حقن مكروي الجنين و Electroporation في حبلي<em> Ciona المعوية</em
Summary
نقدم transgenesis عابرة وإسقاط الموروثة في Ciona المعوية، وهي جماعة شقيقة حبلي إلى الفقاريات، وذلك باستخدام تقنيات Microinjection و electroporation. هذه الطرق تسهل علم الجينوم وظيفية في هذه اللافقاريات البسيطة التي تتميز خصائص بدائية من الفقاريات، بما في ذلك الحبل الظهري ورئيس ظهائر الحسية، والعديد من orthologs من الأمراض المرتبطة الجينات البشرية.
Abstract
Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.
Introduction
في الآونة الأخيرة، أصبحت تسلسل الجينوم والجينات ذخيرة كتب الوصول إليها في عدد من الكائنات الحية النموذج. تحديد الروابط الوظيفية الجينات، ومع ذلك، وكيف يتم ماثلة هذه الاتصالات في الحمض النووي لتنفيذ النشاط النسخي طوال الوقت الجنينية والفضاء، تحديا كبيرا، خاصة في الفقاريات. تعقيد التفاعلات التنظيمية وتعقيد الجينوم 1،2، ولا سيما في الفقاريات، وإبطاء تحليلات وظيفية فعالة، ولا سيما على مستوى الحمض النووي في الجسم الحي. في الواقع، ويتم تحليل لا GRN حاليا من الإخصاب إلى المباراة النهائية، دولة متباينة عضال الكائن الحي النامية.
وascidian C. يمثل المعوية كائن نموذج حيث يحلل هذا GRN الكامل قد يكون ممكنا. أنه يحتوي على جينوم غير المكرر نموذجية من اللافقاريات مع التكرار الجيني قليلا. الفقاريات، في المقابل خضعت جولتين من الازدواجية الجينوم أن هفه ولدت عائلات الجينات أكبر وتنويع وظيفي ولكن أيضا التكرار بين paralogs. حزمه تسلسل -regulatory رابطة الدول المستقلة (وحدات التحكم من GRNs) من C. المعوية، والنسب الجنينية ثابت مع خلايا قليلة تذكرنا C. ايليجانس. وعلاوة على ذلك، موقف النشوء والتطور الفريد كمجموعة شقيقة اللافقارية إلى الفقاريات داخل حبليات يسمح الملاحظة تنموية، في قرار الخلوية، من الخطة تشكيل هيئة حبلي 3-6.
القضية الأساسية التي تضمن النجاح في المستقبل من علم الجينوم وظيفية في الكائنات النموذج هو توليد أعداد كبيرة من الأجنة لالكمي في الجسم الحي الاضطرابات. تطوير تقنية حقن مكروي في البيض Ciona 7، وإمكانية الحصول بسرعة على العديد من الحيوانات المعدلة وراثيا عابر من قبل في الجسم الحي Electroporation للفي مئات Ciona بيضات ملقحة 8،9 كان انفراجة في <em> Ciona علم الجينوم وظيفية. هنا، نقدم لأول مرة تقنية حقن مكروي أكثر شاقة لاستهداف الجينات الفردية التي لا يزال الأسلوب المفضل لmorpholino (MO) ضربة قاضية الجينات بوساطة، ولا سيما النصوص الأمهات. oligos MO تستهدف عادة البادئ ATG أو المواقع لصق من الحمض النووي الريبي وتتداخل مع الترجمة البروتين. نحن ثم تظهر كيف Electroporation للفي البويضات المخصبة من Ciona يسمح لأعداد كبيرة من الأجنة ليتم تحليلها بطريقة الكمي، مما فتح آفاقا للتحليل الفعال للمحسنات في الجسم الحي وgain- الأنسجة محددة أو الخسارة من النهج وظيفة، مع إمكانية للتلاعب في وقت واحد والتحليلات. نظهر أيضا كيفية استخدام أدوات المجتمع Ciona لفي التنبؤ SILICO من المناطق التنظيمية والاستنساخ كفاءة الكاملة إطارات القراءة المفتوحة (ORFS) في ناقلات التعبير. وأخيرا، علينا أن نظهر التفاضلية تعريب التحت خلوية من الموسومة fluorescentlyأو المسمى البروتينات على overexpression من Electroporation لل.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك نوعان من التقنيات الرئيسية لتوليد أجنة Ciona المعدلة وراثيا: Microinjection من RNA أو DNA و electroporation الحمض النووي. استخدمت هذه التقنيات لاضطراب الجينات في الأجنة Ciona أولا في 1990s 7،8 ومنذ ذلك الحين تحسنت تباعا، وتستخدم الآن في Ciona (وغيرهم من أجناس ascidian) 20 في جميع أنحاء العالم.
الخطوات الحاسمة في البروتوكول
transgenesis الناجح في الأمشاج Ciona التي يتم جمعها بسهولة من الحيوانات البالغة يعتمد على عدد من العوامل الحاسمة. نوعية الأمشاج تعتمد على موسم التفريخ (عموما من مايو.-ديسمبر. في شمال المحيط الأطلسي، وتغيير درجة حرارة الماء والأوكسجين)، على نوعية مياه البحر في أحواض السمك (في الملوحة الصحيحة والبالغين البقاء بصحة جيدة لمدة 2-4 أسابيع) وأخيرا على التعامل الصحيح من الأمشاج على استخراج من البالغين، كما هو مفصل أدناه للحصول على الخطوات المختلفة فيبروتوكول.
خلال خطوات إعداد واحتضان ماصات باستور مع الاستفادة من المياه ومنع الأجنة من الالتصاق ومياه البحر قبل حضانة أطباق بتري المغلفة الاغاروز وإزالة المواد السامة المنبعثة من الاغاروز. عموما، قد تكون على استعداد أطباق لتصل إلى 2 أسابيع قبل الاستخدام، وتخزينها في 4 درجة مئوية لتجنب نمو البكتيريا وتشطف حديثا قبل الاستخدام. يوم واحد من العمر، أطباق صغيرة تبدو أفضل لحقن.
الكفاءة وطول dechorionation هي خطوة حاسمة في بروتوكول كعلاج لفترات طويلة من البيض / الأجنة سيضر التنمية. إعداد دقيق (لا الهز) والتخزين الصحيح (في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد) الحفاظ على نوعية الحل dechorionation. البروتياز في حل تفقد كفاءة إذا إما مختلطة بعنف أيضا في إعداد أو مع مرور الوقت، ولا سيما إذا كان يحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة لأطول ساعات / يوم. لقد الأمثل هذه الخطوة الهامة باستخدام حل dechorionation جديدة ملائمأعدت من قسامات المجمدة من 20x وحل الأسهم.
المعالجة الصحيحة للالهشة البيض dechorionated / الأجنة أمر ضروري والقص أو طعن أجنة في حين pipetting لسوف يكون ضارا. عندما pipetting ل، تتم المحافظة على الأجنة قدر الإمكان في تعليق (عن طريق بلطف "تهب" السائل إلى دوامة عنها يتبع من قبل pipetting سلس ولكن سريع)، في حين عقد ماصة الزجاج في عمودي بدلا من وضع أفقي. تنطبق هذه الرعاية لجميع الخطوات pipetting لللغسيل، إعادة تعليق، ونقل البيض / الأجنة داخل وخارج الأنابيب، cuvettes أو لوحات، قبل وبعد التثبيت. على التثبيت، كما ينبغي إيلاء عناية خاصة لأجهزة pipetting لمنفصلة ليعيش مقابل الأجنة ثابتة لتجنب أي سمية من بقايا مثبتات.
حقن مكروي هو صعب إلى حد ما في Ciona البيض / الأجنة بسبب صغر حجمها ومرونة الغشاء المحي وخطيرة يعتمد على حجم غيض الأمثل للإبرة الحقن، زاوية الكمال من حقن (حركة إبرة في سطر واحد، على طول نصف قطرها البيض) ودقيقا، وكسر اليدوي من الغشاء المحي (عن طريق الشفط قبل التطلع للحقن). هذا الأخير غير ممكن إلا إذا تم القضاء على فقاعات الهواء تماما من أنابيب الحقن التي تحتوي على الزيوت المعدنية لتعويض الضغط شفط / الحقن. وبالإضافة إلى ذلك، فإن أصغر قطعة من الغبار أو البيض الحطام تسد الإبرة، ويتم تجنبها بسهولة عن طريق ظروف العمل نظيفة والشطف خطوات للبيض قبل نقل على طبق الحقن. حقن آخر، فإن نقل البيض على الأطباق الطازجة تجنب الآثار السامة من أجنة ميتة لا بعد أن نجا من إجراء الحقن.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها
ويمكن معالجة المشاكل المحتملة في الإجراء عن طريق الحلول التالية. وقد تنشأ معدلات التسميد منخفضة من تنشيط الحيوانات المنوية غير كافية، ونظافة البيض منخفضة أو وحدات التخزين الإخصاب كبيرة. استخدام freshlذ المجمعة وأقل المخفف الحيوانات المنوية. تحقق من حركة الحيوانات المنوية على التنشيط. غسل البيض مع ASWH قبل الإخصاب كما هو موضح في الخطوة 4.2. تقليل حجم المياه وتقليل كمية من البيض في طبق الإخصاب / جيد. فقدان الأجنة خلال خطوات إعداد يمكن تجنبها عن طريق إضافة قطرة من حل dechorionation لأجهزة الطرد المركزي أكثر كفاءة أسفل البيض / الأجنة undechorionated. يجب أن يكون الأمثل Dechorionation الوقت والبيض dechorionated جزئيا لن الرواسب وdechorionation لفترات طويلة هي سامة، مما تسبب في الأجنة لتنفجر.
قد تنشأ تطوير متزامنة من الحيوانات المنوية المتبقية صدر أثناء تشريح. الحفاظ على دفعات بيضة فصل من الحيوانات المختلفة لتجنب غير المنضبط تلاقح. نمو غير طبيعي يمكن أن يكون لأسباب مختلفة. في بداية ونهاية الموسم، بعد حفظ الجنين من مختلف الأفراد المنفصلين، ويمكن اختيار أفضل دفعات. تجنب تشويش الأجنة ل10 دقيقة التي تلي الإخصاب لتجنب التداخل مع عزلهم ooplasmic. تأكد من أن الأجنة لم تبدأ بتقسيم أثناء نقله كما pipetting ليفصل عن Blastomeres الشقيقة والنتائج في الأجنة جزئية. استخدام كميات أقل من الحيوانات المنوية للبيض dechorionated لتجنب تعدد الإمناء. استخدام أطباق الأغاروس الطازجة ولكن تشطف. تأكد من أن الجهاز pipetting لنقدمه مجانا مثبت. إبقاء الأجنة السيطرة التي لم dechorionated وليس electroporated للكشف على الخطوة التي التنمية تعطلت. تكملة الأجنة مع المضادات الحيوية في حالة حدوث تلوث والتحلل.
إذا كان الجهاز حقن و"انسداد"، افتتاح إبرة الحقن يمكن التحقق منها من قبل طرد بعض من محتواه الملون. يمكن محوها المواد انسداد قبالة عن طريق سحب بعناية طرف الإبرة من خلال الاغاروز. فقاعات الهواء في أنابيب حقن و / أو يجب إزالة إبرة. تغيير الإبرة لتحسين السيطرة على حجم الحقن مثل نيغيض DLE قد كسر أو تسد على طول الحقن. شطف البيض ووضعها في طبق حقن نظيفة إذا تراكمت الحطام في الطبق. أجهزة الطرد المركزي في حل حقن قبل ملء الإبر جديدة من أجل الرواسب أي جزيئات صغيرة أو البلورات. من المفيد أيضا تمارس حقن فقط مع صبغ حيوي. التحقق من تقنية الحقن عن طريق التسميد البيض حقن وغير حقنه. وأخيرا، والتشاور مع زميل ذوي الخبرة يمكن أن تكون مفيدة لتحسين تقنية الحقن.
للسيطرة على الآثار بعيدا عن الهدف الثاني غير متداخلة MO والإنقاذ مع مرنا المحورة التي لا تعترف بها المنظمات الأعضاء يمكن استبعاد بإخلاص آثار المظهري غير محددة في Ciona.
حقن مكروي: أهمية والقيود
تم استخدام حقن مكروي في Ciona لتوليد أول مخطط لشبكة تنظيمية كله الجنين الجين (GRN) في حبلي 11. ومع ذلك، على الرغم من هذا ريماتحقيق rkable، حقن مكروي في الأجنة Ciona له حدود، ويرجع ذلك إلى الحجم الصغير نسبيا (0.14 مليمتر في القطر) من البيض Ciona. مقارنة بتلك الأنواع حبلي أخرى حيث دنا غريب / هو عرض مرنا بواسطة إبر دقيقة جدا، والبيض Ciona صعبة نسبيا في التعامل معها ويبقى معدل الأجنة Ciona حقن في التجربة منخفض (في المتوسط 30-50 الأجنة في التجربة)، التي تعرقل التحليلات الكمية. ومع ذلك، لعوامل الأمهات مشوشة في Ciona، Microinjection من المنظمات الأعضاء هو الأسلوب المفضل أيضا لدراسة مشاركتها في بداية اقحي التنمية من الخلية 16-32 مراحل 15. وبالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن وإن كان أكثر صعوبة لmicroinject عن Blastomeres الفردية وصولا إلى مرحلة 16-32 الخلية. وأخيرا، لا يزال حقن مكروي التقنية الأكثر كفاءة لتوليد الأجنة وراثيا (عن طريق مرنا أو حقن الحمض النووي) في الأنواع ascidian أخرى من Ciona، التي optimi بالكامللا توجد زيد بروتوكولات Electroporation لل.
Electroporation لل: أهمية والقيود
للتغلب على الأرقام المنخفضة وغيرها من القيود من حقن مكروي، وقد استخدمت معظم المجتمع Ciona Electroporation للمن البلازميد منذ تم تطويره ونشره على أنه بروتوكول الأمثل وموحد من قبل زيلر وآخرون في عام 2004 9. في الواقع، الآلاف من الأجنة Ciona المعدلة وراثيا يمكن أن تتولد خلال ساعة واحدة مع ما يصل إلى 500 الأجنة electroporated في وقت واحد في كفيت واحدة باستخدام واحد 50 V نبض 16 ميللي ثانية. النهج لتوليد أعداد كبيرة من الأجنة وراثيا لا يزال فريد بين الكائنات نموذج حبلي. وقد أدى هذا Ciona لا بد من الاعتراف بسرعة كنظام نموذج قوي لأداء المجراة تحليلات المناطق -regulatory رابطة الدول المستقلة المحتملة والخلوية / دوين الخلوي التعريب، كما يتضح هنا.
على الرغم من أن electroporatiعلى في بيضات ملقحة Ciona ثورة جذري في مجال الأبحاث حبلي GRN، والتقنية ومع ذلك يواجه بعض القيود. أولا، يتم إدخال البلازميدات عابر في الأجنة Ciona وعلى الأرجح الموروث صفائف خارج الصبغي، مما يجعل من استقرار electroporated البلازميد المضاربة. وعلاوة على ذلك، فإنه من الصعب جدا، بل وربما من المستحيل، للسيطرة على نسخ من البلازميدات electroporated التي سيتم تناولها في البيضة الملقحة، مما أدى إلى تقلبات المظهرية. وثمة مشكلة أخرى أن يجعل من الصعب تفسير النتائج Electroporation للظاهرة التي نسميها الاصباغ. يمكن اتخاذها Electroporated DNA البلازميد تصل في مواقع مختلفة من مرحلة الجنين خلية واحدة. الذي يحدد وعدد أرباع البيضة الملقحة سوف تتلقى البلازميد تكون موروثة من قبل عن Blastomeres أصل أفريقي. هذه الاختلافات تجعل بوضوح تفسير الآثار الكمية أكثر صعوبة. ومع ذلك، فإن معظم المشاكل التي تأتي مع electroporaتحل تقلب نشوئها من مبلغ مناسب من العينات البيولوجية، مع العد والإحصاء لLacZ (أو GFP) خلايا الإيجابية، التي يتم الحصول عليها بسهولة في دفعة واحدة.
براعة وإمكانات Electroporation للللهندسة الوراثية
Electroporation لليسمح في نهاية المطاف للفحص منتصف الإنتاجية من المناطق -regulatory رابطة الدول المستقلة المحتملة والتحليلات الكمية وظيفة الجين مرة واحدة مستنسخة إلى المراسل أو التعبير البلازميدات. ويرجع ذلك إلى الجينوم Ciona المدمجة، وتحديد واستنساخ المناطق التنظيمية المحتملة غير واضحة إلى حد ما 3. ويتجلى استراتيجية لاستخدام ثروة من البيانات المجتمع في الشكل 2A. ومما يسر استنساخ مراسل والجينات البلازميدات ترميز من قبل جيل من Ciona تكييفها، GATEWAY متوافقة أجنحة ناقلات 19 و طوله متوافق ORF مكتبة 18. على حد سواء الأدوات المتاحة للمجتمع والسماح للكفاءة، وتقييد إعادة التركيب خالية من إنزيم السائقين التنظيمية ومناطق الترميز، كما هو مبين في الشكل 2B.
في السنوات الأخيرة، تم تكييفها Electroporation للبنجاح لتحقيق التلاعب الجيني يستهدف الأنسجة مع البلازميدات التي تعبر عن أدوات التحرير الجينات مثل مكونات كريسبر / Cas9 تحت سيطرة الأنسجة برامج معينة 21،22. وهذه النهج تتقدم بسرعة فهمنا لديناميات GRNs وآليات الإشارات يحتمل الحفظ، بما في ذلك رموز عامل النسخ تشارك في تكوين الأنسجة والخروج التدريجي من تعدد القدرات. وعلاوة على ذلك، سوف loss- الأنسجة محددة أو الحصول على وظيفة من النهج (من كريسبر / Cas9 أو overexpression) باستخدام Electroporation للأن يكون مفيدا لدراسة orthologs Ciona من الجينات المرتبطة بأمراض الإنسان. في الواقع، كتالوجات للorthologs Ciona من جينات الأمراض البشرية والكامل طول ORF الترميز الحيوانات المستنسخة هي التواجد بسهولةلو لتحليلها في Ciona 1 8. ويرجع ذلك إلى الازدواجية الجينوم واسعة في الفقاريات، ومعظم الجينات البشرية تمتلك paralogs زائدة عن الحاجة وظيفيا التي تعقد تحليلات وظيفة الجين 1. Ciona كونه نظاما أبسط مع ترتيب الأنسجة حبلي نموذجي في اليرقات يجب الكشف عن الأدوار الأساسية لتلك الجينات المهمة في كثير من الأحيان الحفاظ ظيفيا.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the University of Innsbruck, Austria, and the Austrian Academy of Sciences (ÖAW).
Materials
| Lab with constant temp. (~ 18°C) | For embryo work | ||
| Ciona intestinalis adults | UPMC – Station Biologique, Roscoff, France |
For collecting gametes | |
| NaCl | Roth | 3957.1 | For ASWH |
| KCl | Roth | 6781.1 | For ASWH |
| CaCl2x2H2O | Roth | A119.1 | For ASWH |
| MgCl2x6H2O | Roth | 2189.1 | For ASWH |
| MgS04x7H2O | Roth | P027.2 | For ASWH |
| NaHCO3 | Roth | 6885.1 | For ASWH |
| Hepes | Roth | HN78.3 | For ASWH |
| Sodium thioglycolate | Sigma | MZ-6 | For Dechorionation |
| Pronase | Sigma | T0632-100G | For Dechorionation |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | M9546-250G | For electroporation |
| Plasmid DNA (prep >1µg/µl) | Macherey-Nagel | 740410.100 | For electroporation or microinjection |
| Agarose | any supplier | For coating embryo culture dishes | |
| Plastic petri dishes | VWR | 612-2079 | Coated with 1% Agarose in ASWH, covered with ASWH |
| Small scissors | any supplier | For dissecting gametes | |
| NaOH | Roth | 6771.1 | For activating dechorionation solution |
| Tris | Roth | 5429.3 | 1M pH9.5, for sperm activation |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | Treated by immersion in tap water for at least 12h |
| Hand centrifuge | Hettich Zentrifugen | 1011 | Use glass centrifuge tubes |
| 1.5ml Eppendorf tubes | Sigma | T3406-250EA | |
| 2ml Eppendorf tubes | Sigma | T3531-200EA | |
| Square electroporator | Bio Rad Gene Pulser Xcell | ||
| Electroporation cuvettes 4 mm | Eurogentec | CE-0004-50 | |
| Coverslips | Sto Premium | PR248212600 | |
| Glass slides | VWR | ECN 613-1551 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257-10ML | For fixation in LacZ staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-500G | For fixation of fluorescent samples |
| Vectashield | Vector | H-1000 | For mounting of fluorescent samples |
| X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-Galactopyranoside) | Roth | 2315.2 | LacZ substrate; stock in 40mg/ml DMF (Dimethylformamide) |
| K5Fe(CN)6 | Merck | 4984 | For LacZ staining buffer |
| K3Fe(CN)6 | Merck | 4973 | For LacZ staining buffer |
| Na22HPO4 | Roth | 4984.2 | For PBT |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | For PBT |
| Tween | Sigma | SLBJ5103V | For PBT |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | Embryo culture tested |
| Green Vital Dye | Fast Green Sigma | F7251 | for microinjection; 10µg/µl |
| Micropipette Puller (Flaming/Brown) | Sutter Instruments | Model P-97 | For pulling injection needles |
| Borosilicate glass capillaries GC100TF-10 | Harvard Apparatus Ltd. UK | 30-0038 | 1.0mm O.D. x0.78mm I.D., containing filament, for microinjection |
| Micromanipulator | Narishige | MWS-2 | Three-axis Oil Hydraulic System; for 3D fine movement during injection |
| Injection holder | Narishige | 1M-H1 | For holding injection needles, entire system filled with mineral oil |
| All Glass Syringe | Walter Graf & Co GmbH & Co. KG | No. 95199.10427A4 | 10ml FortunaOptima; filled with mineral oil, for fine tuning of microinjection pressure |
| Morpholinos | GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA | Injection at 0.25-0.5mM | |
| Capped mRNA | Ambion mMessage mMashine kit | Injection at 0.05-0.5µg/µl | |
| Plasmid DNA | Injection at 20 ng/µl | ||
| Recombination cloning kit | Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen | 11789-013 | |
| Recombination cloning kit | Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen | 11791-019 |
Referências
- Holland, P. W., Garcia-Fernandez, J., Williams, N. A., Sidow, A. Gene duplications and the origins of vertebrate development. Dev Suppl. 120 (1), 125-133 (1994).
- Simmen, M. W., Leitgeb, S., Clark, V. H., Jones, S. J., Bird, A. Gene number in an invertebrate chordate, Ciona intestinalis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (8), 4437-4440 (1998).
- Dehal, P., et al. The draft genome of Ciona intestinalis: insights into chordate and vertebrate origins. Science. 298 (5601), 2157-2167 (2002).
- Satoh, N., Satou, Y., Davidson, B., Levine, M. Ciona intestinalis: an emerging model for whole-genome analyses. Trends Genet. 19 (7), 376-381 (2003).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Lemaire, P. Unfolding a chordate developmental program, one cell at a time: invariant cell lineages, short-range inductions and evolutionary plasticity in ascidians. Dev Biol. 332 (1), 48-60 (2009).
- Hikosaka, A., Satoh, N., Makabe, K. Regulated spatial expression of fusion gene constructs with the 5′ upstream region of Halocynthia roretzi muscle actin gene in Ciona savignyi embryos. Roux’s Arch Dev Biol. 203 (1-2), 104-112 (1993).
- Corbo, J. C., Levine, M., Zeller, R. W. Characterization of a notochord-specific enhancer from the Brachyury promoter region of the ascidian, Ciona intestinalis. Development. 124 (3), 589-602 (1997).
- Zeller, W. R. Generation and use of transgenic ascidian embryos. Methods Cell Biol. 74 (74), 13-30 (2004).
- Satou, Y., Imai, K. S., Satoh, N. Action of morpholinos in Ciona embryos. Genesis. 30 (3), 103-106 (2001).
- Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312 (5777), 1183-1187 (2006).
- Tassy, O., et al. The ANISEED database: digital representation, formalization, and elucidation of a chordate developmental program. Genome Res. 20 (10), 1459-1468 (2010).
- Brozovic, M., et al. ANISEED 2015: a digital framework for the comparative developmental biology of ascidians. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Kubo, A., et al. Genomic cis-regulatory networks in the early Ciona intestinalis embryo. Development. 137 (10), 1613-1623 (2010).
- Rothbächer, U., Bertrand, V., Lamy, C., Lemaire, P. A combinatorial code of maternal GATA, Ets and β-catenin-TCF transcription factors specifies and patterns the early ascidian ectoderm. Development. 134 (22), 4023-4032 (2007).
- Segal, E., et al. A genomic code for nucleosome positioning. Nature. 442 (7104), 772-778 (2006).
- Khoueiry, P., et al. A cis-regulatory signature in ascidians and flies, independent of transcription factor binding sites. Curr Biol. 20 (9), 792-802 (2010).
- Gilchrist, M. J., et al. A pipeline for the systematic identification of non-redundant full-ORF cDNAs for polymorphic and evolutionary divergent genomes: Application to the ascidian Ciona intestinalis. Dev Biol. 404 (2), 149-163 (2015).
- Roure, A., et al. A multicassette Gateway vector set for high throughput and comparative analyses in ciona and vertebrate embryos. PLoS One. 2 (9), e916 (2007).
- Kumano, G., Takatori, N., Negishi, T., Takada, T., Nishida, H. A maternal factor unique to ascidians silences the germline via binding to P-TEFb and RNAP II regulation. Curr Biol. 21 (15), 1308-1313 (2011).
- Sasaki, H., Yoshida, K., Hozumi, A., Sasakura, Y. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the ascidian Ciona intestinalis. Dev Growth Differ. 56 (7), 499-510 (2014).
- Stolfi, A., Gandhi, S., Salek, F., Christiaen, L. Tissue-specific genome editing in Ciona embryos by CRISPR/Cas9. Development. 141 (21), 4115-4120 (2014).
