胚胎显微注射和电的脊索动物<em>玻璃海鞘</em
Summary
我们目前的转基因瞬时和基因敲除在玻璃海鞘 ，脊索动物姐妹群脊椎动物，利用显微注射和电技术。这种方法有利于在这个简单的无脊椎动物，具有脊椎动物中最起码的特征，包括脊索和头部感觉上皮细胞，与人类疾病相关的基因的同源基因的许多功能基因组学。
Abstract
Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.
Introduction
最近，基因组序列和转录基因库已经成为了许多模式生物的访问。确定基因功能链接，但是，这些连接如何在整个胚胎时空执行转录活性的DNA的硬连线，仍然是一个重大的挑战，特别是在脊椎动物。监管相互作用的复杂性和基因组1,2的复杂性，尤其是在脊椎动物中，放慢有效功能分析，特别是在体内 DNA水平。事实上，没有GRN目前从受精分析，发育中的生物体的最后，终末分化的状态。
该海鞘C.代表肠等在那里完成GRN分析是可能的模式生物。它具有不重复的基因组典型的少基因冗余脊椎动物。脊椎动物，在对比已经历了两轮的甲肝病毒基因组复制的Ë产生较大的基因家族和功能的多样化，也旁系间的冗余。 C的紧凑顺 -regulatory序列（GRNS的控制单元） 肠 ，和几个细胞的胚胎不变的血统都让人联想到的C.线虫 。此外，其独特的系统发育地位作为一个无脊椎动物姐妹群脊椎动物脊索动物内允许发展的观察，在细胞的分辨率，形成脊索动物体计划3-6。
确保功能基因组学的模式生物的未来成功的关键问题是大量的胚胎进行定量体内扰动的产生。在玻璃海鞘鸡蛋7的显微注射的技术，并迅速通过体内电穿孔在数百玻璃海鞘的获得许多瞬时转基因动物的可能性发展受精卵8,9-已突破<em>玻璃海鞘功能基因组学。在这里，我们首先提出了针对单个基因的比较费力显微注射技术剩下首选吗啉（MO）介导的基因敲除的方法，特别是产妇的成绩单。莫寡聚通常靶向起始子ATG或RNA的剪接位点，并与蛋白质的翻译干扰。然后，我们表明电穿孔在玻璃海鞘的受精卵如何允许对大量的胚胎以定量的方式将待分析，从而打开增强剂的有效分析的途径在体内和组织特异性GAIN-或损失的功能的方法，用可能性同时操作和分析。我们进一步证明玻璃海鞘社区工具如何在调节区和在表达载体中充分开放读框（ORF）的有效克隆的硅片预测用于。最后，我们表现出的不同亚细胞定位的荧光标记或者通过电穿孔后，标记的蛋白质过度表达。
Protocol
Representative Results
Discussion
有两种主要的技术来产生转基因玻璃海鞘胚胎：RNA或DNA和DNA的电穿孔的显微注射。这些技术在玻璃海鞘胚胎基因摄于90年代7,8首次使用，并从那时起陆续改善，现在在玻璃海鞘 （和其他海鞘属）20世界范围内使用。
在协议中的关键步骤
成功的转基因成玻璃海鞘配子，很容易从成年动物收集取决于许多的关键因素。配子的质量取决于产卵季节（一般在5〜12月在北大西洋，水温和充氧变化），在水族箱海水质量（在正确的盐度，成年人保持健康的2-4周） ，最后在正确处理来自成人经萃取配子，如下详述在各个步骤协议。
在准备步骤，用自来水孵化巴斯德吸液管将防止从坚持和琼脂糖涂层培养皿海水预孵化的胚胎将删除琼脂糖释放有毒物质。通常，餐具可制备最多使用前2周，保存在4℃，以避免细菌生长并在使用前新鲜漂洗。有一天老了，小菜似乎最适合注射。
dechorionation效率和长度在协议作为长期治疗的蛋/胚胎会损害发展的关键一步。精心的准备（无晃动），以及正确贮藏（4℃长达一周）保持dechorionation解决方案的质量。在溶液中的蛋白酶失去效率如果无论是在制备或随时间混合过于剧烈，特别是如果在室温下保持更长的小时/天。我们通过优化使用便利，新鲜dechorionation解决这个关键的一步从20倍原液冷冻等分准备。
而移液将不利于脆弱dechorionated蛋/胚胎的正确处理是必要的，剪切或胚胎捅死。当移液，将胚胎保持尽可能在悬浮液（轻轻'吹'液体漩涡它们随后光滑但快速移液），同时保持玻璃吸管在垂直而非水平位置。这样的关心内容适用于洗涤，再悬浮和输送蛋的所有移液步骤/胚胎进出管，试管或板，前，后固定。一旦固定，特别小心也应采取独立的移液设备的用于实时与固定的胚胎，以避免固定剂的遗体任何毒性。
显微注射是玻璃海鞘蛋/胚胎相当棘手，由于其体积小，卵黄膜的弹性和关键取决于优化针尖大小注射针，注射的一个完美的角度（在一行针运动，沿着蛋半径）和一个微调，手动卵黄膜的（抽吸之前通过抽吸注射）断裂。后者是唯一可能的，如果气泡完全从包含矿物油用于平滑吸入/注射压力注射管线消除。此外，灰尘或蛋碎片的最小件将堵塞针，并很容易被清洁的工作条件和用于向在注射培养皿转移之前鸡蛋漂洗步骤避免。注射后，蛋转移到新鲜的菜肴会避免死胚不具有存活的注射过程毒性作用。
故障排除
在程序中的潜在问题可通过以下解决方案来解决。低受精率可能与精子的活化不足，低蛋清洁或大体积施肥出现。使用freshlŸ汇集，少精子稀释。验证在活化的精子的运动。如步骤4.2中所述洗净与ASWH卵受精之前。减少水量和降低每受精菜蛋量/孔。在准备步骤失去胚胎可以通过添加的dechorionation溶液滴下来的undechorionated卵/胚胎更有效地离心来避免。 Dechorionation时间应优化为部分dechorionated鸡蛋不会沉积，延长dechorionation是有毒的，导致胚胎爆炸。
异步的发展可以从解剖过程中释放残留的精子产生。远离不同动物中分离鸡蛋批，以避免不受控制的相互交流。发育异常可能有多种原因。在开始和在赛季结束，保持分开不同个体的胚胎后，最好的批次可能被选中。避免扰动的胚胎下面受精10分钟，以避免与它们的卵胞质偏析干扰。确保在被转让的移液中分离胚胎部分的姐妹卵裂球和结果的胚胎没有开始分裂。使用较少的精子卵子dechorionated避免多精入卵。使用新鲜配制，但冲洗琼脂糖菜肴。确保移液设备固定液免费。记住，没有dechorionated，而不是在电哪一步发展被打乱检测控制胚胎。用抗生素补充的胚胎，如果污染和发生分解。
如果该注射装置已经'堵塞“的注射针开口可以通过驱逐一些其染色内容的验证。堵塞材料可以通过琼脂糖小心拖动针尖被擦去。气泡在注入管道和/或针应该被删除。换针更好地控制注射量为东东DLE提示可能会破坏或沿注射堵塞。冲洗蛋并将其放置在干净的菜注如果碎片在盘中已积累。离心之前，以沉淀任何小颗粒或晶体填充新鲜针注射溶液。也有利于在练习注射只活体染料。通过注射施肥和非注射的卵验证注射技术。最后，拥有一支经验丰富的同事咨询可以帮助改善注射技术。
为了控制脱靶效应的第二非重叠MO和救援与没有由该MOS识别能够忠实排除在玻璃海鞘的非特异性的表型的影响的改性的mRNA。
显微注射：意义和局限
在玻璃海鞘显微注射被利用在一个脊索动物11产生用于全胚胎基因调控网络（GRN）第一蓝图。然而，尽管这样的REMArkable成就，显微注射在玻璃海鞘的胚胎具有局限性，由于玻璃海鞘卵的相对小的尺寸（0.14毫米直径）。相比那些外源DNA / mRNA通过显微注射引入其他脊索动物物种的， 玻璃海鞘卵是比较难以处理和每个实验注入玻璃海鞘胚胎率仍然很低（每个实验平均30至50的胚胎），阻碍定量分析。然而，在玻璃海鞘扰动母体因素，MOS管显微注射是首选的也是研究从16到32个细胞及其在发展合子发病参与15级的方法。此外，有可能虽然更加难以microinject个体的卵裂球到16-32细胞阶段。最后，显微注射仍然是最有效的技术，在比玻璃海鞘其它海鞘物种产生转基因胚胎（通过mRNA或DNA注射），其充分优化解不存在ZED电协议。
电：意义和局限
为了克服低的数字和显微注射的其他方面的限制，大部分的玻璃海鞘社区已经用质粒DNA的电，因为它是开发和泽勒等人发表的优化和标准化的协议，于2004年9。事实上，成千上万的转基因玻璃海鞘胚胎可以在一小时内多达500胚在一个实验皿同时电穿孔用的16毫秒的单个50 V脉冲而产生。产生转基因胚胎的庞大的数字的方法仍然是脊索动物之间的模式生物是独一无二的。这已经导致玻璃海鞘被迅速确认为进行体内强大的模型系统中潜在的顺 -regulatory地区和蜂窝/亚细胞定位的分析，如下例证。
虽然electroporati在玻璃海鞘受精卵从根本上彻底改变了脊索动物GRN研究领域，该技术仍然面临一些限制。首先，质粒瞬时引入到玻璃海鞘胚胎和最有可能继承作为染色体外的阵列，使得电穿孔质粒DNA投机的稳定性。此外，它是非常困难的，甚至是不可能的，以控制将要占用每合子电穿孔质粒的拷贝，从而导致表型的波动。进一步的问题，使得它难以解释电穿孔的结果是，我们称之为嵌合的现象。电穿孔质粒DNA可以被吸收在单细胞阶段的胚胎的不同位置;这决定了如何受精卵的许多方面将获得质粒由卵裂球后代继承。这种变化显然使定量效应的解释更加困难。然而，大多数的问题随之而来electropora灰变性是由生物样品适量解决则计数和LacZ基因（或GFP）阳性细胞，这是在一个单一的批次容易获得的统计信息。
多功能性和电基因工程的潜力
最终电穿孔允许一次克隆到记者还是表达质粒潜在顺 -regulatory区和基因功能的定量分析的中期通量筛选。由于紧凑的玻璃海鞘的基因组，识别和潜在的监管区的克隆是相当简单的3。一种使用社区的大量数据的策略是表现在图2A。记者基因编码质粒的克隆是由玻璃海鞘的产生进一步促进适应，GATEWAY相容载体套房19和兼容全长ORF库18。这两个工具都提供给社会和允许调整驱动器和编码区的高效率，限制无酶的重组，如在图2B中描绘。
近年来，电穿孔被成功适于实现用表达基因编辑工具，例如组织特异性的驱动程序21,22的控制下CRISPR / Cas9部件质粒组织靶向基因操作。这些方法将迅速推进我们GRNS的动态和潜在保守的信号机制，包括参与组织形成转录因子代码和多能性的逐步退出的理解。此外，使用电穿孔的组织特异性损失-或获得性功能的方法（由CRISPR / Cas9或过度表达）将工具来研究人类疾病相关的基因的玻璃海鞘直向同源物。事实上，人类疾病基因的同源玻璃海鞘和他们的全长ORF编码克隆目录很容易availab乐在玻璃海鞘1 8分析。由于脊椎动物的全基因组重复，大多数人类基因拥有该基因的功能1的分析复杂功能冗余的旁系。 玻璃海鞘是在幼虫典型的脊索动物组织安排应揭露这种重要的是，往往在功能上保守的基因的基本角色，一个简单的系统。
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the University of Innsbruck, Austria, and the Austrian Academy of Sciences (ÖAW).
Materials
| Lab with constant temp. (~ 18°C) | For embryo work | ||
| Ciona intestinalis adults | UPMC – Station Biologique, Roscoff, France |
For collecting gametes | |
| NaCl | Roth | 3957.1 | For ASWH |
| KCl | Roth | 6781.1 | For ASWH |
| CaCl2x2H2O | Roth | A119.1 | For ASWH |
| MgCl2x6H2O | Roth | 2189.1 | For ASWH |
| MgS04x7H2O | Roth | P027.2 | For ASWH |
| NaHCO3 | Roth | 6885.1 | For ASWH |
| Hepes | Roth | HN78.3 | For ASWH |
| Sodium thioglycolate | Sigma | MZ-6 | For Dechorionation |
| Pronase | Sigma | T0632-100G | For Dechorionation |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | M9546-250G | For electroporation |
| Plasmid DNA (prep >1µg/µl) | Macherey-Nagel | 740410.100 | For electroporation or microinjection |
| Agarose | any supplier | For coating embryo culture dishes | |
| Plastic petri dishes | VWR | 612-2079 | Coated with 1% Agarose in ASWH, covered with ASWH |
| Small scissors | any supplier | For dissecting gametes | |
| NaOH | Roth | 6771.1 | For activating dechorionation solution |
| Tris | Roth | 5429.3 | 1M pH9.5, for sperm activation |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | Treated by immersion in tap water for at least 12h |
| Hand centrifuge | Hettich Zentrifugen | 1011 | Use glass centrifuge tubes |
| 1.5ml Eppendorf tubes | Sigma | T3406-250EA | |
| 2ml Eppendorf tubes | Sigma | T3531-200EA | |
| Square electroporator | Bio Rad Gene Pulser Xcell | ||
| Electroporation cuvettes 4 mm | Eurogentec | CE-0004-50 | |
| Coverslips | Sto Premium | PR248212600 | |
| Glass slides | VWR | ECN 613-1551 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257-10ML | For fixation in LacZ staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-500G | For fixation of fluorescent samples |
| Vectashield | Vector | H-1000 | For mounting of fluorescent samples |
| X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-Galactopyranoside) | Roth | 2315.2 | LacZ substrate; stock in 40mg/ml DMF (Dimethylformamide) |
| K5Fe(CN)6 | Merck | 4984 | For LacZ staining buffer |
| K3Fe(CN)6 | Merck | 4973 | For LacZ staining buffer |
| Na22HPO4 | Roth | 4984.2 | For PBT |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | For PBT |
| Tween | Sigma | SLBJ5103V | For PBT |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | Embryo culture tested |
| Green Vital Dye | Fast Green Sigma | F7251 | for microinjection; 10µg/µl |
| Micropipette Puller (Flaming/Brown) | Sutter Instruments | Model P-97 | For pulling injection needles |
| Borosilicate glass capillaries GC100TF-10 | Harvard Apparatus Ltd. UK | 30-0038 | 1.0mm O.D. x0.78mm I.D., containing filament, for microinjection |
| Micromanipulator | Narishige | MWS-2 | Three-axis Oil Hydraulic System; for 3D fine movement during injection |
| Injection holder | Narishige | 1M-H1 | For holding injection needles, entire system filled with mineral oil |
| All Glass Syringe | Walter Graf & Co GmbH & Co. KG | No. 95199.10427A4 | 10ml FortunaOptima; filled with mineral oil, for fine tuning of microinjection pressure |
| Morpholinos | GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA | Injection at 0.25-0.5mM | |
| Capped mRNA | Ambion mMessage mMashine kit | Injection at 0.05-0.5µg/µl | |
| Plasmid DNA | Injection at 20 ng/µl | ||
| Recombination cloning kit | Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen | 11789-013 | |
| Recombination cloning kit | Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen | 11791-019 |
Referências
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