Agregada Optimization Tamanho em micropoços para sistemas baseados em Suspensão Cardiac diferenciação de células estaminais pluripotentes humanas

1. Preparação dos componentes do meio Prepare meio de lavagem. Por 100 ml de DMEM / F12, adicionar 1 ml de 100 x penicilina / estreptomicina (Pen / Strep), 1 ml de 100x de L-glutamina, e 5 ml de soro de substituição. Prepara-se o quimicamente definido Basal Medium cardíaca Indução de acordo com as instruções do fabricante. Prepare os seguintes reagentes de ações para a mídia que serão utilizados neste protocolo. Ácido L-Ascórbico: Prepara-se uma solução stock de 5 mg por ml em 4 ° C, água destilada ultra-pura esterilizada em um tubo cónico. Deixar a solução em gelo e agitar com vortex até que o tubo periodicamente o soluto é dissolvido completamente. Filtro-esterilizar a solução de ácido ascórbico utilizando um filtro de seringa de 0,22? M. Preparar alíquotas de 1 ml da solução de ácido ascórbico e armazenar essas aliquotas a -20 ° C. Usar uma alíquota descongelada recentemente cada meio tempo é preparado. No dia da preparação médio, Dilui-se 13 ul de monotioglicerol (MTG) em 1 ml de Meio de Indução Basal cardíaco. Descartar não utilizado MTG, diluída. Preparar alíquotas de 1 ml de transferrina (30 mg / mL) para armazenar a -20 ° C. Loja descongeladas aliquotas a 4 ° C durante até 3 meses. Prepare ácido 4 mM clorídrico (HCl) contendo 0,1% de Albumina de Soro Bovino (BSA). Numa hotte, adicionar 30 ul de uma solução de HCl 6,0 N a 50 ml de água destilada ultra-pura. Filtrar-esterilizar a solução com um filtro de seringa de 0,22 mM. Adicionar 2 ml de solução de BSA a 25% para a solução de HCl a 50 ml. Preparar tampão fosfato salino (PBS) contendo 0,1% de BSA. Adicionar 20 ul de solução de BSA a 25% por ml de PBS. Prepare humano osso morfogenética Proteína 4 (BMP-4) solução estoque (10 ng / ul). Dissolve-se 10 ug liofilizadas BMP-4 em 1 ml de solução tampão de HCl 4 mM contendo 0,1% de BSA. Preparar 50 uL alíquotas para armazenar a -20 ° C. Prepare Humano Fibroblasto Crescimento Fator 2 solução-mãe (bFGF)(10 ng / ul). Dissolve-se 10 mg de bFGF liofilizado em 1 ml de tampão fosfato salino (PBS) contendo 0,1% de BSA. Preparar 50 uL alíquotas para armazenar a -20 ° C. Prepare Endotelial Vascular fator de crescimento humano (VEGF) solução estoque (5 ng / mL). Dissolve-se 5 ug de VEGF liofilizada em 1 ml de PBS contendo 0,1% de BSA. Preparar 50 uL alíquotas para armazenar a -20 ° C. Prepare Activina A solução estoque (10 ng / ul). Dissolve-se 10 ug liofilizadas Activina A em 1 ml de PBS contendo 0,1% de Albumina de Soro Bovino (BSA). Preparar 50 uL alíquotas para armazenar a -20 ° C. Prepare Inibidor de Wnt-2 Produção (IWP-2) solução estoque (10 mM). Dissolve-se 2 mg IWP-2 em 429 ul de dimetilsulfóxido (DMSO). Preparar 10 uL alíquotas para armazenar a -80 ° C. Prepare completa Cardiologia Indução Médio. A 100 ml de Basal cardíaca meio de indução, adicionar 1 ml de 100x Pen / Strep a 1 ml de 100x de L-glutamina, 500 mL de transferrina, 1ml de ácido ascórbico descongelado de fresco, e 300 ul de MTG. Descarte médio não utilizado. 2. Preparação da placa de micropoços NOTA: Todos os passos devem ser realizados numa câmara de segurança biológica. Adicionar 0,5 ml de solução de lavagem (componente do kit) para cada cavidade que irá ser utilizada na placa. Para assegurar que os contactos solução toda a superfície interior de cada micropoço, centrifugar a placa a 840 xg durante 2 min. Incubar a placa durante 30 a 60 min à temperatura ambiente. Aspirar a solução de lavagem de poços. Lavar cada poço duas vezes como se segue: Adicionar 1 mL de PBS a cada poço, a placa de centrifugação a 840 xg durante 2 min, e depois aspirar o PBS. 3. Formação de HPSC agregados na microplaca NOTA: Todos os passos devem ser realizados numa câmara de segurança biológica. Coloque meio de lavagem em um banho de água C 37 °. NOTA: O volume necessário = 1 ml x número de poços de HpSC que vai ser dissociado. Dissociar hPSCs para células individuais Nota: Estes passos descrevem a dissociação de células cultivadas em placas de 6 cavidades – os volumes de reagente pode ser dimensionada proporcionalmente para diferentes formatos de cultura. Aspirar o meio de cultura a partir de cada cultura HPSC bem para a dissociação. Lavar cada poço com 1 ml de enzima de dissociação, e depois aspirar imediatamente a enzima de dissociação a partir de cada poço. NOTA: a dissociação da enzima residual deve ser suficiente para dissociar as células. Incubar a placa a 37 ° C durante 3 min. Adicionar 1 ml de meio de lavagem a cada poço e mecanicamente dissociar as células da superfície de cultura do tecido por pipetagem do meio de lavagem com uma micropipeta sobre a superfície do P1000 de cultura de tecidos. Se a dissociação parece ser incompletas e aglomerados celulares permanecem, passar a suspensão através de um filtro neste ponto. Transferir a suspensão de células para um tubo cónico de 15 ml e armazenaro tubo na incubadora, enquanto a contagem de células é realizada no passo seguinte. Executar uma contagem de células: Retirar uma amostra de 10 uL da suspensão de células recolhido no passo anterior. Adicionar 30 ul de azul de tripano e misturar a suspensão bem por pipetagem. Transferem-se 10 ul de células com Trypan Blue-coradas para cada uma das câmaras de um hemocitómetro e visualizar sob o microscópio invertido com a objectiva 10X. Contar as células. A partir dos resultados da contagem de célula, calcular o número de poços pode ser semeadas a 1,2 x 10 6 culas por cavidade da placa de microcavidades. Calcular Média agregação necessária para propagar as células em 1 ml por poço. Prepare meio de agregação. Por 10 ml de completa cardíaca meio de indução, adicionar 0,5 ml de solução de estoque BMP4 (concentração final = 0,5 ng / ml) e Y-27632 Inibidor ROCHA (concentração final = 10 pM). Remover o tubo cónico contendo os hPSCs da incubadora e centrifuGE do tubo a 200 xg durante 5 min. Aspirar o meio de lavagem e ressuspender as células em meio de agregação a uma densidade de 1,2 x 10 6 culas por ml. Aspirar a solução de lavagem PBS, a partir de cada cavidade da placa de microcavidades. Usando uma micropipeta P1000, distribuir uniformemente e de sementes de 1 ml da suspensão de células para cada poço na placa de microcavidades. Às sementes de um grande número de poços, vortex periodicamente a suspensão de células para evitar a sedimentação. Centrifugar a placa a 200 xg durante 5 min. Observar a placa com o microscópio para confirmar as células têm girado para a parte inferior de cada micropoço. Incubar a placa durante 24 horas a 37 ° C em 5% de CO 2, 5% O 2 (hipoxia) incubadora. 4. Cardiac Indução Fase 1 Um dia após a agregação (dia 1), preparar o volume necessário de uma fase meio de indução (para uma placa de 24 poços, 1 mL de volume = X número de poços). Para 1 ml de completameio de indução cardíaca, adicionar 1 ml de BMP4 solução de stock (concentração final = 10 ng / ml), 0,5 ml de solução de estoque de bFGF (concentração final = 5 ng / ml) e 0,6 ul de Activina A (concentração final = 6 ng / ml). Coloque a forma de um banho de água a 37 ° C durante pelo menos 15 min. Remova a placa de micropoços da incubadora. Inspecione os agregados sob o microscópio. Comparado a imediatamente agregação pós-centrífuga, eles devem aparecer intacta, com bordas lisas (mais redonda e menos quadrado do que no dia anterior). Remover o sobrenadante sem perturbar os agregados dentro dos micropoços: Segure a microplaca horizontalmente nível (ie., Não incliná-lo). Para cada poço na placa de micropoços, coloque a ponta de uma micropipeta P1000 na superfície do meio de cultura e contra o bordo do poço. remover lentamente o meio, tendo cuidado para não perturbar os agregados na parte inferior dos micropoços. Depois de reduzir tele nível médio de cerca de 1 a 2 mm a partir da superfície de micropoços texturizados, lentamente inclinar a placa para recolher médio de um dos lados do poço (uma vez que o volume é suficientemente baixa, o movimento de fluido é muito reduzida, e é mais fácil de evitar agregados ficando levantada fora de suas micropoços individuais). Lentamente, pipetar o meio remanescente no poço. Para adicionar fresco Fase 1 Indução Médio, assegurando simultaneamente os agregados permanecem em seus micropoços individuais: Draw 1 ml de meio de indução de Fase 1 com uma micropipeta P1000. Segurar a ponta da pipeta contra o bordo interior do poço e muito lentamente dispensar o meio contra a parede interior do poço. Repita o procedimento para os restantes poços. Retornar a placa à incubadora sob condições hipóxicas durante 3 dias. 5. Indução Fase 2 Cardíaca No dia 4, local de meio de lavagem (volume = número de poços x 2 ml) num banho de água a 37 ° C durante um mínimo de 15 min. Prepara-se o volume necessário de Fase 2 Indução médio (volume = número de poços x 1 ml): por ml de completa cardíaca meio de indução, adicionar 2 ml de solução de estoque de VEGF (concentração final = 10 ng / ml) e 0,5 ul IWP-2 solução de estoque (concentração final = 5 uM). Colocar o meio de indução preparado Fase 2 em um banho de água a 37 ° C durante um mínimo de 15 min. Usando uma pipeta de 5 ml serológico, colher os agregados a partir de cada cavidade da placa de microcavidades e recolher a suspensão agregada em um tubo de 15 ml (recolher até 10 poços por 15 tubo ml). Permitir que os agregados que se contentar com 15 min em uma incubadora hipóxico. NOTA: Este passo é importante para separar as células individuais e os restos celulares dos agregados intactos. Aspirar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente os agregados em 10 ml da pré-aquecido meio de lavagem para remover citocinas indutivos residuais (por exemplo, Activina A é uma molécula de sinalização potente, mesmo a muito baixas emissões de COncentrations). Centrifugar os agregados a 50 g durante 2 min. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender o pellet em agregados pré-aquecido por indução 2 Médio. Transferir a suspensão agregada a uma placa de 24 poços de ultra-baixo de fixação (ULA) a 1 ml por poço. Observar os agregados sob o microscópio como uniforme, aglomerados de células apertados. Incubar em condições de hipóxia até o dia 6. 6. Indução cardíaca Fase 3 No dia 6, preparar o volume necessário da fase 3 Indução médio (volume = número de poços x 1 mL). Para uma completa ml de Cardiologia meio de indução, adiciona-se 2 ul de solução de estoque de VEGF (concentração final = 10 ng / mL), e 0,5 ml de solução de estoque de bFGF (concentração final = 5 ng / ml). Coloque meio de indução preparado Fase 3 num banho de água a 37 ° C durante um mínimo de 15 min. Usar uma pipeta de 5 ml serológico para transferir os agregados para tubos de 15 mL cónico, reunindo-se a 10 ml de agregados por tubo. Permitir 10 min para os agregados para resolver. Aspirar o sobrenadante e ressuspender os agregados no pré-aquecido Fase 3 Indução Médio. Usando uma pipeta de 5 ml serológico, redistribuir os agregados em uma placa de 24 poços ULA a 1 ml por poço. No dia 10, preparar o volume necessário da fase 3 Indução médio (volume = número de poços x 1 ml) como por Etapa 6.1. Use uma pipeta de 5 ml sorológico para transferir os agregados a 15 ml tubos cônicos, reunindo-se a 10 ml de agregados por tubo. Permitir 10 min para os agregados para resolver. Aspirar o sobrenadante e ressuspender os agregados na Fase 3 Indução Médio. Usando uma pipeta de 5 ml serológico, redistribuir os agregados em uma placa de 24 poços ULA a 1 ml por poço. Incubar sob condições hipóxicas durante dois dias. No dia 12, começam incubação das células em níveis de oxigénio normóxicas para o restante do período de cultura (37 ° C, 20% de O2, 5% de CO 2). NOTA:Depois deste ponto de tempo, as células não são cultivadas sob condições hipóxicas. Repetir esta troca de meio completo (Passos 6,2 e 6,3) a cada 4 dias, começando 14 dias até à colheita de células (tipicamente, as concentrações máximas de cardiomiócitos são observadas após 14 dias de diferenciação). 7. Fluxo de Análise de Citometria de troponina cardíaca T (cTnT) Expression Frequência de Cultura Micropoço Output Dissociar os agregados como se segue: Use uma pipeta de 5 ml sorológico para transferir um bem de agregados a um tubo de 15 ml. Centrifugar os agregados a 50 xg durante 2 min e o sobrenadante cuidadosamente aspirado. Adicionar 1 ml de solução a 1 mg / mL de colagenase tipo II dissolvido de fresco para os agregados. Transferir a suspensão agregada a um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incubar os agregados de colagenase tipo II durante a noite à temperatura ambiente. No dia seguinte, usar uma micropipeta P1000 dissociar delicadamente os agregadosnuma suspensão de células única homogénea. Se os agregados não são facilmente dissociar, resolver os agregados, aspirar o sobrenadante e incubar os agregados em 700 ul de enzima de dissociação para 1 a 2 min à temperatura ambiente. Pipeta suavemente os agregados de 1 a 2 vezes com uma micropipeta para dissociar P1000. Diluir a enzima de dissociação: Adicionar 700 ul de meio de lavagem contendo 14 ul de 1 mg solução estoque / ml DNAse. Tomar 10 ul a executar uma contagem de células, e centrifugar a suspensão restante usando uma microcentrifugadora de bancada a 300 xg durante 2 min. Executar uma contagem de células: mancha a amostra 10 ul de contagem com um volume igual de azul de tripano e contagem usando um hemocitómetro. Remover o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo as células restantes do microcentrífuga. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células, a uma concentração de 200.000 a 500.000 células por 100 ul, em Hanks Balanced Salt Solution contendo2% de Soro Fetal Bovino (HF). Para cada condição, transferir 100 ul de suspensão de células por poço para 2 poços de uma placa de 96 poços (uma bem serão coradas com o anticorpo TnT e o outro será o controlo de anticorpo secundário). Centrifugar a placa a 300 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante com uma micropipeta multicanal. Fixar as células: Adicionar 200 ul de solução de fixação (componente do kit) por poço e incubar a placa durante 15 minutos à TA. Centrifugar a placa a 300 xg durante 2 min. Use uma micropipeta multicanal para retirar cuidadosamente o sobrenadante dos poços. Elimine o sobrenadante em um recipiente de resíduos paraformaldeído. Lavar as células duas vezes fixos: Adicionar 200 ul de HF para cada poço. Centrifugar a placa a 300 xg durante 2 min. Aspirar o sobrenadante, e repita o passo de lavagem mais uma vez. As células fixadas pode ser armazenado durante até uma semana, em HF a 4 ° C. Permeabilizar as células: Centrifugar a placa a 300xg durante 2 min. Adicionar 100 ul de solução de permeabilização (componente do kit) a cada poço e incubar a placa à temperatura ambiente durante 5 min. Centrifugar a placa a 300 xg durante 2 min e o sobrenadante aspirado. Prepara-se uma mistura principal de anti-TnT em HF na concentração óptima para um dado número de lote (A diluição óptima deve ser determinada por titulação e varia tipicamente de 1: 500 a 1: 2000). Para cada condição (2 poços por condição), adicione 100 ml de mistura principal para um poço (amostra corada) e 100 ml de HF simples para o outro bem (controle de anticorpo secundário). Incubar as células a 4 ° C durante 30 min. Centrifugar as células a 300 xg durante 2 min. Aspirar o sobrenadante e adicionar 200 mL de HF por poço. Repita este passo de lavagem mais uma vez. Preparar um master mix do anticorpo secundário. Transferir um volume de HF que corresponde a 100 uL de cada poço (de controlo e anticorpo secundário-TnT manchado) a ser tratado. Adicionar 1 mL de anticorpo secundário de cabra anti-ratinho-APC por 200 ul de HF (diluição 1: 200). Corar as amostras. Adicionar 100 ul de solução de coloração a cada poço (tanto o controlo de anticorpo secundário anti-poços e TnT-corados). Incubar as células no escuro a 4 ° C durante 30 min (manter a placa coberta ou no escuro após a adição de anticorpo secundário fluorescente para evitar a fotodegradação). Centrifugar as células a 300 xg durante 2 min. Aspirar o sobrenadante e adicionar 200 mL de HF por poço. Repita este passo de lavagem mais uma vez. Transferir as amostras de 5 ml de fundo redondo de fluxo citómetro tubos de análise e realizar citometria de fluxo para o sinal no canal de APC usando os protocolos padrão para o instrumento 19.