를 사용하여 모델 단백질로 비정규 아미노산의 잔류 특정 법인 설립<em> 대장균</em> 휴대없는 전사 번역 시스템

주의! 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 사용 된 화학 물질 중 일부는 급성 독성. 개인 보호 필요 장비뿐만 아니라 흄 후드에서 작업 (eyeshield, 먼지 마스크, 장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지, 신발 – 발가락을 휴관). 1. 아미노산 용액 준비 미식 축구의 재고 솔루션 준비 (168 밀리미터) 참고 : NCAA의 원액을 준비 할 수있는 예제로의 Arg 아날로그에 대해 설명한다. 따라서 다른 ncAAs 값을 적응. 마이크로 저울에 1.5 ml의 반응 관을 놓습니다. 168 mM의 용액 1 ㎖를 제조하기위한 반응 관 내부 캔 46.1 밀리그램을 단다. 멸균 microspatula을 사용합니다. 미식 축구의 라 세미 혼합물의 경우, 원액의 농도를 두배. 멸균 DDH 2 O의 977 μl를 추가 철저하게 소용돌이 할 수 있습니까 때까지n은 완전히 용해. 주 : 1 ㎖의 용액의 총 부피를 들어, 용해 된 아미노산의 물리적 체적을 보상해야한다. 아미노산 중 들어 μL의 해당 볼륨 증가함에 밀리그램의 고형분 추정 반 35 (100 mg의 고체를 용액에 50 μL의 부피를 취한다). 대부분의 아미노산이 농도에서 용해 될 수있다. 그렇지 않으면 완전히 용해 될 때까지 농도를 감소시킨다. 직접 eyeshield 및 곳을 알아내는 장갑을 착용, 안전을 위해! 액체 질소에 냉동 및 C.주의 ° -20에서 보관 섹션 1.2 플래시의 아미노산 용액의 제조에 대한 NCAA의 원액을 사용하여 액체로부터 보호되어야 질소 밝아진. 아미노산 용액의 제조 주 : 아미노산 용액의 제조는 별도의 재고 20 CAAS의 L 이성체를 제공 아미노산 샘플러를 사용하여 들어L – 류신 (140 밀리미터)를 제외하고 168 mm의 농도로, 각 (HEPES / KOH, <0.1 % NaN의 3, pH를 7.5으로 완충 1.5 ml의) 솔루션. (KOH로 버퍼링)이 재고 솔루션의 집에서 준비를 위해,이 프로토콜 35을 따르십시오. 상기 20 CAAS의 원액 해동 (아미노산 샘플러 또는 35에 따라 제조 됨)과 NCAA의 RT에 (섹션 1.1에서 제조). 해동 후, 자주있는 침전 된 아미노산을 재용하는 주식 솔루션을 소용돌이. 일부 아미노산이 녹기 어렵 같이, 완전히 용해 될 때까지 37 ℃에서 가열 블럭을 배양한다. 시스테인은 완전히 용해되지 않을 수 있습니다. 침전을 방지하기 위해 RT에서 이러한 유지 -에서 Asn,의 Phe 및 시스테인을 제외하고, 얼음에 모든 아미노산을 놓습니다. 전체 키트의 7 분의 1을 사용하여 다음 값을 사용합니다. 참고 : 작은 볼륨 작업을 추가 실험 키트의 일부를 저장 적절하게 아래로 확장 할 수 있습니다. incorporat에 대한 확장대규모 모델 단백질로 ncAAs의 이온. 아미노산의 안정성을 감소시킬 가능성이 빈번 해동을 방지하기 위해, 200 μL의 양으로 각 아미노산 모액 나누어지는. 이 200 ㎕의 분취 량과 피펫에 의한 손실 단계 1.2.4.1 계정 사용 분취 볼륨. 제 3 다르게 구성된 아미노산 용액 (- 1.2.7 섹션 1.2.5)의 제조를 완성하는 단계 1.2.4.3에서 분할 될 아미노산 마스터 혼합 용액을 제조 하였다. 이러한 솔루션에서, 레우 (5 mM)을 제외한 6 mM의 모든 아미노산을 농축시킨다. 15 ㎖의 원심 분리 관에 멸균 DDH 2 O의 전송 1.4 ml의. 얼음에 넣어. 각각의 아미노산 원액 175 μl를 추가합니다. CAA의 원액 (예를 들어,의 Arg)는 NCAA에 의해 (예를 들어, 수) 교체 할를 제외하고, 다른 후 하나를 추가합니다. 철저하게 각 추가 후에 와동과 얼음에 다시 솔루션을했습니다. 노트:레우 다른 아미노산 6 mm로 비해 3 다르게 합성 아미노산 용액에서 5 밀리미터이다. 감소 된 농도는 식의 효율성을 감소하지 않습니다. 6 밀리미터까지 확장하는 것은 물론 적합하다. 침전 방지하기 위해 다음과 같은 순서로 아미노산 재고 솔루션을 전송 : 알라,의 Arg,에서 Asn, ASP, Gln의, 글루,의 Gly, 그의, 일드,리스, 메트로,의 Phe, 프로 빼앗아,의 Thr, 발, TRP, 티르를, 레우 및 시스테인. (예 : 수) 미식 축구와 유사하다 CAA (예를 들어, ARG) 선수의 원액을 추가하지해야합니다. 마지막으로, 철저하게 소용돌이. 가능한 솔루션으로 명확하게하기 위해 37 ° C에서 품어. 1.35 ㎖의 세 가지 동일한 볼륨으로이 아미노산 마스터 믹스 솔루션을 분할합니다. 1.5 ml의 반응 관으로 분리 된 각 볼륨을 전송합니다. 얼음에 보관하십시오. 5 mm로 레우 제외한 6 mM의 각 농도의 20 개의 CAAS 구성 아미노산 용액을 제조 하였다. 첫 번째 볼륨 오에F 1.35 ㎖를, 단계 1.2.4.3에서 분할의 결과로 (예 : 수) 미식 축구와 유사하다 CAA의 168 mM의 원액 (예를 들어, ARG) 선수의 50 μl를 추가합니다. 철저하게 소용돌이. 얼음에 다시 넣습니다. 반응 튜브에 16 μL의 볼륨이 1.4 ml의 솔루션을 나누어지는. 이 솔루션의 볼륨이 약 85 분취로 연결합니다. 이 분취 "+ CAA"(예를 들어, +의 Arg)를 레이블. 플래시!에서 -80 ° C.주의 액체 질소와 저장소에 분취 량을 동결 안전 들어, eyeshield 및 극저온 장갑은 액체 질소 밝아진으로부터 보호하기 위해 착용한다. (CAN 예) 미식 축구 유사하다 CAA (예,의 Arg)를 제외한 19 CAAS 구성된 아미노산 용액을 제조 하였다. 레우 (5 mM)을 제외한 6 mm의 농도로 각 아미노산을 추가한다. 분할의 결과로서, 1.35 (M1)의 제 볼륨 멸균 DDH 2 O 50 μL를 추가단계 1.2.4.3한다. 철저하게 와동과 얼음에 다시 넣어. 반응 튜브에 16 μL의 볼륨이 1.4 ml의 솔루션을 나누어지는. 이 솔루션의 볼륨이 약 85 분취로 연결합니다. 이 분취 레이블 "- CAA를"(예를 들어, -의 Arg). 플래시!에서 -80 ° C.주의 액체 질소와 저장소에 분취 량을 동결 안전 들어, eyeshield 및 곳을 알아내는 장갑 질소 밝아진으로부터 보호하기 위해 착용한다. 19 CAAS를 포함하는 아미노산 혼합물 정식을 대입 미식 축구 (예를 들면, CAN) (예를 들어,의 Arg)를 준비한다. 레우 (5 mM)을 제외한 6 mm의 농도로 각 아미노산을 추가한다. 지난 1.35 ml의 볼륨에, 단계 1.2.4.3에서 분할의 결과로 NCAA의 168 mM의 원액의 50 μl를 (예를 들어, 수)를 추가합니다. (예를 들어, + 수)을 "+ NCAA"를 레이블. 철저하게 와동과 얼음에 다시 넣어. 16 & #의 볼륨이 1.4 ml의 솔루션을 나누어지는(181), 반응 튜브에 리터. 이 솔루션의 볼륨이 약 85 분취로 연결합니다. 이 분취 "+ NCAA"(예를 들어, + 수)를 레이블. 플래시!에서 -80 ° C.주의 액체 질소와 저장소에 분취 량을 동결 안전 들어, eyeshield 및 곳을 알아내는 장갑 질소 밝아진으로부터 보호하기 위해 착용한다. 참고 : 단계 1.2.5.1, 1.2.6.1 및 1.2.7.1에 사용 된 16 μL 나누어지는 볼륨 피펫으로 인한 손실을 설명하는 데 필요한보다 약간 더 높다. 2. 에너지 버퍼 준비 주 : 조 추출물의 각 배치는 고유하며 MG-의 농도와 K-글루타메이트 (34)를 최적화가 필요합니다. 조 추출물 분취 량은 단백질 농도 (34)에 의존한다. 다른 값에 대한 제공 계산 템플릿 (보충 자료 1)를 사용합니다. 보충 자료 1 피겨 전설, expla에서 추가 지침을 찾기이 템플릿을 사용하는 방법을 ining. 수정되지 않은 프로토콜 (34)에 따라 14 배 에너지 솔루션과 조 추출물의 분취 량을 준비하고 -80 ° C에서 저장. 최적화 된 발현 효율 (34)에 대한 MG-및 K-글루타메이트 농도에 따라 조 추출물을 보정합니다. 참고 : 14 배 에너지 솔루션의 최종 조성은 700 mM의 HEPES (pH를 8), 21 mM의 ATP, 21 mM의 GTP, 12.6 mM의 CTP, 12.6 mM의 UTP, 2.8 ㎎ / ㎖의 tRNA, 3.64 mM의 CoA를, 4.62 mM의 NAD, 10.5 mM의 캠프, 0.95 mM의 엽산, 14 MM의 스퍼 미딘, 420 mM의 3-PGA. 얼음에 녹여 100 mM의 마그네슘 – 글루타메이트 원액 3 M K 글루탐산 스톡 용액을 14 배의 에너지 용액 및 40 % PEG-8000은 마스터 믹스를 제조 하였다. 얼음에 보관하십시오. 반응 관의 DDH 2 O 멸균 100mM의 마그네슘 – 글루타메이트 원액 9.18 ㎕의 3 M K 글루탐산 원액 3.06 μL, 14 배의 에너지 용액 21.86 μL, 40 %의 PEG-8000의 15.3 μL 1.6 μl를 섞는다. 철저하게이 마스트 와동어 각 추가 후에 혼합하고 얼음에 보관하십시오. 반응 튜브 내로 16 μL (3 분취 량)의 볼륨으로 마스터 믹스 (51 μL)을 나누어지는. 자주 분취 동안 마스터 믹스를 소용돌이. 플래시는 액체 질소의 분취 량을 동결. 참고 : 16 μL 분취 량뿐만 아니라 마스터 믹스 부피 피펫으로 인한 손실을 설명하기 위해 요구되는 것보다 약간 더 높다. 에너지 버퍼 튜브를 수집하는 스트레이너를 사용합니다. !. -80 ° C에서주의 튜브를 저장 eyeshield 및 곳을 알아내는 장갑 질소 밝아진으로부터 보호하기 위해 착용한다. ncAAs의 잔류 특정 법인 3. 준비 및 무 세포 반응의 실행 첫째, DDH 2 O.에서 DNA 벡터 용액을 제조 고효율 단백질 발현을 위해, 발현 벡터 pBEST-OR2-OR1-PR-UTR1 – deGFP-T500 (32)를 사용합니다. 유전자를 클로닝하는 벡터 (36, 37)에이 모델 단백질을 코딩 </ SUP>. 주 : 대안 적으로,도 σ (70)에 의해 인식되는 기타 프로모터를 사용하지만, 그 발현 효율이 감소 될 수 있습니다. 37, 38 E.의 벡터 변환 콜라이 균주 KL 740 32 (예일 CGCS 번호 : 4382)은 벡터 (37, 39) DNA를 증폭하고, DNA 용액을 40-42의 농도를 정량화 정제. -20 ° C에서 DNA 솔루션을 저장하거나 직접 세포 수수료 반응 준비를 위해 사용 (3.4.1, 3.4.2 및 3.4.3 단계). 수정되지 않은 프로토콜 34에 따라 사용되는 벡터 작 제물의 농도에 따라 무 세포 발현 효율 보정. 무 세포 반응 준비를위한 가장 높은 단백질 수율 (3.4.1, 3.4.2과 3.4.3 단계)에 이르는 최적의 농도를 사용합니다. 주 : 무 세포 반응의 제조는 무 세포에 10 nM의 최종 농도 벡터 리드 90nm의 벡터 DNA 원액을 사용하여 예시반응은 MG-K 및 글루탐산의 상기 최적 값뿐만 아니라 추출 분취 량을 따른다. 다른 값에 대한 계산 템플릿을 사용합니다. 얼음 3 조 추출물의 분액에 녹여 "+ CAA"(예를 들면, +의 Arg), 1- 아미노산 용액을 분취 표지 라벨링 한 아미노산 용액의 분취 량 (변성 프로토콜 34에 따라 제조 됨) 30 μL 부피의 각 "- CAA"(예를 들어 – "+ NCAA"라벨의 Arg)과 1 아미노산 용액 나누어지는 (예는, +는 (섹션에서)를 제조 할 수 1.2.5 – 1.2.7), (3) 에너지 버퍼 씩 (섹션 2에서 제조)와 벡터 DNA 용액 ( ) 3.1 절에 준비했다. 조 추출물이 약간 점성이며 기포를 포함 할 수 있습니다. 4 ° C에서 30 초 동안 10,000 XG에 원심 분리하여 기포를 제거합니다. 다시 얼음에 조 추출물 씩 넣습니다. 조 추출물 (33.33 %), 에너지를 혼합하여 3 다르게 합성 무 세포 반응 (각각 90 ㎕의 최종 부피)를 준비버퍼 (16.67 %) 3 다르게 구성된 아미노산 용액의 분취 량 (16.67 %) 및 ​​벡터 DNA 용액 1. 선택적으로, 상기 생체 분자 (DNA, 단백질의 tRNA, 등)을 추가 할 수 있지만 적절 DDH 2 O.의 부피를 줄일 기준 무 세포 반응 (90 μL)을 모델 변성 단백질 발현을 준비한다. 2 O 미정 30 μL로 에너지 완충액 15 μL, "+ CAA"(예를 들면, +의 Arg), 90nm의 벡터 DNA 용액 10 ㎕의 멸균 DDH 20 μL 표지 된 아미노산 용액의 분취 액 15 μL를 추가 추출하다. 각 성분의 첨가 한 후 아래로 부드럽게 소용돌이를 피펫 팅에 의해 섞는다. 6 μL의 15과 동일한 볼륨에서 무 세포 반응의 90 μl를 나누어지는. 별도의 반응 관에 15 부피의 각각을 전송. 튜브를 닫고 얼음에 다시 넣어. (예를 들면, CFR (+의 Arg)) "CFR (+ CAA)"모든 반응 튜브 라벨. <li> 어느 것도 CAA (예를 들어,의 Arg)이나 비정규 아날로그 (예를 들어, 수)을 첨가되지 않은 음성 대조군 무 세포 반응 (90 μl를) 준비합니다. "- CAA"을 (예컨대, -의 Arg)를 미정의 30 μl를 90 nM의 벡터 DNA 용액 10 ㎕의 멸균 DDH 2 O 20 μL를, 아미노산 용액의 분취 액 15 μL 개는 에너지 버퍼의 15 μL를 추가 추출하다. 각 성분의 첨가 한 후 아래로 부드럽게 소용돌이를 피펫 팅에 의해 섞는다. 6 μL의 15과 동일한 볼륨에서 무 세포 반응의 90 μl를 나누어지는. 별도의 반응 관에 15 부피의 각각을 전송. 튜브를 닫고 얼음에 다시 넣어. 모든 반응 튜브 라벨 "CFR (-cAA)"(예를 들면, CFR (-Arg)). 발현 된 모델 단백질로 (예를 들면, CAN) 잔류 구체적 할 NCAA 통합 예상되는 무 세포 반응 (90 μL)을 준비한다. 15 추가에너지 버퍼 μL "+ NCAA"로 표시된 아미노산 용액의 분취 액 15 μL (예를 들어, + 수 있음), (90) 나노 DNA 용액 10 ㎕의 멸균 DDH 20 ㎕의 조 추출물 30 μL를 2 O. 각 성분의 첨가 한 후 아래로 부드럽게 소용돌이를 피펫 팅에 의해 섞는다. 주 : 발현 효율 표준 아미노산 발현에 비해 감소 될 수있다. 필요한 경우 단순히 무 세포 반응 부피를 스케일 업. 6 μL의 15과 동일한 볼륨에서 무 세포 반응의 90 μl를 나누어지는. 별도의 반응 관에 15 부피의 각각을 전송. 튜브를 닫고 얼음에 다시 넣어. 증가 된 반응 볼륨의 경우, 이에 따라 6 μL의 추가 볼륨에 나누어지는. (예를 들면, CFR (+ 수)) "CFR (+ NCAA)"모든 반응 튜브 라벨. 29 ° CO / N 모든 튜브를 품어. 참고 : 작은 반응 볼륨이 충분한 산소은 diff를 사용고효율 단백질 발현을위한 중요 반응에 usion. 10 μL 이상 반응 볼륨은 교반 (34)를 통해 활성 산소를 필요로한다. 큰 볼륨의 경우, 15 μl를보다 작은 볼륨으로 반응을 분할합니다. 무 세포 발현 후, 풀은 모두 동일하게 6 μL의 분할 무 세포 반응을 구성. 첫째, 수영장 "CFR (+ CAA)"라는 레이블이 붙은 6 μL의 모든 15 분할 무 세포 반응 (예를 들면, CFR (+의 Arg)). 그런 다음, 풀 라벨 6 μL의 모든 15 분할 무 세포 반응 "CFR (-cAA)"(예를 들면, CFR (-Arg)). 마지막으로, 풀 라벨 6 μL의 모든 15 분할 무 세포 반응 "CFR (+ NCAA)"(예를 들면, CFR (+ 수)). 증가 된 반응 볼륨의 경우, 이에 따라 6 μl를 더 볼륨을 풀. 다르게 변성 SDS-PAGE (43, 44) (4.1)를 수행함으로써 무 세포 반응 이루어지는 풀링 세에서 모델 단백질의 발현 수준을 확인한다. 참고 :이 운전 방식을 사용하여 합동 실험의 예비 평가 라. HPLC-ESI 질량 분광법 (4.4 절)을 통해 적절한 분석을 위해 무 세포 발현 모델 단백질을 준비합니다. 첫째, 45 그들 (4.2 절)을 정화. 마지막으로, 질량 분광법 동안 높은 배경 잡음을 방지하기 위해 버퍼 (4.3 절)을 교환한다. 참고 : 섹션 3.4.1, 3.4.2 전형적인 무 세포 반응 조건 34 3.4.3 납 : 8.9 – (조 추출물)에서 9.9 ㎎ / ㎖ 단백질, 4.5-10.5 밀리미터 밀리그램 – 글루타민산, 40-160 밀리미터 K 글루탐산, 류신 제외한 각 아미노산의 1 ㎜, 0.83 mM의 류신, 50 mM의 HEPES, 1.5 mM의 ATP와 GTP, 0.9 mM의 CTP 및 UTP, 0.2 ㎎ / ㎖의 tRNA, 0.26 mM의 CoA를 0.33 mM의 NAD, 0.75 밀리미터의 cAMP , 0.068 mM의 엽산, 1 ㎜의 스퍼 미딘, 30 mM의 3-PGA, 2 % PEG-8000 및 10 nM의 pBEST-OR2-OR1-PR-UTR1이-gene_of_model_protein-T500. 필요한 경우, 무 세포 반응 제제의 다른 절차는 상기 반응 조건에 이르게이 수행 될 수있다. 제작 "> 4. 예비 SDS-PAGE 43, 44을 통해 평가 및 HPLC-ESI 질량 분석을위한 세포가없는 표현 모델 단백질의 제조 무 세포 반응의 SDS-PAGE 참고 : 더 정제 또는 추출없이 발현 된 단백질의 신속하고 예비 분석을위한 SDS-PAGE를 변성 수행하고 다음 단계를 실행합니다. 얼음에 단백질 표준을 녹여. 이 겔에 현지화 (단계 4.1.13)에 대한 표현 모델 단백질과 비슷한 분자량의 단백질로 구성되어 있는지 확인합니다. 주 : 212 kDa의 말 토스 – 결합 단백질 – β 갈 락토시다 제 : 158 kDa의, β 갈 락토시다 제 : 116 kDa의, 포스 B : 97 kDa의 혈청 알부민 여기서, 사용되는 표준은 분자량 (미오신의 넓은 범위에 걸쳐 단백질을 제공한다 : 66 kDa의, 글루탐산 탈수소 효소 : 56 kDa의, 말토오스 결합 단백질 : 43 kDa의, 티 오레 독신 환원 : 35 kDa의, triosephosphate 이성화 : 27 kDa의, 트립신 억제제 : 20 kDa의, LYsozyme : 14 kDa의, 아프로 티닌 : 7 kDa의 인슐린 A : 3 kDa의, B 체인 : 2 kDa의). 적절한 겔 이동을 보장하고 염색 후 포화를 방지하기 위해 SDS-PAGE 이전에 10 배 – 무 세포 반응으로 인해 높은 단백질 농도에 약간의 점성 때문에 멸균 DDH 2 O 5 이들을 희석. 너무 많은 샘플을 낭비 멸균 DDH 2 O 4 μL에 무 세포 반응 1 μL로 희석하지 않도록 반응 튜브에 철저하게 소용돌이를 희석을 준비하고 곧 2 미니 원심 분리기로 액체를 스핀 다운 – 3 초에서 2,000 × g으로. 희석 무 세포 반응의 5 μL에 2 배 로딩 버퍼의 5 μl를 추가합니다. g X 2000에서 3 초 – 철저히 와동과 2 미니 원심 분리기와 스핀 다운. 주 : 여기에서, 첨가 후, 생체 62.5 mM 트리스 / CL에 용해 -, pH가 6.8, 10 % 글리세롤, 2 % SDS, 및 0.0025 % 브로 모 페놀 블루, 전형적인 조성물. 약간 다른 희석 공동으로 이어질 다른 로딩 염료를 사용하여nditions도 적합 할 수있다. 철저히 단백질 표준 와동 및 반응 관으로의 15 μl를 옮긴다. 참고 : 젤의 크기와 다른 단백질 표준을 따라 권장되는 볼륨이 상기와 다를 수 있습니다. 가열 블록에 반응 튜브를 놓습니다. 튜브의 뚜껑이 제대로 닫혀 있는지 확인합니다. 5 분 – 3 100 °의 C – 95에서 열. 이 단백질을 변성하는 마십시오과 단백질 백본 주위 SDS-포장을 가능하게 할 수 있습니다. 참고 : 일부 단백질 표준은 공급 업체의 지침을 참조 가열해서는 안된다. 한편, 전기 영동 챔버로 실행하는 버퍼를 전송합니다. 런닝 버퍼 (1X)의 함유량은 25 mM 트리스, 192 mM의 글리신 (HCl로) pH를 8.3에서 0.1 % SDS이다. 전기 영동 챔버 20 % 구배 트리스 – 글리신 – SDS 겔 (10cm X 10cm X 1mm) – 프리 캐스트 넷을 수정합니다. 빗를 제거하고 버퍼를 실행하는로드 주사기로 우물을 씻어. 참고 : 겔 농도 STROngly 발현 된 모델 단백질의 크기와 성격에 따라 달라집니다. 상기 농도는 E. 분리 콜라이 조 추출물의 단백질뿐만 아니라 저분자 모델 단백질. 자기 캐스트 젤도 적합하다. 가열 블록에서 튜브를 제거합니다. 3 초에서 2,000 × g으로 – 2 미니 원심 분리기로 액체를 스핀 다운. 2,000 x g에서 3 초 – 곧 소용돌이와 2 회전 수 반복합니다. 우물에 각 샘플의 – (22 μg의 단백질 11)과 전기 영동을 시작 – (48 μg의 단백질 24) 및 10 ㎕의 단백질 표준의 15 μl를 전송합니다. 약 90 분, 전형적인 프로토콜 40mA – 여기서, SDS-PAGE 125 V 및 20에서 수행된다. 조심스럽게 카세트에서 젤 압축을 풉니 다. 30 분 동안 고정 용액 (50 % 메탄올, 10 % 아세트산, 40 % DDH 2 O)로 전송합니다.주의! 메탄올은 흡입 및 피부에 접촉되면 유독이다. 흄 후드 보호 장갑과 작업을 착용 할 것. 염색 용액 (0.025 % 쿠마 화려한 푸른 G-250, 10 % 초산, 90 % DDH 2 O)로 젤을 전송합니다. 60 분 동안 얼룩. 120 분 – 60 탈색 용액 (10 % 아세트산, 90 % DDH 2 O)로 겔을 전송. 참고 : 고정, 염색 강하게 탈색이 발현 된 단백질의 크기와 성격에 따라 달라집니다. 이 프로토콜은 오히려 작은 분자량 46 단백질의 넓은 범위에 적용된다. 염색 된 단백질 밴드의 적절한 콘트라스트를 생성하는 흰색 배경에 매트 상으로 투명 겔 변위. 무 세포 반응에서 그의 태그-45 모델 단백질 정제 참고 : 단백질 정제를 들어, 몇 가지 방법이 유사한 결과를 제공 존재한다. 이 프로토콜은 C 말단 폴리 히스티딘 태그 (그의 태그)가 무 세포 단백질 발현 모델 정화. 그것은 특급 단백질에 적합한 정제 키트를 사용하여무 세포 단백질 발현의 작은 반응 부피에 ressed. 이것은 천연 또는 변형 모델 단백질의 정제와 동일하다. 따라서, 일반적으로 하나의 무 세포 반응에 기초하여 설명한다. 적절한 HPLC-ESI 질량 분광 분석을 위해 추출하여 무 세포 반응 모델 단백질을 정제하고 다음 단계를 실행한다. 그의 결합 버퍼의 150 μl를 90 – – 무 세포 반응의 150 μL (90)의 동일한 볼륨을 섞는다. 최대 피펫 아래로, 부드러운 텍싱 하였다. 참고 : 그의 결합 버퍼를 사용하는 것이 좋습니다. 이미 다졸은 / 그의 농도는 8 <10 밀리미터가 강한 환원제의 농도는 <15 mM의 어떠한 금속 – 인 – 모델 단백질이 가용성 인 그러나, 무 세포 반응 매질만큼 원료가 될 수 7.5 사이의 pH는 킬레이트 제는 존재한다. 하여 혼합물을 부피 300 μl를 초과하면, 동일 볼륨으로 분할하고 다른 분취 R로 볼륨 논제다음 정제 단계에 대한 eaction 튜브. 열 시스템을 준비합니다. 겔 수지가 완전히 용해 될 때까지 철저하게 그의 친 젤의 원액을 소용돌이. 열로 겔 수지의 250 μl를 전송합니다. 점성 겔 수지의 1 ML의 피펫 팁을 사용합니다. 수집 튜브에 열을 놓습니다. 원심 분리기 칼럼 / 수집 관 5 – 15,000 × g으로 – 13,000에서 10 초. 겔 수지가 완전히 방전되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 추가로 5 원심 분리 시간을 연장 – 10 초이지만 친화 겔 위에 건조되지 않도록주의. 따라서 단계 4.2.1.5, 4.2.1.7 및 4.2.1.9에서 원심 분리 시간을 연장. 참고 :이 뻣뻣하게 더 뜨는 상단에 남아없는 경우 겔 ​​수지가 완전히 방전된다. 컬럼에 무 세포 반응 / 그분의 결합 버퍼 300 μL – (150)을 전송합니다. 혼합물을 부피가 권장 양을 초과하는 경우, 여러 스핀 컬럼을 통해 분리. FR하여 겔 수지를 재현 탁equent 도청 부드러운 텍싱 적어도 2 분의 배양 시간 동안. 2 분 – 200 μL보다 큰 볼륨의 경우, 추가 1 품어. 주 : 충분한 배양 시간은 겔 수지 모델 단백질 결합에 중요한 것이다. 원심 분리기 칼럼 / 수집 관 5 – 15,000 × g으로 – 13,000에서 10 초. 흐름 -을 통해 폐기하고 다시 수집 튜브에 열을 배치합니다. 그의 세척 버퍼의 250 μl를 추가합니다. 도청 부드러운 텍싱에 의해 겔 수지를 재현 탁. 원심 분리기 칼럼 / 수집 관 5 – 15,000 × g으로 – 13,000에서 10 초. 흐름 -을 통해 폐기하고 다시 수집 튜브에 열을 배치합니다. 15,000 × g으로 – 13,000에서 10 초 – 5 다시 단계를 반복 4.2.1.6 원심 분리기. 표준 1.5 ml의 반응 튜브에 열을 놓습니다. 용출 버퍼 150 μl를 추가하고 도청 부드러운 텍싱에 의해 겔 수지를 재현 탁. 높은 정제 된 모델 단백질 콘 100 μL에 볼륨을 줄입니다다음 단계 4.2.1.9에서 용출 후 centrations. 주 : 용출 완충액 용적이 감소하는 경우 정제 모델 단백질의 총 존재 량으로 인해 모든 겔 수지 – 결합 단백질의 가능한 완전 용출이 감소 될 수있다. 원심 분리 컬럼 / 반응 튜브 5 – 13000 10 초 – 15,000 XG 용출 완충액에 정제 된 단백질을 희석. 전에 분할하는 경우, 하나의 원액에 모든 솔루션을 풀. 버퍼 교환을 실행하기 전에, 예를 들어, 표준 방법을 사용하여 단백질 농도를 결정은 브래드 포드 (47, 48)를 분석. 참고 : – 50 μL 적절한 HPLC-ESI 질량 분광법 (4.4)의 경우, 일반적으로 20 필요한 볼륨이 약 0.5 ㎎ / ㎖있는 최적의 단백질 농도를 사용합니다. 농도가 0.2 mg을 밑도는 경우 / ㎖, 회전 진공 농축기를 이용하여 상기 버퍼 교환 후 단백질 용액을 농축시킨다. 이 경우, 제 적절히 교환 버프 적응 섹션 4.3.8 읽기어. HPLC-ESI 질량 분광법에 대한 버퍼 교환 참고 : 인해 이미 다졸 (> 150 밀리미터) 등의 NaH 2와 같은 다른 소금의 높은 농도 PO 4 (> 300 밀리미터) 또는 염화나트륨 (> 50 mM)을 질량 분광 분석에서 높은 배경 잡음을 피하기 위해 자신의 태그 용출 버퍼를 교환 49. 다음 완충액 교환 프로토콜은 prehydrated 겔 여과 스핀 컬럼 시스템을 사용한다. 그것은 동일 네이티브 또는 수정 된 모델 단백질 실행됩니다. 따라서, 일반적으로 하나의 무 세포 반응에 기초하여 설명한다. 다른 쉬운 수행 버퍼 교환 방법, 예를 들어, 미니 투석 카트리지가 있습니다. 단백질을 저장 완충액 (50 mM 트리스 – CL pH를 8, 100 mM의 염화나트륨, 10 % 글리세롤) 100 ㎖를 준비한다. 605.7 mg의 트리스 자료, 584.4 mg의 염화나트륨을 병 및 글리세롤 10 ㎖를 추가 ㎖ 넣어 오토 클레이브 (100)에 달다. 약 80 ml의 최대 입력하고 의해 8 pH 값을 조정설정된 뒤 NaOH를. 꾸준히 pH 미터로 pH 값을 확인합니다. 마지막으로, 100 ㎖ 표시까지 채운다. 참고 한 HPLC는 질량 분광 측정하기 전에 수행되는 한, 질량 분광 분석을 방해 모델 단백질의 다양한 안정하지 버퍼를 사용한다. 그러나, 발현 된 단백질 모델의 특성에 따라, 더 적합 할 수있는 다른 버퍼를 사용한다. 대상 단백질의 pH 8에서 안정하지 않은 경우, 그에 따라 pH를 조정합니다. 높은 글리세롤 농도를 사용하지 마십시오. RT 적어도 15 분 동안 겔 여과 스핀 열을 따뜻하게. 부드러운 도청 또는 텍싱에 의해 prehydrated 젤을 재현 탁하고 기포를 제거합니다. 먼저 하단 캡을 제거하고 멀리 상단 캡을. 세척 튜브 (최소 2 ㎖)에 열을 놓습니다. 원심 분리기에 열 / 세척 튜브를 전송합니다. 각 열은 오리엔테이션 마크를 보유하고있다. 겔 저장 버퍼를 제거하기 위해 2 분 동안 1000 × g으로 원심 분리기. 디스크플로우 스루 ARD. 참고 :이 순서대로 진행주의를 기울이십시오. 열이 모든 추가 원심 분리 단계에서 같은 방향을 가지고 있는지 확인하십시오. 단백질 저장 버퍼 400 μL을 추가 할 수 있습니다. 1000 x g에서 2 분간 원심 분리한다. 완전히 젤에 단백질 저장 버퍼를로드하기 위해이 작업을 반복합니다. 조심스럽게 정제 된 모델 단백질의 용액 100 μL를 추가. 피펫 직접 겔 층의 중심 상. 참고 : 정제 된 단백질의 솔루션 볼륨, 특히 변형 된 단백질의 높은 수 있습니다. 여러 버퍼 교환 컬럼을 통해 이러한 솔루션을 분할합니다. 단백질은 버퍼 교환 이런 종류의 5 kDa의보다 높은 분자량을 가지고 있어야합니다. 1,000 X g에서 2 분간 포집 관과 원심 분리기에 열을 놓습니다. 주 :이 단계는 단백질 축적 버퍼의 정제 모델 단백질의 희석 리드. 전에 분할하는 경우, 하나의 원액에 모든 솔루션을 풀. 플래시 동결 번째전자 단백질 -80 ° C에서 액체 질소와 저장소에 솔루션을 직접는! HPLC-ESI 질량 분광법 (50) (4.4).주의를 통해 분석 eyeshield 및 곳을 알아내는 장갑 질소 밝아진으로부터 보호하기 위해 착용한다. 조심스럽게 증발하여 용매를 51 회전 진공 농축기를 이용하여 단백질 용액을 농축 프로토콜의 다음 단계를 수행한다. 주 : 단백질 농도는 HPLC-ESI 질량 스펙트럼 (<0.2 ㎎ / ㎖)에 대해 너무 낮 으면이 단계는 필요하다. 용액의 부피와 모델 단백질 농도는 대략 전후 버퍼 교환 후 동일하다. 그의 태그 정제 한 후, 모델 단백질 그의 용출 완충액 (단계 4.2.1.9) μL (100)에 용해시키고, 0.07 ㎎ / ㎖ (단계 4.2.1.10)의 농도 : 농축 공정은 다음 예에 의해 설명된다 . 단백질 농도, 용액의 부피로 증발시킨 후되도록적어도 0.2 ㎎ / ㎖, 20 ㎕의 각각 버퍼 교환, 최대 다섯 배 이상의 삼중 단계 4.3.1에서 제조되지만 단백질 축적 버퍼 전에 희석. 마찬가지로 세번째 적어도 두 (66.67 μL) 또는 최대 네 개의 제 (80 μL)을 다음 증발시켰다. 주 : 버퍼 교환이 중요한 단백질 축적 버퍼의 희석 전에 버퍼 (단계 4.3.1)의 농도 값이 여전히 증발 불구 실현되는 것을 고려해야. 4.3.8.4 – 4.3.8.2 단계 다음 실행 전에 – 단백질 축적 버퍼 희석 한 후, 먼저 버퍼 교환을 수행 (4.3.6 4.3.2 단계). 버퍼 교환 한 후, 회전 진공 농축기로 열린 관에서 모델 단백질 용액의 전체 100 μl를 넣어. 주 : 모델 단백질은 단백질을 희석 저장 완충액에 용해시킨다. 회전 중에 액체 손실을 방지하기 위하여 회전 중심을 향해 경사. 확인이의 같은 볼륨의 개방 빈H 2 O 대칭 방사 시스템의 균형을 둔다. 집중의 뚜껑을 닫고 회전을 시작합니다. 단백질의 안정성을 보장하기 위해, RT에서 30 ° C까지 낮은 온도에 집중한다. 주 : 사용 집중이 자동으로 170 XG에 가속 및 진공을 설정합니다. 다음으로는 240 × g으로의 최대 속도로 가속. 자주 액량을 조사하기 위해 농축 과정을 방해. 나머지 용액을 부피 20 ㎕를 33 ㎕의 사이에있을 때, 농도를 멈춘다. 참고 : 따라서 단계 4.3.8.1 적응 – 다른 솔루션 볼륨 (단계 4.2.1.9) 및 기타 단백질 농도 (단계 4.2.1.10)에 대한 4.3.8.4을. 플래시는 -80 ℃에서 액체 질소에 저장 농축 단백질 용액을 동결 또는 직접 HPLC-ESI 질량 스펙트럼 (50)을 통해 분석한다. 주의! eyeshield 및 곳을 알아내는 장갑 착용 질소 밝아진으로부터 보호한다. 모델 단백질의 HPLC-ESI 질량 분광 분석 (50) 90 % 아세토 니트릴과 25 포름산 0.1 % – 20 %의 구배와 C5 역상 컬럼에 (섹션 4.3에서 제조) 15 ㎕의 단백질 용액 (이 3 μm, 100 × 2.1 mm) – (5)의 HPLC 분리를 수행 300 분 범위의 비행 시간 형 질량 analysator 검출에 후속 ESI 질량 스펙트럼 – 3,000m / z. 참고 : 표현 모델 단백질의 특성에 따라 더 적합 할 수있는 다른 용매 또는 열을 사용합니다. Deconvolute 제로 충전 질량을 계산하는 적절한 소프트웨어 (52)를 이용하여 질량 스펙트럼을 측정 하였다.