使用モデルタンパク質への非標準アミノ酸の残基特異的取り込み<em>エシェリヒア・コリ</em>無細胞転写翻訳システム

注意！使用する前に、関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。使用される化学物質のいくつかは急性毒性があります。個人用保護が要求される機器だけでなく、ドラフト内で作業（アイシールド、防塵マスク、手袋、白衣、完全長ズボンは、靴のつま先を閉じました）。 1.アミノ酸溶液の調製 NCAAのストック溶液調製（168ミリモル） 注：NCAAのストック溶液の調製は、例として、アルギニンアナログ缶に記載されています。したがって、他のncAAsの値を適応させます。 天秤の上に1.5ミリリットルの反応管を配置します。 168 mMの溶液1mlを調製するための反応管の内側缶の46.1ミリグラムを秤量します。滅菌ミクロを使用してください。 NCAAのラセミ混合物のために、ストック溶液の濃度を倍増。 無菌のddH 2 Oの977μLを加えます徹底的に渦缶iがあるまでnは完全に溶解しました。 注：1ミリリットルの総溶液容量に関しては、溶解したアミノ酸の物理ボリュームが補償されなければなりません。アミノ酸のいずれかの場合は、マイクロリットルの対応する体積増加などmgの中の固体の質量の推定半分35（100 mgの固体は、溶液中の50μlの容量がかかります）。ほとんどのアミノ酸は、この濃度で溶解させることができます。ない場合は、完全に溶解するまで濃度を低下させます。 直接液体窒素中でそれを凍結し、-20℃で保存し、1.2節またはフラッシュ中のアミノ酸溶液の調製のためのNCAAの原液を使用しています。 注意！安全のため、液体から保護するアイシールドとクライオ手袋を着用窒素飛沫。 アミノ酸溶液の調製 注：アミノ酸溶液の調製は、別々の在庫20 CAASのL異性体を提供するアミノ酸サンプラーを使用するためL-ロイシン（140 mM）のを除き、168 mMの濃度で、各（HEPES / KOH、<0.1％のNaN 3、pH7.5で緩衝さ1.5ミリリットル、）ソリューション、。これらのストック溶液（KOHで緩衝）の自家製の調製のために、このプロトコル35に従ってください。 20 CAAS（アミノ酸サンプラーまたは35に従って調製）の、RTでNCAA（セクション1.1で調製した）のストック溶液を解凍します。 解凍後、頻繁に任意の沈殿したアミノ酸を再溶解するためにストック溶液をボルテックス。いくつかのアミノ酸は溶解が困難であるため、完全に溶解するまで37℃の加熱ブロックでそれらをインキュベートします。 Cysが完全に溶解しない場合があります。沈殿を避けるために、室温でこれらを維持 – のAsn、PheおよびCysから除いて、氷の上のすべてのアミノ酸を置きます。 完全なキットの7分の1を使用するには、次の値を使用します。 注：小さいボリュームで動作するようにし、さらなる実験のためのキットのパーツを保存するために適切にスケール・ダウン。 incorporatのためにスケールアップ大規模モデルタンパク質へのncAAsのイオン。アミノ酸の安定性が低下する可能性があり、頻繁融解を防止するために、200μLのボリュームに個々のアミノ酸ストック溶液をアリコート。この200μlのアリコート量やピペッティングによる損失について、ステップ1.2.4.1アカウントで使用されるアリコートボリューム。 まず、3異なる構成アミノ酸溶液（ – 1.2.7セクション1.2.5）の製造を完成させるためにステップ1.2.4.3に分割されたアミノ酸マスターミックス溶液を調製。これらの解決策では、レイ（5ミリモル）を除いて、6 mmにすべてのアミノ酸を濃縮します。 15ミリリットルの遠心分離管に無菌のddH 2 Oの1.4ミリリットルを転送します。氷の上に置きます。各アミノ酸原液175μlのを追加します。 NCAA（ 例えば、缶）によって置換されるCAA（ 例えば 、アルギニン） の原液を除いて 、次々に追加します。徹底的に各添加後ボルテックスし、氷上に戻って解決策を置きます。 注意：レイは、他のアミノ酸のための6mMのに比べ、3異なる合成アミノ酸溶液が5mmです。減少した濃度は、発現効率を低下させません。 6 mmまでスケールアップすることは同様に適切です。 アラ、アルギニン、アスパラギン、Aspで、Glnの、グルタミン酸、グリシン、彼の、イル、リス、メット、Pheで、プロ、のSer、Thrで、ヴァル、のTrp、Tyrで、：沈殿を回避するには、次の順序で、アミノ酸ストック溶液を移しロイシン、およびCys。 NCAA（ 例えば 、缶）に類似しているCAA（ 例えば 、アルギニン）のストック溶液を追加しないようにしてください。最後に、徹底的にボルテックス。可能な限り解決策をクリアにするために、37℃でインキュベートします。 1.35ミリリットルの3つの等しいボリュームにこのアミノ酸マスターミックスのソリューションを分割します。 1.5ミリリットルの反応管に分割された各ボリュームを転送します。氷の上に保管しておいてください。 5 mMでのLeuを除いて、6 mMの各濃度で全20 CAASで構成アミノ酸溶液を準備します。最初のボリュームOにFステップ1.2.4.3での分割の結果、1.35ミリリットルを、NCAA（ 例えば 、缶）に類似しているCAA（ 例えば 、アルギニン）の168 mMのストック溶液50μlを追加します。徹底的に渦。 氷上に戻って置きます。反応チューブに16μlの体積の中で、この1.4ミリリットルソリューションを等分。この溶液量は約85アリコートにつながることに注意してください。これらのアリコート「+ CAA」（ 例えば、+アルギニン）をラベルを付けます。 フラッシュ-80℃で液体窒素とストア内のアリコートを凍結する。 注意！安全のために、液体窒素の飛沫から保護するアイシールドとクライオ手袋を着用してください。 NCAA（ 例えば 、缶）に類似しているCAA（ 例えば 、アルギニン）を除く19 CAASで構成されているアミノ酸溶液を準備します。レイ（5ミリモル）を除いて、6 mMの濃度に各アミノ酸を加えます。 分割の結果として、1.35ミリリットルの第二のボリュームに無菌のddH 2 O50μlのを追加します。ステップ1.2.4.3インチ徹底的にボルテックスし、氷上に戻しました。反応チューブに16μlの体積の中で、この1.4ミリリットルソリューションを等分。この溶液量は約85アリコートにつながることに注意してください。 「 – CAA」（ 例えば、 – Argの）これらのアリコートにラベルを付けます。 フラッシュ-80℃で液体窒素とストア内のアリコートを凍結する。 注意！安全のため、窒素飛沫から保護するアイシールドとクライオ手袋を着用してください。 標準的な1（ 例えば 、アルギニン）を代入19 CAASとNCAA（ 例えば、缶）が含まれているアミノ酸混合物を準備します。レイ（5ミリモル）を除いて、6 mMの濃度に各アミノ酸を加えます。最後の1.35ミリリットルのボリュームに、ステップ1.2.4.3での分割の結果として、（ 例えば 、缶）NCAAの168 mMストック溶液50μlを追加します。 「+ NCAA」（ 例えば 、+缶）それにラベルを付けます。徹底的にボルテックスし、氷上に戻しました。 16＆＃の容積のアリコートこの1.4ミリリットルソリューション181;リットル反応チューブに。この溶液量は約85アリコートにつながることに注意してください。これらのアリコート「+ NCAA」（ 例えば、+缶）をラベルを付けます。 フラッシュ-80℃で液体窒素とストア内のアリコートを凍結する。 注意！安全のため、窒素飛沫から保護するアイシールドとクライオ手袋を着用してください。 注：手順1.2.5.1、1.2.6.1と1.2.7.1で使用16μlのアリコートのボリュームはピペッティングによる損失を考慮するために必要とされるよりもわずかに高いです。 2.エネルギーバッファの準備注：粗抽出物の各バッチは一意であり、MG-とK-グルタミン酸34の最適化された濃度を必要とします。粗抽出物のアリコートの容積は、タンパク質濃度34に依存します。異なる値のために提供計算テンプレート（補足資料1）を使用します。補足資料1図の凡例、explaのさらなる指示を探しますこのテンプレートを用いる方法をining。 変更されていないプロトコル34に従って、14倍のエネルギーソリューションと粗抽出物のアリコートを調製し、-80℃で保存。最適化された発現効率34 MG-とK-グルタミン酸濃度に応じて粗抽出物を調整します。 注：14Xエネルギーソリューションの最終組成は、700mMのHEPES（pHが8）、21 mMのATP、21 mMのGTP、12.6 mMのCTP、12.6 mMのUTP、2.8 mg / mlでのtRNA、3.64 mMのCoAを、4.62 mMのNAD、10.5 mMのcAMPを、0.95 mMのフォリン酸、14 mMのスペルミジン、420 ​​mMの3-PGA。 氷上で解凍を100mMのMg-グルタミン酸原液、3 M K-グルタミン酸原液、14倍のエネルギーソリューションと40％PEG-8000は、マスターミックスを調製しました。氷の上に保管しておいてください。 100 mMのMgをグルタミン酸原液の9.18μlの、反応管内の3 M K-グルタミン酸原液、14倍のエネルギーソリューションの21.86μlを、40％PEG-8000の15.3μlを1.6μlの滅菌のddH 2 Oの3.06μLを混合します。徹底的にこのマストをボルテックスえー、各添加後に混合し、氷上で保管してください。 反応チューブに16μlの（3アリコート）のボリュームにマスターミックス（51μl）を等分。頻繁に分注時にマスターミックスをボルテックス。 Flashは液体窒素でアリコートを凍結します。 注：16μlのアリコートのボリュームだけでなく、マスターミックスボリュームがピペッティングによる損失を考慮するために必要なよりもわずかに高いです。 エネルギーバッファチューブを収集するためにストレーナを使用します。 C。 注意 -80℃でチューブを保管してください！窒素飛沫から保護するアイシールドとクライオ手袋を着用してください。 ncAAsの残基特異的組み込みのための無細胞反応の調製と実行まず、のddH 2 O中にDNAベクター溶液を調製非常に効率的なタンパク質発現のために、発現ベクターpBEST-OR2-OR1-PR-UTR1-deGFP-T500 32を使用します 。遺伝子のクローンを作成し、このベクトル36,37へのモデルタンパク質をコードします</ SUP>。 注：別の方法として、同様にσ70によって認識されている他のプロモーターを使用していますが、発現効率が低下することができることに注意してください。 37,38 E.のベクトルを変換します大腸菌株KL 740 32（エールCGCS番号：4382）は、増幅ベクターDNA 37,39を精製し、DNA溶液40から42の濃度を定量化します。 -20℃でDNA溶液を保存したり、直接細胞手数料反応の準備のためにそれを使用する（3.4.1、3.4.2および3.4​​.3ステップ）。 変更されていないプロトコル34に従って使用ベクター構築物の濃度に応じて無細胞発現効率を調整します。無細胞反応の準備のための最高タンパク質収量（3.4.1、3.4.2および3.4​​.3ステップ）につながる最適濃度を使用してください。 注：無細胞反応の製剤は、無細胞に10nMの最終ベクター濃度をもたらす90 nMのベクターDNAストック溶液を使用して例示されています反応及びMG-とK-グルタミン酸の上記最適値と同様に抽出分量のボリュームに従います。異なる値の計算テンプレートを使用してください。 ラベルされた氷3粗抽出物のアリコートに解凍（未修正のプロトコル34に従って調製）30μlの体積のそれぞれについて、1アミノ酸溶液のアリコートラベルされた「+ CAA」（ 例えば 、+アルギニン）、1アミノ酸溶液のアリコート" – CAA」（ 例えば 、 、 -のArg）および1「+ NCAA」（ 例えば 、+缶）（セクション1.2.5で調製した標識アミノ酸溶液のアリコート-セクション2で調製）1.2.7、3エネルギーバッファのアリコート（）およびベクターDNA溶液（セクション3.1で調製しました）。 注：粗抽出物は、わずかに粘性であり、それは気泡を含有してもよいです。 4℃で30秒間万×gで遠心分離して気泡を除去。氷の上で粗抽出物のアリコートを元に戻します。 粗抽出物（33.33パーセント）、エネルギーを混合することにより、3異なる合成無細胞反応（各90μlの最終容量）を準備緩衝液（16.67％）、3異なる構成アミノ酸溶液のアリコート（16.67％）とベクターDNA溶液1。任意に、さらなる生体分子（DNA、タンパク質のtRNA など ）を追加したが、適宜のddH 2 Oの量を減少させます未修正のモデルタンパク質を発現しているリファレンス無細胞反応（90μl）を準備します。 2 O原油の30μlにエネルギーバッファ15μlの、「+ CAA」（ 例えば 、+アルギニン）、90 nMのベクターDNA溶液10μlおよび滅菌のddH20μlの標識されたアミノ酸溶液のアリコート15μlのを追加します。エキス。各成分の添加後にダウンして静かに渦をピペッティングにより混和します。 6μlに15等量の無細胞反応の90μLを分注し。別々の反応管に15の各ボリュームを転送します。チューブを閉じて、氷の上に戻します。 「CFR（+ CAA）」（ 例えば 、CFR（+アルギニン））のように、すべての反応チューブにラベルを付けます。 <li> CAA（ 例えば、アルギニン）も非標準アナログのいずれも陰性対照無細胞反応（90μl）を、準備し（ 例えば、することができます）追加されます。 エネルギーバッファ15μlのは、標識されたアミノ酸溶液のアリコート15μlのを追加」 – CAA」（ 例えば、 -のArg）、原油の30μlの〜90 nMのベクターDNA溶液および無菌のddH 2 O20μlの10μlのエキス。各成分の添加後にダウンして静かに渦をピペッティングにより混和します。 6μlに15等量の無細胞反応の90μLを分注し。別々の反応管に15の各ボリュームを転送します。チューブを閉じて、氷の上に戻します。 「CFR（-cAA）」（ 例えば、CFR（-Arg））のように、すべての反応チューブにラベルを付けます。 残基特異的に発現するモデルタンパク質にNCAA（ 例えば、缶）を組み込むものとする無細胞反応（90μl）を準備します。 15を追加します。エネルギーバッファ、「+ NCAA」（ 例えば、+缶）標識されたアミノ酸溶液のアリコート15μlの、90 nMのDNA溶液と粗抽出物30μlのに無菌のddH 2 O20μlの10μlのμlの。各成分の添加後にダウンして静かに渦をピペッティングにより混和します。 注：発現効率は、標準的なアミノ酸を有する発現と比較して減少させることができます。必要であれば、単に無細胞反応容量をスケールアップ。 6μlに15等量の無細胞反応の90μLを分注し。別々の反応管に15の各ボリュームを転送します。チューブを閉じて、氷の上に戻します。増加反応ボリュームの場合、それに応じて6μlにさらにボリュームに分注し。 「CFR（+ NCAA）」（ 例えば、CFR（+缶））のように、すべての反応チューブにラベルを付けます。 29°CO / Nですべてのチューブをインキュベートします。 注：のみの小さな反応体積は、十分な酸素の差分を有効にします高効率のタンパク質発現のために重要である反応にusion。 10μlを攪拌34を通した活性酸素を必要とするよりも、反応容積も大きいです。大ボリュームの場合、15μlのより小さなボリュームに反応を分割します。 無細胞発現の後、プールはすべて同一の6μlに分割無細胞反応を作曲しました。まず、プール「CFR（+ CAA）」と記された6μlのすべての15分割の無細胞反応（ 例えば、CFR（+アルギニン））。その後、プールラベルされた6μlのすべての15の分割無細胞反応」CFR（-cAA）」（ 例えば 、CFR（-Arg））。最後に、プールの標識6μlのすべての15の分割無細胞反応」CFR（+ NCAA）」（ 例えば、CFR（+ CAN））。増加反応ボリュームの場合、それに応じて6μlとさらにボリュームをプール。 異なる変性SDS-PAGE 43,44（セクション4.1）を行うことにより、無細胞反応を構成し、プールされたすべての3つの中でモデルタンパク質の発現レベルを確認してください。 注：このメトを使用します。取り込み実験の予備的な評価のためにD。 HPLC-ESI質量分析（セクシ​​ョン4.4）を介して適切な分析のための無細胞発現するモデルタンパク質を準備します。まず、45彼らは（セクション4.2）を浄化します。最後に、質量分析の際に高いバックグラウンドノイズを回避するために、バッファ（セクション4.3）を交換。 注：典型的な無細胞反応条件セクション3.4.1、3.4.2および3.4.3リード34：8.9 – （粗抽出物から）9.9 mg / mlでのタンパク質、4.5から10.5 mMのMgをグルタミン酸、40から160 mMのK-グルタミン酸、ロイシン、0.83 mMのロイシン、50mMのHEPES、1.5 mMのATPとGTP、0.9mMのCTPおよびUTP、0.2 mg / mlでのtRNA、0.26 mMのCoAを、0.33 mMのNAD、0.75 mMのcAMPを除く各アミノ酸の1 mMの、0.068 mMのフォリン酸、1 mMのスペルミジン、30mMの3-PGA、2％PEG-8000および10 nMのpBEST-OR2-OR1-PR-UTR1-gene_of_model_protein-T500。所望の場合、無細胞反応の調製の別の手順は、上記の反応条件をもたらすことを行うことができます。 ル"> 4。予備評価SDS-PAGE 43,44およびHPLC-ESI質量分析のための無細胞発現モデルタンパク質の調製を介しました 無細胞反応のSDS-PAGE 注：任意のさらなる精製または抽出することなく、発現タンパク質の迅速かつ予備的な分析のために変性SDS-PAGEを実行し、次の手順を実行します。 氷の上のタンパク質標準を解凍します。それはゲル上でその局在（ステップ4.1.13）のための表現モデルタンパク質に似た分子量を有するタンパク質で構成されていることを確認してください。 注：212キロダルトン、マルトース結合タンパク質βガラクトシダーゼ：158キロダルトン、βガラクトシダーゼ：116キロダルトン、ホスホリラーゼb：97キロダルトン、血清アルブミンここで、使用される標準は、広範囲の分子量（ミオシンを超えるタンパク質を提供：66 kDaの、グルタミン酸脱水素酵素：56キロダルトン、マルトース結合タンパク質：43 kDaの、チオレドキシン還元：35キロダルトン、トリオースリン酸イソメラーゼ：27キロダルトン、トリプシン阻害剤：20kDaの、LYsozyme：14 kDaの、アプロチニン：7キロダルトン、インスリンA：3キロダルトン、B鎖：2キロダルトン）。 適切なゲル移動を保証し、染色後に飽和を回避するために、SDS-PAGE前に10倍-無細胞反応は、高いタンパク質濃度にわずかに粘性であるため、無菌のddH 2 O 5それらを希釈します。あまりにも多くのサンプルを無駄にしないために、無菌のddH 2 Oの4μlの無細胞反応の1μLを希釈します反応チューブ中で希釈を準備し、徹底的にボルテックスまもなく2用のミニ遠心機で液体をスピンダウン – 2000 X gで3秒。 希釈された無細胞反応の5μlに2倍のローディングバッファー5μlを添加します。徹底的にボルテックスおよび2のためのミニ遠心機でスピンダウン – 2000 X gで3秒。 注記：ここでは、添加した後、生体分子は、62.5 mMトリス/ CLに溶解し- 、pH6.8で10％グリセロール、2％SDS、0.0025％ブロモフェノールブルー、典型的な組成物。わずかに異なる希釈共同につながる他のローディング染料を使用しましたnditionsも同様に適切であり得ます。 徹底的にタンパク質標準をボルテックスし、反応管にそれを15μlを移します。 注：ゲルサイズにし、他のタンパク質スタンダードのために応じて、推奨量は上記と異なることがあります。 加熱ブロックに反応チューブを置きます。チューブの蓋が正しく閉じているかどうかを確認してください。 5分 – 3用100°C – 95で加熱。タンパク質を変性させ、タンパク質骨格の周りにSDS-折り返しを有効にするためにこれを行います。 注：一部のタンパク質標準サプライヤーとの説明を参照してください、加熱されてはいけません。 一方、ゲル電気泳動チャンバにランニング緩衝液を移します。 1×ランニング緩衝液の含有量は、25 mMトリス、192 mMグリシン、（HClで）は、pH 8.3で0.1％SDSです。 20％勾配トリス – グリシンSDS電気泳動槽にゲル（10センチメートルのx 10センチメートル×1 mm）の – プレキャスト4を修正しました。櫛を削除し、ランニング緩衝液を負荷した注射器でウェルをすすいでください。 注：ゲル濃度のSTROngly表現モデルタンパク質の大きさや性質に依存します。上記の濃度は、Eを分離します大腸菌粗抽出タンパク質だけでなく、低分子量のモデルタンパク質。自己キャストゲルも適切です。 加熱ブロックからチューブを外します。 2000 X gで3秒 – 2のためのミニ遠心機で液体をスピンダウン。 2,000×gで3秒 – まもなく渦とは2のためにスピンダウン繰り返します。 ウェルに各サンプルの – （22μgタンパク質11）と電気泳動を開始 – （48μgタンパク質24）と10μlのタンパク質標準の15μLを移します。約90分間40 MA、典型的なプロトコル – ここでは、SDS-PAGEを125 Vと20で行われます。 慎重にカセットからゲルを取り出します。 30分間固定液（50％メタノール、10％酢酸、40％のddH 2 O）にそれを転送する。 注意！メタノール吸入による毒性および皮膚に接触しています。ヒュームフードの下で保護手袋や作業を着用してください。 染色溶液（0.025％クマシーブリリアントブルーG-250、10％酢酸、90％のddH 2 O）にゲルを移します。 60分間染色します。 120分- 60用の脱色液（10％酢酸、90％のddH 2 O）にゲルを移します。 注：固定、染色と強く脱色は、発現されたタンパク質の大きさや性質に依存します。このプロトコルは、かなり小さい分子量46のタンパク質の広い範囲に適用されます。 染色されたタンパク質バンドのための適切なコントラストを生成白地にマット透明にゲルを置き換えます。 無細胞反応からのHisタグ化45モデルタンパク質の精製 注記：タンパク質の精製のために、いくつかの方法は、それが同様の結果をもたらす存在します。このプロトコルは、C末端hisタグ（Hisタグ）を持つ無細胞発現するモデルタンパク質を精製します。これは、関数expされるタンパク質に適した精製キットを使用しています無細胞タンパク質発現の小さな反応容量でressed。それは、天然または修飾モデルタンパク質の精製のために同じです。したがって、一般に、単一の無細胞反応に基づいて説明します。 適切なHPLC-ESI質量分光分析のために、抽出し、無細胞反応からモデルタンパク質を精製し、次の手順を実行します。 彼の結合バッファーを150μlと90 – – 無細胞反応の150μlの90の等容量を混ぜます。上下ピペット、穏やかにボルテックスが続きます。 注：彼の結合緩衝液を使用することは推奨されます。しかしながら、無細胞反応媒体限りモデルタンパク質が可溶性であるように出発材料とすることができ、pHが7.5の間である – 、イミダゾール/彼の濃度は、<10 mMの8である、強力な還元剤の濃度は、<15 mMの無金属 – ですキレート剤が存在します。あなたの混合量が300μLを超えた場合、等量に分割し、アリコートを異なるRにボリュームを学位論文以下の精製工程のためのeactionチューブ。 カラムシステムを準備します。ゲル状樹脂が完全に溶解するまで十分に彼の親和性ゲルのストック溶液をボルテックス。カラムにゲル状樹脂250μlのを転送します。粘性ゲル樹脂の1ミリリットルピペットチップを使用してください。コレクションチューブにカラムを置きます。 15000 Xグラム – 13,000で10秒 – 5のための遠心分離カラム/回収チューブ。ゲル樹脂が完全に消耗していることを確認してください。ない場合は、さらに5により遠心分離時間を延長 – 10秒が、アフィニティーゲルは、過乾燥されていないことに注意を払います。したがって手順4.2.1.5、4.2.1.7と4.2.1.9での遠心分離時間を延長します。 注：それは堅くなり、何の上清が上に残っていない場合にゲル状樹脂が完全に排出されます。 カラムへの無細胞反応/彼の結合緩衝液300μlの – 150を転送します。混合量が推奨される量を超えた場合、いくつかのスピンカラムに分割。 FRによってゲル状樹脂を再懸濁equentタップし、穏やかにボルテックス少なくとも2分間のインキュベーション時間の間に。 2分 – 200μlのより大きなボリュームの場合、追加の1インキュベートします。 注：十分なインキュベーション時間は、ゲル樹脂をモデルタンパク質の結合のために重要です。 15000 Xグラム – 13,000で10秒 – 5のための遠心分離カラム/回収チューブ。フロースルーを捨て、バックコレクションチューブにカラムを配置します。 彼-の洗浄緩衝液250μLを加えます。タップし、穏やかにボルテックスすることによりゲル状の樹脂を再懸濁します。 15000 Xグラム – 13,000で10秒 – 5のための遠心分離カラム/回収チューブ。フロースルーを捨て、バックコレクションチューブにカラムを配置します。 15000のxグラム – 13,000で10秒 – 5のためにもう一度手順を繰り返し4.2.1.6および遠心分離機。 標準的な1.5ミリリットルの反応管に列を配置します。溶出バッファーを150μlを追加し、タップし、穏やかにボルテックスすることによりゲル状樹脂を懸濁します。高い精製したモデルタンパク質の詐欺のために100μlの体積を減らします次のステップ4.2.1.9での溶出後centrations。 注：溶出緩衝液の量が減少する場合、精製されたモデルタンパク質の全存在量は、原因すべてのゲル樹脂に結合したタンパク質の可能な不完全な溶出を低減することができます。 遠心カラム/反応管5のために – 13,000で10秒 – 15,000×gで溶出緩衝液中に精製されたタンパク質を希釈します。前に分割する場合、1ストック溶液に、すべてのソリューションをプール。 緩衝液交換を実行する前に、 例えば、標準的な方法を用いてタンパク質濃度を決定し、ブラッドフォード47,48をアッセイ。 注： – 50μlの適切なHPLC-ESI質量分析（セクシ​​ョン4.4）の場合、通常20の必要なボリュームで約0.5 mg / mlであり、最適なタンパク質濃度を使用します。濃度が0.2 mg / mlで未満の場合、回転真空濃縮器を用いて緩衝液交換した後、タンパク質溶液を濃縮します。この場合、最初に適切に交換するバフを適応させるためにセクション4.3.8を読んでえー。 HPLC-ESI質量分析のための緩衝液交換 注：による高濃度のイミダゾール（> 150 mM）のなどのNaH 2 PO 4（> 300 mM）のまたはのNaCl（> 50 mM）のような他の塩に質量分光分析における高いバックグラウンドノイズを避けるために、Hisタグ溶出緩衝液を交換します49。以下の緩衝液交換プロトコルがprehydratedゲルろ過スピンカラムシステムを使用しています。これは、同じ天然のまたは修飾されたモデルタンパク質のために実行されます。したがって、一般に、単一の無細胞反応に基づいて説明します。他の簡単に行うバッファー交換方法、 例えば 、ミニ透析カートリッジがあることに注意してください。 タンパク質保存緩衝液（50mMのトリス-Cl pHが8、100mMのNaCl、10％グリセロール）を100mlの準備。 605.7 mgのTris塩基、584.4 mgの塩化ナトリウムをボトルとグリセロールの10ミリリットルを追加mlのオートクレーブ滅菌100に計り分けます。約80ミリリットルに埋めるとを8にpH値を調整しますddingのNaOH。着実にpHメーターでpH値をチェックしてください。最後に、100ミリリットルマークに埋めます。 注：限り、HPLCは、従来の質量分光測定を行うように、モデルタンパク質の広い範囲を安定化させ、質量分光分析を妨害しないようにこのバッファーを使用します。しかし、発現したモデルタンパク質の性質に応じて、よりよい適したかもしれない他のバッファを使用します。あなたの標的タンパク質がpH8で安定していない場合は、それに応じてpHを調整する。 より高いグリセロール濃度を使用しないでください。 RTに少なくとも15分間、ゲルろ過スピンカラムをウォームアップ。 穏やかなタッピングまたはボルテックスによってprehydratedゲルを再懸濁し、気泡を除去。 まず、底部キャップを削除してから、離れてトップキャップを取ります。洗浄管（少なくとも2ミリリットル）に列を配置します。遠心分離機に列/洗浄チューブを転送します。各列は、方位マークを有しています。ゲル保存緩衝液を除去するために、2分間千×gで遠心分離します。ディスクフロースルーをARD。 注：この順序で進行するために注意を払ってください。列はすべて、さらに遠心分離工程で同じ方向性を持っていることを確認してください。 タンパク質貯蔵緩衝液の400μlにまで加えます。千×gで2分間遠心分離します。完全にゲルにタンパク質貯蔵バッファをロードするためにこれを繰り返します。慎重に精製されたモデルタンパク質の溶液100μlまで追加。ゲル床の中央に直接ピペットで。 注：精製タンパク質の溶液体積は、特に修飾されたタンパク質の、より高いかもしれません。いくつかのバッファ交換カラムの上に、このようなソリューションを分割します。タンパク質は、緩衝液交換のこの種の5キロダルトンより高い分子量を持っている必要があります。 千×gで2分間のコレクションチューブと遠心分離機に列を配置します。 注：このステップは、タンパク質貯蔵緩衝液中の精製されたモデルタンパク質の希釈をもたらします。前に分割する場合、1ストック溶液に、すべてのソリューションをプール。 フラッシュ凍結番目直接Eタンパク質-80℃で液体窒素とストア内の溶液またはHPLC-ESI質量分析法50（セクション4.4）を介してそれを分析。 注意！窒素飛沫から保護するアイシールドとクライオ手袋を着用してください。 慎重に溶剤51を蒸発させる回転真空濃縮器を用いてタンパク質溶液を濃縮するためのプロトコルの次の手順を実行します。 注記：タンパク質濃度は、HPLC-ESI質量分析（<0.2 mg / mlで）のためには低すぎる場合は、これらのステップが必要とされます。溶液体積とモデルタンパク質の濃度が緩衝液交換の前後でほぼ同じです。濃縮プロセスは、以下の例により説明される：Hisタグ精製後、モデルタンパク質は、彼の溶出バッファー（ステップ4.2.1.9）100μLの中に溶解し、0.07 mg / mlで（ステップ4.2.1.10）の濃度を有しています。 タンパク質濃度と液量がで蒸発させた後であることを確実にするために、少なくとも0.2 mg / mlで、20μlを、それぞれ、緩衝液交換、せいぜい五倍は、少なくとも以下の3つのステップ4.3.1で製造したが、タンパク質の蓄積バッファの前に、希釈します。同様に第三の少なくとも二つ（66.67μl）を、または最大で4第五（80μl）を以下に蒸発します。 注：タンパク質貯蔵緩衝液の希釈緩衝液交換は、このバッファ（ステップ4.3.1）の濃度値がまだ蒸発にもかかわらず、実現されることを考慮に入れるために重要である前に。 4.3.8.4 – 4.3.8.2ステップ以下を実行する前に – タンパク質貯蔵緩衝液を希釈した後、最初のバッファー交換を行う（4.3.6 4.3.2ステップ）。 緩衝液交換した後、回転真空濃縮器に開放管でのモデルタンパク質溶液の完全な100μLを入れます。 注：モデルタンパク質を希釈タンパク質貯蔵緩衝液に溶解されます。回転中の液体の損失を回避するために、回転中心に向けて傾けます。ことを確認し、同じボリュームのオープンブランクH 2 Oは、対称的に回転するシステムのバランスをとるために配置されています。 コンセントレータの蓋を閉じ、回転を開始。タンパク質の安定性を確保するために、室温でまたは30℃までの低温で濃縮しました。 注：使用コンセントレータは自動的に170 XGに加速し、真空を確立します。以下では、240×gでの最大速度まで加速します。 頻繁に液量を調査するために濃縮プロセスを中断。残りの溶液の体積は20μlの33μlの間にあるとき、濃度を停止します。 注：これにより4.3.8.1の手順を適合させる – 他のソリューションボリュームの4.3.8.4（ステップ4.2.1.9）および他のタンパク質濃度（ステップ4.2.1.10）。 Flashは-80℃で液体窒素とストア内の濃縮タンパク質溶液を凍結、または直接HPLC-ESI質量分析50を介してそれを分析します。注意！窒素飛沫から保護するアイシールドとクライオ手袋を着用してください。 モデルタンパク質のHPLC-ESI質量分析50 90％アセトニトリルおよび25以上のギ酸の0.1％ – 20％の勾配でC5逆相カラム上で（セクション4.3で調製した）15μlのタンパク質溶液（3ミクロン、100×2.1ミリメートル） – 5のHPLC分離を行います3,000のm / z – 300の範囲内の飛行時間型質量分析器の検出と分およびその後のESI質量分析。 注：発現したモデルタンパク質の性質に応じて、よりよい適したかもしれない他の溶媒または列を使用しています。 デコンボリューションは、ゼロチャージ質量を計算するために適切なソフトウェア52を使用して質量スペクトルを測定しました。