在成像钙<em>果蝇</em>在蛋激活

注：在常温下进行所有步骤，除非另有说明。 1.准备解剖注意：这里描述的步骤都是按照E. Gavis，普林斯顿大学和威尔等。人 18。前成像执行以下步骤两天。 取含有大约10毫升固体食物蝇小瓶中并干燥酵母的少量添加到一个角，小于1g是足够的。 注：有关飞小瓶或食品信息，请参阅“ 果蝇维护”19。 加入1 – 水3滴，以水化酵母。 预留小瓶在45°角，并允许3 – 为对酵母5分钟以占用水。 而酵母是吸收水，选择一个瓶表达由浴盆-VP16GAL4驱动UASt- MYR GCaMP5 20蝇（简称GCaMP5），该最近出现（一myristoy被选择的GCaMP5的迟来形式通过在蛋拴系的GECI向膜），以提供高的信噪比。 麻醉苍蝇在瓶的 CO 2气体。一定要保持瓶口倒置，以免失去苍蝇在湿的食物。 尖端麻醉苍蝇到CO 2垫和排序10 – 15名女性和男性5使用解剖显微镜下画笔。注：这是标准的，包括男性为解剖提供健康的女性。 当来自步骤1.3小瓶准备就绪时，所选择的苍蝇添加到小瓶中。注意保持小瓶水平，直到苍蝇变得活跃。 放置在25℃的小瓶约36小时。 从CO 2垫到瓶子或丢弃返回剩余的苍蝇。 2.解剖果蝇卵巢注意：这里描述的步骤都是按照威尔等。人。 <s达> 18。 36小时后，从CO 2 yeasted小瓶麻醉苍蝇。 一旦小瓶内部的苍蝇麻醉提示他们到CO 2的垫用解剖显微镜下漆刷进行排序。 选择一个女性。 隔离从阴两个卵巢。有关完整详细的协议看威尔等。人 18。综上所述： 将含氧卤烃油（系列95）的一小滴在1.5号，22×40mm的盖玻片。 把握用镊子阴在腹部的前部。 在解剖显微镜下握住女性，使用第二套钳轻轻地去除女性的后路。 擦去从第二钳后组织。 挤在与由前腹部的后部的第2钳子腹部空腔。这两个不透明卵巢应坚持镊子时，外面的联邦紧急事务管理局勒。 触摸卵巢进油。 擦去镊子除去从钳子的任何组织。 从一飞获得3盖玻片，每个包含卵巢 – 重复上述步骤（2.4.7 2.4.1）。 3.隔离单个成熟卵子根据与来自步骤2.4设置为4X，在第一盖玻片的倍率的标准解剖显微镜，通过撕开输卵管分开的两个卵巢。 介绍一对封闭钳成一个卵巢的中心，注意不要刺破任何蛋室。 插入一个标准的解剖探入卵巢的中心封闭镊子旁边。 通过朝后极，其中，成熟的卵子（阶段14蛋室）位于卵巢轻轻拖曳解剖探针。 重复步骤3.1 – 取决于卵巢和蛋的数量的大小的5倍 – 3.4 2。 注：CO 2的添加</子>通常会导致将出现与凸起背侧附属物比预沉积卵较大的单个蛋的沉积。因为它已经被阴内激活这个蛋应该丢弃成像。 注：成熟的卵子有可能轻松地从卵巢结缔组织分隔。 如果没有成熟的卵子都是卵巢的外部可见，继续轻轻地用解剖探头戏弄。 在盖玻片的中心的线5 – 一旦成熟卵是对卵巢的外盖玻片可见，操纵3。 注：为达到最佳效果，沿鸡蛋的一侧轻轻地运行探头。 注意：不要拉背附肢，否则会损坏卵子。 注意：根据未来成像设置，对准鸡蛋约200微米相距垂直于盖玻片最大成像区。 一旦对准，通过使用f起对准鸡蛋拖动距离取出卵巢组织的其余部分orceps。 通过与医疗擦拭涂抹角落删除多余的油。小心不要碰到成熟的卵子与医疗擦拭那些接触将失去作为成熟的卵子。 上绘制盖玻片的十字准线与一个标记，以简化定位在显微镜下的样品。 坐落在一个安全的地方盖玻片，离开盖玻片上的准备鸡蛋室休息5 – 10分钟。这允许蛋在油定居。样品可以使用到1小时后淋巴结清扫术。 重复步骤3.1 – 3.11盖玻片的其余部分与他们的卵巢。 4.准备成像带来制备活化缓冲器15至室温。 注意：激活缓冲液是低渗缓冲液：3.3毫的NaH 2 PO 4，16.6毫KH 2 PO 4，10 mM氯化钠，50mM的氯化钾，5％的聚乙二醇8000，2毫氯化钙2，调至pH 6.4以1： 5比氢氧化钠：KOH。有关详细信息，请参阅马霍瓦尔德，1983 15。活化缓冲液的等分可以储存在-20℃下个月，并在4℃下最多2周。 精心准备运盖玻片，活化缓冲液和玻璃吸管的成像设备。 注意：宽视场，共聚焦，旋转光盘或光片显微镜都可以使用。我们建议使用倒置显微镜。利用共聚焦显微镜获得了我们的代表性的结果。 适合成像整个成熟的卵子一个目标应（这里：20X 0.7 NA）选择。 安装在显微镜阶段的第一个准备盖玻片。小心不要打破舞台上的盖玻片。 定性选择的视场与成熟卵室进行激活。不要刺破形象蛋室或那些在细胞膜起泡。 注意：对于步骤4.6 – 4.7，软件命令将视显微镜和制造商的不同而不同。 组影像对位米标准GFP激发（488纳米）和发射（500 – 580纳米）。还成立了以可视化和定向的成熟卵子和流离失所油明视场视图。 选择最低的Z平面，其中成熟卵是可见的，并设置一个完整的Z堆栈应采取的40微米每步约2微米。所以Z堆栈收购之间没有延迟设置参数。设置的时间序列来捕获约30分钟。 5.成像离体激活蛋启动图像捕捉。 等待1 – 要获得2个全Z-栈。这说明之前激活成熟的卵子。 撤回大约300微升活化缓冲剂成玻璃吸管。 定位含有活化缓冲液中在45°角盖玻片上方的玻璃吸管的前端，慢慢地吸移管移入光束路径直到它直接上面的成熟卵被成像。玻璃吸管应为1 – 2厘米油上方。 从玻璃吸管活化缓冲液2滴，在不到5秒 – 加入1。这应该置换的油。避免加入过量的活化缓冲或触摸与玻璃吸管蛋，因为它可以导致成熟卵子的位移。小心不要碰到盖玻片用吸管，因为这可能会导致在焦平面或气泡的变化，形成了客观和盖玻片之间的浸油。 虽然图像采集过程中添加活化缓冲液，检查亮场通道，确保油已被激活缓冲流离失所。 注意：这将首先显示为阴影，由于移液管断裂的光束路径，但也将导致在小油滴的外观。有些油滴可以与成熟的卵子，这将影响实验结果和图像质量保持联系。 如果油没有从初始加成活化缓冲液重复的位移步骤5.4 – 50.6。 一旦油被成功移动，使时间序列直到完成运行。 注：由于在激活卵母细胞肿胀，有的蛋商会将显着增加时激活缓冲区移出焦平面或视场。在这种情况下，停止采集并安装下一个盖玻片。 图像序列已完成收购后，保存数据。 6.收购后图像处理打开使用斐济（http://fiji.sc/Downloads#Fiji），或同等图像处理软件中的数据集，并选择相关文件进行分析。 要建立采集数据的投影选择：图像>栈> Z-项目。 选择开始的Z-切片和停止的Z-片，典型地整个部分。选择投影式，通常设置为“最大强度”。选中复选框“所有时间框架”来选定的设置适用于整个系列。 如果一个以上的荧光信道已被成像，使用该频道工具来启用颜色之间的运动，使得复合材料，或者使图像的灰度。选择图像>颜色>频道工具。 要调整图像亮度和对比度选择图像>调整>亮度/对比度。 要导出单个图像，移动滑块时间表的有关框架，然后选择文件>另存为> JPEG，或任何首选格式。 选择导出的文件的位置和名称，然后保存。 注意从成像软件的帧频将被要求提供在图像上的时间戳。 以时间序列导出为影片选择：文件>另存为> AVI，然后选择帧速率（〜每秒7帧）。 选择导出的文件的位置和名称，然后保存。 为了节省在斐济格式调整文件，选择File>保存。