RNA及びDNA抽出の両方のためのホルマリン固定パラフィン包埋組織コアの調製

このプロトコルは、組織切片用に設計された市販の抽出システムの変形例を用いて、組織コアからDNAとRNAを回収するための最適化された方法を表します。最適化は、組織均質化の導入、DNA抽出のためのより強力なプロテイナーゼKの使用、および組織消化時間の延長が含まれます。グラフと統計分析は、2ウェイANOVA、線形回帰と相関が含まれていました。 プロテイナーゼ消化の最適化市販のキットは、より高いDNA収量（ 図2A）、その結果、より強力なプロテイナーゼKで置換し、室温安定したプロテイナーゼK溶液が含まれていました。さらに、DNAの収量を増加させるために、消化は2から24時間に延長しました。有意差は、2つの時点の間で見られなかったが、24時間の消化は、SA間でより一貫性のある収量を提供するように見えmples。しかし、さらなるインキュベーションの48時間は、さらにDNA回収改善しなかった（ 図2Bを; P = 0.74）。 FFPE前立腺癌組織サンプルからの典型的なDNAの回復最適化されたプロトコルを使用して、RNAとDNAは3からサンプル時代の14年に及ぶ333前立腺癌FFPETサンプルから同時抽出しました。各サンプルから、3つの組織コア（0.95±0.13 mm 3での平均全組織量）を入力として使用しました。濃度を推定し、核酸分子のサイズ分布の評価を提供することができ、他のマイクロ流体ベースのゲル電気泳動の方法がありますが、そのような方法は、flourometricallyベースアッセイを行う再現性の核酸の定量化を提供していませんし、RNAとDNAとを区別することはできません。 22そして、マイクロ流体ベースのゲル電気泳動の結果は、断片化のために信頼性がないため、FFPET由来の核酸は、23核酸収量は（詳細については、試薬リストを参照してください）蛍光定量的に測定しました。平均利回りは、RNAとDNA（ 図3A）の820 ngのの2270 ngのでした。本研究で分析した全てのFFPETサンプルの約90％は、RNAのDNAと≥500 ngのの≥100NGを得ました。興味深いことに、FFPETサンプルと核酸回収（ 図3B）の年齢との間に有意な相関は認められませんでした。 （R 2 = 0.39; P <0.0001）全体的に、RNAとDNA収量はサンプル全体に相関したDNAより二倍よりもはるかにRNAは、各サンプル（ 図3C）から回収したものの、。 パイロットと最適化作業が前立腺組織で実施したように、次のステップは、アーカイブ組織のいくつかの追加のタイプのこのプロトコルのパフォーマンスを調査することでした。であることを表す外科的に除去し、剖検FFPETサンプルで始まりますnign肝臓（1ケースから1サンプル）は、脳の癌（8 1ケースからのサンプル）、膀胱（2例から2サンプル）、および乳癌（3例から3サンプル）、プロトコルは、DNAの> 100 ngのをもたらしましたサンプルの90％からのRNA（ 図3D）。核酸の収量は、手術組織におけるよりも剖検組織で低かったが、代表的な結果は、プロトコルが異なるサイトから誘導された癌全体で同様の収率をもたらすことを示しています。 RNAとDNA完全性の評価とダウンストリーム解析におけるその代表的パフォーマンス （陽性対照として）8選択FFPET前立腺癌試料と新鮮PC-3前立腺癌細胞株試料47の遺伝子のRNA発現分析はFFPETのために最適化された商業多検体の遺伝子発現プラットフォームを用いて行きました。 PC3におけるmRNAカウントはFFPET SAからのものよりも一般的に高かったですmples（ 図4A）。しかし、すべての遺伝子の相対的発現を比較する、FFPET前立腺癌試料は、RNAの両方の供給源は、RNA発現プロファイリングに適していることを示し、PC-3 RNAに類似の発現プロファイルを示しました。 このプロトコルで抽出したゲノムDNAの性能を実証するために、FFPETサンプルから重亜硫酸塩変換DNAの抽出物は、メチル化特異的PCR（MSP）により増幅した。ALU反復エレメントの24 MSP分析ヒトゲノム中の何百万ものコピーで存在、高度にメチル化された領域、 図25は、ゲノムのメチル化コントロールとして使用し、そしてサンプル間の最小の変動を示すことが予想されました。図4Bに示すように、ALU MSPのメチル化レベルの異なるサンプル間で見られない変化がほとんどなかったです。また、GSTP1、前立腺癌ではないが、良性サンプルにおいて過剰メチル化されることが知られている遺伝子、26に基づいて、MSPアッセイは、検出可能なamplifを示しませんでした良性試料からのDNAでications。予想されるように、低い定量PCRサイクル閾値は、メチル化GSTP1コピーの濃縮を示す、癌組織からのDNAにおいて検出されました。このプロトコルにより回収した核酸の有用性はさらに、良性肝臓からおよび脳（死後）から二外科的に除去乳癌試料から回収された核酸を使用して、典型的な下流アッセイで試験しました。 、両方のRT-qPCRに基づく発現およびMSPアッセイは、乳癌および肝臓FFPETでうまく行ったが、RT-PCRアッセイは、RNAが分解していたことを示唆し、死後脳の腫瘍サンプル（ 図4C）から、高度に発現されたmRNAを増幅するために失敗しました。遅延組織固定する可能性が高いです。 図1：FFPET サンプルのための抽出手順の概要図Aに関心のどの領域を示しています。組織ブロックは、顕微鏡スライドから組織病理学的選択に基づいてマッピングされています。三つの0.6ミリメートルの組織コアは、その後、一緒に均質化した後、RNAとDNAの両方の抽出を行い、生検パンチを使用して、各組織領域から得られる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 。 図2：2 プロテイナーゼK（温度安定性と高い効力酵素）、後者のためのインキュベーション時間の範囲にわたってテスト済み （A）プロテイナーゼKのパフォーマンスから ngの中の核酸（DNAとRNA）収量/ FFPETの ミリメートル 3異なるサプライヤーから。 DNA抽出は、kに供給される温度安定性酵素を用いて代表的なFFPETサンプルについて実施しましたそれ別のメーカーから、より強力な酵素対。 （B）DNAの収量を最大化するために最適なプロテイナーゼKのインキュベーション時間を決定します。高濃度のプロテイナーゼK消化の性能は、3 FFPETサンプルを使用して、3つの異なるインキュベーション時間で評価しました。エラーバーは平均の標準誤差（SEM）を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図3： サンプル年代表的な組織タイプにわたって合計FFPETの NG / mmの 3 中の核酸（DNAおよびRNA）収量 、（A）の合計は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から核酸を回収しました。提示された核酸の量は333 FFPETサンプルの抽​​出に基づいているのu最適化されたプロトコルを歌います。回収された全DNAとRNAとFFPETサンプルの年齢との間に（B）の相関プロット。使用される抽出FFPETサンプルは333の前立腺サンプルから同時に抽出されたDNA及びRNAの収量との間に2012年（C）の相関に2000年から得ました。 DNAとRNA収量との間に正の相関があります。追加のアーカイブ組織タイプを使用してプロトコルの（D）デモンストレーション。最適化されたプロトコルは、14の癌（乳癌、膀胱および脳）および正常（肝臓）試料から核酸を抽出するために使用されました。エラーバーはSEMを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図4：RNA とDNAのパフォーマンスTISSUから共同抽出ダウンストリームアプリケーションでの電子のコア。（A）mRNAはFFPE前立腺癌組織のために、新鮮なPC-3細胞ライン制御のためにカウントされます。各点は個別に抽出された3技術的反復の平均を表します。新鮮なPC-3細胞株のRNA値は、黄色のバーで示されており、FFPET組織値は着色ドットで表現されます。 （B）FFPET前立腺癌試料のDNAのメチル化特異的PCRアッセイ。サイクル閾値は、50 ngの/重亜硫酸塩変換DNAの反応を用いて、予想されるように行わ10サンプルについて得られました。すべてFFPETサンプルからのALU MSPアッセイは、同様のサイクル閾値（P> 0.67）でした。 GSTP1のMSPアッセイは、良性前立腺よりも前立腺癌において高いメチル化（低いサイクル閾値）レベルを示しました。 （C）追加の組織型からのDNAとRNAの品質の評価。 HPRT1遺伝子発現とのAlu遺伝子メチル化アッセイは、から抽出された核酸（それぞれRNA及びDNA）で行ったもMAL肝臓（剖検）、および脳（剖検）および乳癌（すべてFFPET）。前立腺からの結果を比較のために示されています。注：同様の結果は、1つの剖検標本から失敗したmRNA増幅を除いて、各組織型から観察されました。各点またはバーはサンプルを表し、エラーバーはSEMを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 組織コアティッシュ入力（立方ミリメートル） 抽出された核酸検証品質チェック：DNA 品質チェック：RNA （サンプルの＃） サンプルの年齢（歳） 総収量（NG） フラグメントサイズ（bp）の PCR 総収量（NG） フラグメントサイズ（bp）の PCR NanoString Pikor ら。 43から129 DNA データなしデータなしデータなしデータなし Montaser-Kouhsari ら。 18から29.5 RNA 763 0-25 843 データなしこの紙 1.71 DNAおよびRNA > 350 3月12日 820 100から500 2270 100-500 /ftp_upload/54299/check_mark.jpg "/> 組織切片ティッシュ入力抽出された核酸検証品質チェック：DNA 品質チェック：RNA （サンプルの＃） サンプルの年齢（歳） 総収量（NG） フラグメントサイズ（bp）の PCR 総収量（NG） フラグメントサイズ（bp）の PCR NanoString ヘイカルら。 5×5ミクロン DNA 12 7月22日 88から300 103から351 チャンら。 1×20ええと RNA 9 > 5 16,000- 23000 100-200 アンティカら。 2×4ミクロン RNA 18 データなし不明（621 NG /μL） 80から202 + Ghatak ら。 5×5ミクロン DNAおよびRNA 5 1 14 256 <1030 16 000 109から400 + ヘニヒら。 1×10ミクロン DNAおよびRNA 210 1月25日データなしデータなしデータなしデータなしレーザーキャプチャーマイクロダイセクションティッシュ入力（MM2） 抽出された核酸検証品質チェック：DNA 品質チェック：RNA （サンプルの＃） サンプルの年齢（歳） 総収量（NG） フラグメントサイズ（bp）の PCR 総収量（NG） フラグメントサイズ（bp）の PCR NanoString </tR> 雪ら。 1-2 DNA 110 0-2 430 データなし 表1： 組織コアセクションおよびレーザーキャプチャーmicrodissectionsの公表DNA及びRNA抽出プロトコールの比較も含まれるPCRとNanostringアッセイを使用して、これらの方法のいくつかの分子のエンドポイントの評価です。