Sigma MZ-6 For Dechorionation
Pronase  Sigma T0632-100G For Dechorionation
D-Mannitol  Sigma Aldrich M9546-250G For electroporation
Plasmid DNA (prep >1µg/µl) Macherey-Nagel 740410.100 For electroporation or microinjection
Agarose any supplier For coating embryo culture dishes
Plastic petri dishes VWR 612-2079 Coated with 1% Agarose in ASWH, covered with ASWH
Small scissors any supplier For dissecting gametes
NaOH  Roth 6771.1 For activating dechorionation solution
Tris  Roth 5429.3 1M pH9.5, for sperm activation
Pasteur pipettes  VWR 612-1701 Treated by immersion in tap water for at least 12h
Hand centrifuge Hettich Zentrifugen 1011 Use glass centrifuge tubes
1.5ml Eppendorf tubes Sigma T3406-250EA
2ml Eppendorf tubes Sigma T3531-200EA
Square electroporator Bio Rad Gene Pulser Xcell
Electroporation cuvettes 4 mm Eurogentec CE-0004-50
Coverslips Sto Premium PR248212600
Glass slides VWR ECN 613-1551
Glutaraldehyde Sigma G6257-10ML For fixation in LacZ staining
Paraformaldehyde Sigma  P6148-500G For fixation of fluorescent samples
Vectashield Vector H-1000 For mounting of fluorescent samples
X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-Galactopyranoside) Roth 2315.2 LacZ substrate; stock in 40mg/ml DMF (Dimethylformamide)
K5Fe(CN)6 Merck 4984 For LacZ staining buffer
K3Fe(CN)6 Merck 4973 For LacZ staining buffer
Na22HPO4 Roth 4984.2 For PBT
KH2PO4 Roth 3904.2 For PBT
Tween  Sigma SLBJ5103V For PBT
Mineral Oil Sigma M8410 Embryo culture tested
Green Vital Dye Fast Green Sigma  F7251 for microinjection; 10µg/µl
Micropipette Puller (Flaming/Brown) Sutter Instruments Model P-97 For pulling injection needles
Borosilicate glass capillaries GC100TF-10 Harvard Apparatus Ltd. UK 30-0038 1.0mm O.D. x0.78mm I.D., containing filament, for microinjection
Micromanipulator Narishige MWS-2 Three-axis Oil Hydraulic System; for 3D fine movement during injection
Injection holder Narishige 1M-H1 For holding injection needles, entire system filled with mineral oil
All Glass Syringe Walter Graf & Co GmbH & Co. KG  No. 95199.10427A4 10ml FortunaOptima; filled with mineral oil, for fine tuning of microinjection pressure 
Morpholinos  GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA Injection at 0.25-0.5mM
Capped mRNA Ambion mMessage mMashine kit Injection at 0.05-0.5µg/µl 
Plasmid DNA Injection at 20 ng/µl
Recombination cloning kit Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen 11789-013
Recombination cloning kit Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen 11791-019
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Referências

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Kari, W., Zeng, F., Zitzelsberger, L., Will, J., Rothbächer, U. Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis. J. Vis. Exp. (116), e54313, doi:10.3791/54313 (2016).
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