Los enfoques genéticos y bioquímicos para<em> En Vivo</em> y<em> In Vitro</em> Evaluación de la oligomerización de proteínas el receptor de rianodina Estudio de caso

1. La levadura de dos híbridos Transformación de levadura Preparar los siguientes medios y tampones: Preparar levadura (YPD) medio completo extracto de levadura-peptona-dextrosa mediante la mezcla de 20 g / L de peptona, 10 g / L de extracto de levadura, 2% w / v de glucosa (añadido después de la esterilización en autoclave) y 20 g / L de agar (para placas solamente) ; esterilizar en autoclave y usar fresco en el día del experimento. Preparar medio definido levadura mínimo sintético (SD) (leucina carente y triptófano para mantener la presión selectiva en ambos plásmidos de cebo y de destino) por mezcla de 6,7 g / L de levadura Base de nitrógeno, 1,6 g / L Dropout suplemento leucina carente y triptófano, 2% w v de glucosa / (añadido después de la esterilización en autoclave) y 20 g / L de agar (para placas solamente); esterilizar en autoclave y usar fresco en el día del experimento. Preparar 50% w / v de PEG (polietilenglicol) 3350; esterilizar a través de un filtro de 0,2 micras y se almacena a temperatura ambiente. Preparar mM Tris / EDTA 10 mM (10x TE) 100, ajusteel pH a 7,5, esterilizar a través de un filtro de 0,2 micras y se almacena a temperatura ambiente. Preparar acetato 1 M de litio (10x LiAc); ajustar el pH a 7,5 con CH 3 COOH, esterilizar a través de un filtro y tienda de 0,2 micras, con RT. Revivir la cepa Y2H (por ejemplo, Y190) rayando una pequeña cantidad del stock de glicerol congelado en una placa de YPD. Incubar a 30 ° C hasta que las colonias de levadura alcanzan ~ 2 mm de diámetro (generalmente 3 – 5 días, dependiendo de la cepa de levadura). Inocular 0,5 ml de YPD (en un tubo de 1,5 ml) con una sola, grandes (2 – 3 mm de diámetro) colonia. Vortex vigorosamente durante ~ 2 min para dispersar los grumos. Transferir la suspensión celular en un matraz de 500 ml que contiene 50 ml de medio YPD. Incubar a 30 ° C durante 16 – 18 horas con agitación a 250 rpm para la levadura para llegar a la fase estacionaria. Transferencia de 4-5 ml del cultivo de una noche en 200 ml de YPD (en un matraz cónico de 1 L) para producir una densidad óptica a 600 nm (OD 600, mideutilizando un espectrofotómetro) de 0,2 – 0,3 (200 ml será suficiente para 20 transformaciones). Incubar a 30 ° C con agitación a 250 rpm hasta que las células están en fase mid-log, es decir, OD 600 = 0,5-0,6 (por lo general 2 – 3 h). levadura cosecha por centrifugación (en tubos de 50 ml) a 1500 xg durante 5 min a TA. Descartar el sobrenadante, resuspender cada pellet en 5 ml de H2O estéril y la piscina juntos. Re-centrifugar a 1500 xg durante 5 min a RT y desechar el sobrenadante. Resuspender pellet de levadura en 1 ml de recién preparada, 1x LiAc / TE estéril. NOTA: Utilice las células de levadura competentes en el plazo de 1 hora de preparación. Preparar muestras de plásmidos (en tubos de 1,5 ml) mediante la adición de 200 ng de ADN de plásmido para las transformaciones individuales, o 0,5 a 1 g de cada ADN plásmido para los compañeros de transformaciones, y 100 g de testículos de arenque ADN portador (hervida durante 20 min y se enfrió en hielo justo antes de su uso). NOTA: Incluir un control positivo, por ejemplo, la levadura.co-transformada con pVA3 (codificación para la fusión GAL4 DNA-BD con la proteína p53) y pTD1 (codificación para la fusión GAL4 AD con el antígeno T grande de SV40). Añadir 100 l de la recién preparada, suspensión de levadura competente (paso 1.1.8) y 600 l de solución de 1x LiAc / PEG (8 ml de existencias de PEG 3350, 1 ml de Stock TE, 1 ml de Stock LiAc), y agitar durante ~ 30 seg. Incubar a 30 ° C durante 30 min con agitación a 200 rpm. Añadir 80 l de sulfóxido de dimetilo (10% v / v de concentración final) y se mezcla bien por inversión suave. El choque térmico durante 15 minutos en un baño de agua C 42 ° mientras se mezcla cada 2 – 3 min. Chill suspensión de células en hielo durante 2 min y se centrifuga a 14.000 xg durante 15 seg a temperatura ambiente para recuperar la levadura. Resuspender pellet celular en 100 l de 1x TE y la placa sobre placas de medio SD mínimas apropiadas para el crecimiento selectivo (medio que carecía de leucina y triptófano para mantener una presión selectiva sobre ambos plásmidos cebo y de destino). Incubar las placas hasta boca abajo a 30° C hasta que las colonias son ~ 2 mm de diámetro (generalmente 4 – 5 días). Las placas se pueden almacenar a 4 ° C durante 2 – 3 semanas; para el almacenamiento ya que las existencias de glicerol y se almacena a -80 ° C. NOTA: Verificar que las proteínas de cebo y de destino se expresan en levadura por inmunotransferencia 17, y que no tienen la activación del gen reportero autónomo separado cuando se expresa en la levadura (por el ensayo de β-Gal como se describe en la Sección 1.3). Elevadoras colonia papel de filtro de β-Gal Ensayo Preparar los tampones siguientes: Prepare el buffer Z que contiene 100 mM de Na 2 HPO 4, 40 mM NaH 2 PO 4, KCl 10 mM, 1 mM de MgSO4; ajustar el pH a 7,4. Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente. Preparar tampón de X-Gal mediante la disolución de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido en 20 mg / ml en N, N-dimetilformamida y almacenar en la oscuridad a -20 ° C. Preparar la solución tampón Z / X-Gal. hacer tampónantes de su uso mediante la mezcla X-Gal a 0,33 mg / ml y β-mercaptoetanol a 0,27% v / v en tampón Z. Use 2,5 ml por muestra. Añadir 2,5 ml de solución tampón Z / X-Gal recién preparada en una placa de 100 mm limpio y colocar dentro de un papel de filtro de celulosa. Colocar un nuevo papel de filtro sobre la superficie de la placa con las colonias de levadura a ensayar. Frote suavemente el papel de filtro sobre la placa con pinzas y dejar actuar durante ~ 5 min de colonias para adjuntar. NOTA: Procesar el control positivo en paralelo, es decir, la levadura co-transformada con pVA3 y pTD1.. Levante el papel de filtro y sumergirlo (con pinzas) en un depósito de nitrógeno líquido durante 30 segundos (nitrógeno líquido debe ser manejado con cuidado, siempre use guantes gruesos y gafas). Deje que el deshielo de papel de filtro congelado a temperatura ambiente durante ~ 2 min. Colocar el papel filtro (lado de las colonias hacia arriba) en la parte superior del papel de filtro previamente remojado el interior de la placa de 100 mm, y se incuba a 30 ° C. Compruebe periódicamente(Cada ~ 30 min) para la aparición de colonias de color azul. La levadura Y190 co-transformada con los plásmidos de control positivo (+ pVA3 pTD1) se vuelve azul dentro de 60 min (observaciones no publicadas). NOTA: Cebo Débil: interacciones objetivo pueden tardar varias horas para producir una señal de color azul positivo (evitar la incubación prolongada (> 8 h) que pueden dar resultados falsos positivos). Para obtener los mejores resultados, utilice colonias recién co-transformadas, es decir, que se cultiva a 30 ° C durante 4 -. 5 días, ~ 2 mm de diámetro. Líquido de cultivo β-Gal Ensayo Preparar los tampones siguientes: Prepare el buffer Z que contiene 100 mM de Na 2 HPO 4, 40 mM NaH 2 PO 4, KCl 10 mM, 1 mM de MgSO4; ajustar el pH a 7,4, esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente. 1 M Na 2 CO 3; almacenar a temperatura ambiente. Preparar tampón Z / β-mercaptoetanol. Hacer tampón antes de su uso mediante la adición de β-mercaptoetanol a 0,27% v /v en tampón Z; utilizar 700 l por muestra. Prepare el buffer Z / solución ONPG. Hacer tampón antes de su uso mediante la mezcla de ONPG (o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido) a 4 mg / ml y β-mercaptoetanol a 0,27% v / v en tampón Z; utilizar 160 l por muestra. Utilice una sola colonia para inocular 5 ml de medio SD mínima (que carece de leucina y triptófano para mantener la presión selectiva en ambos plásmidos de cebo y de destino) y se incuba a 30 ° C durante 16 – 18 horas con agitación a 250 rpm. NOTA: Ensayo de cinco colonias distintas co-transformaron con el mismo cebo y de destino plásmidos. Transferencia suficiente del cultivo de una noche en 10 ml de medio SD fresco para producir una DO 600 = 0,2-0,3. Incubar a 30 ° C con agitación a 250 rpm hasta que las células están en fase semilogarítmica (OD 600 = desde 0,5 hasta 0,6). Transferir 0,5 ml de cultivo de levadura en un tubo de 1,5 ml y centrifugar a 14.000 xg durante 2 min a TA. Registre el OD 600 exacta cuando se cosecha el ceLLS. Resuspender pellet en 100 pl de tampón Z; esto dará lugar a un factor de concentración 5 veces. Colocar el tubo en nitrógeno líquido durante ~ 1 min (nitrógeno líquido debe ser manejado con cuidado, siempre use guantes gruesos y gafas) y luego en un baño de agua a 37 ° C durante 3 min se descongele. Repita este ciclo de congelación-descongelación dos veces más para asegurarse de células se rompen. Configurar un tubo blanco con 100 l de tampón Z. Añadir 700 l de tampón Z / β-mercaptoetanol y 160 l de tampón Z / ONPG a la muestra y los tubos en blanco; iniciar el temporizador y el lugar en una incubadora a 30 ° C. Comprobar periódicamente si hay color amarillo se desarrolle. Añadir 400 l de 1 M de Na 2 CO 3 para detener el desarrollo del color y registrar el tiempo transcurrido en minutos. La levadura Y190 co-transformada con los plásmidos de control positivo (+ pVA3 pTD1) se volverá amarilla dentro de 60 min .. NOTA: Cebo Débil: interacciones objetivo pueden tardar varias horas para producir una señal amarilla positiva Para un mejor reresultados, utilice colonias recién co-transformadas, es decir, que se cultiva a 30 ° C durante 4 -. 5 días, ~ 2 mm de diámetro. Centrifugar a 14.000 xg durante 5 min a temperatura ambiente para sedimentar los restos celulares y transferir el sobrenadante a una cubeta limpia. El uso de un espectrofotómetro, se mide la absorbancia a 420 nm (A 420) de las muestras con respecto a los valores en blanco (debe ser de entre 0,02 a 1,0). Calcular unidades de β-galactosidasa, con 1 unidad se define como la cantidad que hidroliza 1 mmol de ONPG a o-nitrofenol y D-galactosa por min por célula, de acuerdo con la siguiente fórmula: = unidades β-galactosidasa Donde: t: tiempo transcurrido de incubación (en minutos); . cf: el factor de concentración de la etapa 1.4.8, es decir, cf = 5; OD 600: cuando se recogieron las células. 2. Expresión de la proteína en una línea celular de mamífero <strong> La transfección de células de mamífero Preparar los siguientes medios y tampones: Preparar medio de crecimiento mediante la mezcla de DMEM con 4,5 g / l de glucosa, 10% v / v de suero bovino fetal y 2 mM L-glutamina; esterilizar a través de un filtro y tienda de 0,2 micras a 4 ° C. Preparar solución salina tamponada con Hepes 2x (2x HBS) mezclando NaCl 280 mM, KCl 10, 1,5 mM Na 2 HPO 4, glucosa 12 mM, Hepes 50 mM; ajustar el pH a 7,05, esterilizar a través de un filtro y tienda de 0,2 micras, con -20 ° C. Preparar 2,5 M CaCl 2. Esterilizar a través de un filtro de 0,2 micras y almacenar a -20 ° C. Un día antes de la transfección, las semillas de 1 – 2 x 10 6 células HEK293 células en una placa Petri de 100 mm con el fin de ser un 60-70% de confluencia al día siguiente. La cultura para el 16 – 18 horas a 37 ° C en una incubadora humidificada con 5% de CO2. En el día de la transfección, eliminar las células viejas de media y de alimentación con 10 ml de medio de crecimiento fresco. NOTA: Los antibióticos se omiten en el medio de cultivo durante la transfección, porque pueden aumentar la muerte celular. Diluir 24 g de ADN plásmido (para los co-transfecciones, una relación molar igual de los dos plásmidos) y 60 l de 2,5 M CaCl 2 en 600 l volumen total (hecho con H desionizada estéril 2 O) dentro de un tubo de 1,5 ml; vórtice para mezclar. NOTA:. Para conseguir la máxima eficiencia de la transfección, el ADN plásmido debe ser de la más alta pureza, es decir, tener una relación de Abs 260 / Abs 280 = ~ 1,8. Añadir la solución de ADN del plásmido / calcio a gota en un tubo de 50 ml que contiene 600 l de 2x HBS mientras que constantemente y mezclándolo vigorosamente por agitación. Incubar durante 20 min a RT para permitir la formación de complejos de fosfato / plásmido de ADN de calcio. Después de la 20 min de incubación, brevemente vórtice y añadir la gota solución sabia sobre las células para cubrir toda la superficie de la placa de Petri de 100 mm. Se incuban las células a 37 ° C en 5% CO <sub> 2. Después de ~ 6 hr cambiar el medio de crecimiento y colocar de nuevo en la incubadora. Recoger las células 24 horas después de la transfección por centrifugación a 1000 xg durante 3 min a RT y descartar el sobrenadante. Los sedimentos celulares se pueden almacenar a -80 ° C hasta que se necesite. NOTA: La expresión alcanza su más alto 24 de – 72 horas después de la transfección. La homogeneización de la célula Preparar los tampones siguientes: Preparar tampón de homogeneización Co-IP mediante la mezcla de NaCl 150 mM, Tris 20 mM; ajustar el pH a 7,4 y se almacena a 4 ° C. Prepare Entrecruzamiento de tampón de homogeneización mezclando mM Hepes 5, 0,3 M de sacarosa; ajustar el pH a 7,4 y se almacena a 4 ° C (filtro antes de su uso para eliminar cualquier partícula). Suplemento con inhibidores de proteasa antes de su uso. Añadir 250 l de perlas de vidrio (425 – 600 micras) dentro de un tubo de 1,5 ml y se lava con 500 l de tampón de homogeneización. perlas de vidrio de pellets de una breve centrifugaciónpulso (1.000 xg durante 5 seg) y eliminar el sobrenadante. Repita este paso de lavado una vez más. Resuspender pellet celular (de la etapa 2.1.8) en 500 l de tampón de homogeneización enfriado con hielo y transferir la suspensión de células en el tubo de perlas de vidrio que contiene. Homogeneizar células en hielo por 20 pasos a través de una aguja fina (23 G, 0,6 x 30 mm) unida a una jeringa de 1 ml. Con la tapa del tubo cerrado, perfore a través de ella con la aguja y se dispersan suspensión celular vigorosamente a través de las cuentas de vidrio. Centrifugar a 1500 xg durante 10 min a 4 ° C para eliminar los núcleos y las células intactas y desechar el sedimento. Guardar el sobrenadante representa la fracción post-nuclear y proceder directamente a co-IP o de reticulación según el caso. 3. Los métodos in vitro bioquímicos Co-inmunoprecipitación Preparar los tampones siguientes: Preparar tampón de homogeneización Co-IP como se describe en sección 2.2.1.1. Preparar tampón de IP mediante la mezcla de Tris 20 mM, NaCl 150 mM, 0,5% (w / v) de CHAPS, ditiotreitol 2 mM (opcional; ditiotreitol puede ser incluido para reducir los agregados de proteínas que se puedan haber formado debido a la oxidación del aire); ajustar el pH a 7,4 y se almacena a 4 ° C. Preparar 2% w / v de CHAPS en tampón de homogeneización co-IP; almacenar a 4 ° C. Preparar tampón de proteína de carga mediante la mezcla de Tris 60 mM, 2% w / v de SDS, 10% v / v de glicerol, EDTA 5 mM, 0,01% w / v azul de bromofenol, 2% v / v β-mercaptoetanol (opcional); ajustar el pH a 6,8 y se almacena a temperatura ambiente. Homogeneizar las células de un mm placa de Petri confluentes 100 (~ 8 x 10 6 células HEK293 si, contó con el uso de un hemocitómetro) como se describe en la Sección 2.2. Solubilizar la fracción subcelular post-nuclear con 0,5% de CHAPS (utilizando el 2% de valores) e incubación durante ≥2 horas a 4 ° C con agitación constante. Centrifugar a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar las materi insolublecol y desechar el sedimento. Guardar el sobrenadante denominado lisado celular. NOTA: La inclusión de un detergente y la eliminación del material insoluble es absolutamente necesario para minimizar la unión no específica. Detergentes. Intermedios, por ejemplo, CHAPS o Triton X-100, a una concentración de 0,2 – 1%, son los más comúnmente utilizados. Preparar dos distintos tubos de 1,5 ml y añadir ~ 20 l (dependiendo de la capacidad de unión a IgG) de 6 mg / ml de proteína-A o Proteína G-agarosa (o de sefarosa) perlas. Se lava con 200 l de buffer de propiedad intelectual. NOTA: Elija la resina de unión a Ig adecuada en función de las especies animales utilizadas para producir el anticuerpo inmunoprecipitación. Protein-G se une a un rango más amplio de subtipos de Ig en comparación con proteína-A. Recuperar perlas por centrifugación a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Repetir el lavado una vez más con tampón IP, a continuación, volver a suspender los granos en 200 l de tampón de IP. Añadir 1 g (5 ng / l) del anticuerpo inmunoprecipitación o IgG no inmune (paraservir como control negativo) en los / G tubos que contenían sendos Proteína-A. Incubar durante ≥2 horas a 4 ° C con agitación constante. NOTA: El proceso siempre un control negativo con el uso de IgG no inmune criado en la misma especie animal que el anticuerpo inmunoprecipitación. Recuperar perlas por centrifugación a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C y desechar cuidadosamente el sobrenadante con la pipeta. Transferir 200 l de lisado celular (de la etapa 3.1.3) en cada uno de los dos tubos con anticuerpos y / G cuentas de Proteína-A. Incubar durante ≥2 horas a 4 ° C con mezcla constante para permitir la unión antígeno-anticuerpo. Recuperar los granos y se lava con 200 l de buffer de propiedad intelectual; incubar durante 10 min a 4 ° C con mezcla. Recuperar los granos y lavar dos veces más (múltiples lavados evitar que reduzcan tanto la unión no específica y específica). deseche con cuidado el sobrenadante con la pipeta. Añadir 30 l de tampón de proteína de carga para eluir immunoprecipitATED proteínas. Se centrifuga a 1.500 xg durante 2 min a 4 ° C, tirar las bolas y guardar el sobrenadante que contiene la muestra co-IP eluido. Para verificar la precipitación de la proteína X éxito, cargar una pequeña cantidad (1/10, 3 l) de la muestra co-IP en un gel de SDS-PAGE para ser analizados por inmunotransferencia 17 con un anticuerpo específico para la proteína X. Incluye una alícuota de la lisado celular para verificar la expresión de la proteína X en la muestra. Para probar la presencia de la proteína co-precipitado Y, cargar el resto (9/10, 27 l) de la muestra co-IP en un gel de SDS-PAGE por separado para ser analizados por inmunotransferencia con un anticuerpo específico 17 para Y. proteínas incluir una alícuota del lisado celular para verificar la expresión de proteínas Y en su muestra. Reticulación química Preparar los tampones siguientes: tampón de homogeneización de entrecruzamiento tal como se describe en el apartado 2.2.1.1. Preparar 5x ptampón rotein de carga mediante la mezcla de Tris 300 mM, 10% w / v de SDS, 50% v / v de glicerol, EDTA 25 mM, 0,05% w / v azul de bromofenol, 10% v / v β-mercaptoetanol (opcional); ajustar el pH a 6,8 y se almacena a temperatura ambiente; caliente a 50 ° C antes de su uso. Homogeneizar las células de un mm placa de Petri confluentes 100 (~ 8 x 10 6 células HEK293 si, contó con el uso de un hemocitómetro) como se describe en la Sección 2.2. NOTA: Sacarosa (a 0,3 M) se utiliza para crear un tampón iso-osmótica. Sal, por ejemplo, 120 – 150 mM NaCl o KCl se pueden utilizar en lugar, dependiendo de la proteína oligomérica complejo de interés. Se centrifuga la fracción subcelular post-nuclear a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar los agregados de proteínas y guardar el sobrenadante. Tomar ocho alícuotas de 20 l cada uno (típicamente ~ 20 g de proteína) en distintos tubos de 0,5 ml. Añadir 0,0025% v / v de glutaraldehído a todas las muestras e iniciar el temporizador. Que cada uno de los ocho muestras reaccionan con glutaraldehyde a TA durante: 0, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 60 min. NOTA: El glutaraldehído tiene dos grupos aldehído que reaccionan con aminas libres. Evitar el uso de tampones de pH u otras sustancias con grupos amino primarios porque van a enfriar la reacción glutaraldehído. Detención de la reacción glutaraldehído a la hora especificada con un 2% v hidracina / v y añadir 5 l de tampón de carga de proteína-5x para desnaturalizar las proteínas. Proceder a SDS-PAGE e inmunotransferencia 17.