쥐 C1498 세포주와 관련 백혈병 마우스 모델을 특성화에 대한 자세한 프로토콜

동물 하우징과 모든 실험 절차는 로컬 동물 관리 윤리위원회, CEEA.NPDC (계약 no.512012)을 승인하고, 모든 실험은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 프랑스와 유럽의 지침에 따라 수행되었다. C1498 세포주의 생체 특성 1. C1498 세포의 체외 배양에서 준비 완료 RPMI (로스웰 파크 메모리얼 연구소) 소 태아 혈청의 50 ㎖ (FBS), 페니실린 5ml를 첨가하여 1640 배지 (100 U / ㎖) (100 μg의 / ㎖)과 50mm β 머 캅토 에탄올 500 μL -streptomycin 5 N-2- 히드 록시 에틸-N-2- 에탄 술폰산 (HEPES)의 ㎖, 비 필수 아미노산 5 ㎖ 및 RPMI 배지 500㎖의 피루브산 나트륨 5 ㎖. 전체 RPMI에서 C1498 세포주를 성장. 피펫 팅에 의해 현탁 세포를 수확하고 50 ㎖ 튜브에 세포를 옮긴다. 10 분 동안 350 XG에 원심 분리기 및 superna를 제거중대장. 10 분 동안 350 XG에 인산염 완충 식염수 (PBS) (1 배) 솔루션, 원심 분리기 20 ML을 추가하고, 상층 액을 제거합니다. (10) 형광 – 활성화 된 세포 분류기 (FACS) 버퍼 용액 (소 혈청 알부민 (BSA) 분말 2.5 g 및 2 PBS 용액 500 mL의 0.5 M 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 용액의 ml) 중에 세포를 재현 탁. 트리 판 블루로 세포를 염색 한 후 챔버를 카운팅 토마 세포를 이용하여 세포 수를 계산. C1498 세포주의 표현형 적 특성을 이용하여 면역 분석 유동 세포 계측법 세포 표면 염색 FACS 버퍼를 준비합니다. 107 세포 / ml로 FACS 완충액에서 수확 한 세포를 조정 튜브 유세포로 각각 염색 실험 (100 μL)에 10 6 세포를 분배. FACS 버퍼에 희석 한 다음 항체 또는 관련 이소 컨트롤을 100 ㎕로 세포를 레이블 : m에 대한전구체 및 분화 된 세포의 arkers는 항 -CD11b / 항 CD18 (1) 항 내지 Ly-6G (1), 항 CD19, 항 B220 (2) 항 NK1.1, 안티와 셀 레이블 CD49b, 항 CD4 (1) 항 CD8 (2) 항 CD3 (3), 항 CD21 / 35, 안티 CD115 및 항 TCRVβ 항체. 조혈 줄기 / 선조 세포의 마커, 항 CD34의 조합을 사용 방지 / CD117 / 안티 무서-1, 항 CD150 방지 / CD117 / 안티 무서-1, 항 CD117 / 항 CD127 또는 안티 혼자 CD16 / 32 비오틴 항체. 세포의 기능 (예를 들면, 접착, 항원 제시, 공동 자극 분자와 수용체)의 마커, 항 CD18 (2) / 항 CD11a에 방지 MHC 클래스 I, 항 MHC 클래스 II, 안티으로 세포를 염색 CD31, 항 CD44, 항 CD80 비오틴, 항 CD86 그리고 항 CD274 항체. 30 분 동안 4 ° C에서 튜브 유동 세포 계측법을 모두 품어. 두 번 5 분 동안 350 XG에서 각 튜브에 FACS 버퍼 2 ㎖, 원심 분리기를 추가하여 세포를 씻으, 상층 액을 제거합니다. </리> 각 튜브에 FACS 버퍼 100 μl를 추가하고 비오틴 – 복합 항체 (1/200의 최종 희석 FACS 버퍼에 1/100) 형광 스트렙 타비 딘의 100 μl를 추가하여 차 염색을 진행합니다. 30 분 동안 4 ° C에서 튜브를 품어. 다음과 같이 두 번 세포를 씻으 : 5 분 동안 350 XG에, 각각의 튜브에 원심 분리기 튜브를 FACS 버퍼 2 ㎖를 추가하고 피펫으로 상층 액을 제거합니다. 차가운 PBS 500 μL의 세포를 재현 탁하고, 튜브를 피복하는 알루미늄 박을 사용하여 어두운 곳에서 그들을 유지 얼음 셀을 놓는다. 사이토 (10)를 사용하여 결과를 분석 할 수 있습니다. 세포 내 염색 PBS 용액 375 mL의에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 125 ㎖의 용액을 첨가하여 고정 버퍼를 준비한다. 주 : 환기 후드에 저어 접시에 약 60 ° C에 4 % PFA 500 ml의 열 PBS 용액 400ml를 준비합니다. PFA 분말 20g을 추가하고 pH를 상승PFA까지 용해된다. 이 솔루션은 냉각 6.9로 pH를 조정하고, PBS 500 ml의에 볼륨을 구성 할 수 있습니다. 사포닌 0.5 g 및 PBS 용액 500㎖의 BSA에 0.5 g을 첨가하여 permeabilizing 버퍼를 준비한다. 107 세포 / ml로 FACS 완충액에서 수확 한 세포를 조정 튜브 유세포로 각각 염색 실험 셀 (100 μL)의 106를 배포한다. 5 분 350 XG에서 세포를 원심 분리기 및 뜨는을 제거합니다. 1 % PFA 용액 200 ㎕를 상기 세포를 고정시키고, 4 ℃에서 10 분 동안 배양한다. 5 분 동안 350 XG에, 각각의 튜브에 원심 분리기 튜브를 permeabilizing 버퍼 2 ㎖를 추가하고 피펫으로 상층 액을 제거합니다. 각각의 튜브에 버퍼를 permeabilizing 100 μl를 추가합니다. 버퍼 permeabilizing대로 희석 다음 항체 또는 상응하는 아이소 타입 컨트롤 100 ㎕와 세포를 라벨 : 항 CD3 (2) / 항 CD8 (1) 항 CD3 (3) / ACD4-NTI (2) 항 CD107b 및 항 CD3 (3) / 항 TCRVβ. 30 분 동안 4 ° C에서 세포를 품어. 두 번 각각의 튜브에 버퍼를 permeabilizing 2 ㎖를 추가하여 세포를 씻으십시오. 5 분 350 XG에 튜브를 원심 분리하고, 상층 액을 제거합니다. 세포에 버퍼를 permeabilizing 100 μl를 추가합니다. 비오틴 – 복합 항체 버퍼를 permeabilizing에 희석 형광 스트렙 타비 딘의 100 μl를 추가하여 차 염색을 진행합니다. 30 분 동안 4 ° C에서 튜브를 품어. 각 튜브에 버퍼를 permeabilizing 2 ML을 추가 5 분 동안 350 XG에 튜브를 원심 분리하고, 상층 액을 제거합니다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다. 차가운 PBS 500 μL의 세포를 재현 탁하고 어둠 속에서 얼음에 세포를 배치합니다. (10) 플로우 사이토 미터를 사용하여 결과를 분석한다. 현미경 슬라이드의 세포 현탁액의 제조 은 HA의 워시 (10) (6)차가운 FACS 5 ㎖로한다 (단계 1.1.4에서 얻어진 것) rvested C1498 세포 회 버퍼링 차가운 FACS 완충액 1 ml의 세포를 희석. 얼음에 튜브를 놓습니다. 사전 부착 된 필터 카드와 일회용 챔버에 슬라이드를 올려 놓고 cytocentrifuge에 이들을 배치합니다. 각 챔버 및 필터 카드에 FACS 버퍼 100 μl를 추가하고, 4.52 x g에서 2 분간을 회전. 각 챔버 및 필터 카드에 세포를 100 μl를 추가하고 2 분 동안 4.52 XG에서 세포를 스핀. 조심스럽게 챔버에서 슬라이드를 제거하고 마이 엘 로퍼 옥시 다제 (단계 1.4), 에스 테라 제 (단계 1.5) 또는 5 월 그룬 왈드 김사 (단계 1.6)로 염색하기 전에 슬라이드를 공기 – 건조. 면역에 대한 마이 엘 로퍼 옥시 다제 염색 2 분 동안 용액을 다음 슬라이드를 공기 – 건조 : 아세톤 (1 1 :) 냉 메탄올 슬라이드 침지하여 슬라이드에 세포를 고정한다. 정보원을 그려, 세포를 포함하는 슬라이드의 영역에 액체를 가두발수 펜을 사용하여 세포 주위 rcle. 10 분 동안 차가운 PBS 용액 200 μL의 세포를 씻어. 정상 당나귀 혈청 10 ㎕의 정제 된 항 CD16은 / 32 항체를 10 ㎍ / ml를 함유 3 % BSA / PBS 완충액 200 μL의 셀 블록. (3 % BSA / PBS 완충액에 20 μg의 / ㎖로 희석) 항 마우스 된 myeloperoxidase 200 μL를 적용한다. 습도 챔버에서 4 ° C에서 세포 O / N을 품어. 차가운 0.1 % BSA / PBS 200 μL와 세포를 씻으십시오. 3 % BSA / PBS 버퍼에 1/250로 희석 방지 염소의 IgG 항체의 200 μl를 적용합니다. 습도 챔버에서 RT에서 2 시간 동안 세포를 인큐베이션. 차가운 PBS에 두 번 0.1 % BSA / PBS 버퍼 200 μL와 세포를 3 회 반복합니다. RT에서 2 분간 (1 μg의 / ㎖로 최종 농도) PBS에서 1 / 1,000으로 희석 한 200 ㎕의 훽스트과 세포핵을 염색. 물 슬라이드를 세척하고 mountin 전에 공기 건조에 허용지. 세포에 매체 (1)를 장착 한 방울을 적용, 슬라이드에 커버 유리의 한쪽 끝을 배치하고 신중하게 집게를 사용하여 세포에 그것을 내립니다. 부드럽게 커버 유리에 눌러 기포를 제거합니다. 에스 테라 cytochemistry 참고 : RT에 대한 사전 따뜻한 모든 시약. 정착액 준비 2.5 시트르산 용액 ㎖, 아세톤 6.5 ㎖의 유리 병에 0.8 ml의 37 % 포름 알데히드 추가 시트 레이트 – 아세톤 – 포름 알데히드 (CAF) 용액을 제조 하였다. 부드럽게 믹스와 4 ℃에서 저장한다. 나프톨 AS-D 클로로 에스 테라 제 (CAE) 활동 분석 37 ° C에 따뜻한 탈 이온수. 한 50㎖ 튜브에서, 염료 용액 1 ㎖에 아질산 나트륨 용액 1 ㎖를 추가한다. 부드럽게 믹스 2 분 동안 서 보자. 추가 예열 40㎖의 탈 이온수, 5의 pH 6.3 완충 용액 농축 나프톨 AS-D 클로로 아세테이트 용액 1 ㎖. 믹스와 코 플린 항아리에 전송합니다. 위에 세포를 수정슬라이드 CAF 용액 (단계 1.5.1.1 참조) 30 초 (섹션 1.3 참조), 탈 이온수로 45 초 동안 슬라이드를 씻는다. 1.5.2.2 단계에서 제조 된 용액에 슬라이드 이동하고, 빛으로부터 보호, 습도 챔버 내에서 30 분 동안 37 ° C에서 슬라이드를 배양한다. 슬라이드를 건조 후 2 분 동안 탈 물에 침수를 통해 그들을 씻어. 헤 마톡 실린 용액 몇 방울을 첨가하고, 1 분간을 배양하여 세포를 Counterstain과. 중성 (PH 7)와 슬라이드를 세척하고 자연 건조로 할 수 있습니다. 세포에 매체 (2)를 장착 한 방울을 적용, 슬라이드에 커버 유리의 한쪽 가장자리를 놓고 신중하게 집게를 사용하여 세포에 그것을 내립니다. 부드럽게 커버 유리에 눌러 기포를 제거합니다. 알파 – 나프 부티레이트 에스테라아제 (NBE) 활성 분석 사용하기 전에 37 ° C에 따뜻한 α 나프 틸 부티레이트 솔루션입니다. 나트륨 니트 중 하나 태블릿을 희석탈 이온수 6.25 ml의 의식. 50 ㎖의 튜브에, 아질산 나트륨 정제 용액 1.5 mL로하고 Pararosaniline 용액 1.5 mL로 추가한다. 부드럽게 혼합 용액을 5 분간 방치한다. 인산 완충 용액 40 ml를 가진 솔루션을 보충. 조심스럽게 10 N NaOH를 적가하여 pH를 6으로 가져옵니다. 의 α-나프 틸 부티레이트 솔루션의 5 ML을 추가 전체 솔루션을 혼합하고, 코 플린 항아리로 전송합니다. RT에서 CAF 용액을 사용하여 10 초 동안 슬라이드에 세포를 고정시키고 탈 이온수로 45 초간 린스. 전송 빛으로부터 보호하면서 단계 1.5.3.2에서 제조하고, 습도 챔버 내에서 37 ° C에서 1 시간 동안 함께 부화 된 용액을 함유하는 코 플린 항아리에 슬라이드. 2 중성 물에 분 (PH 7) 공기 건조에 대한 슬라이드를 씻어. 슬라이드에 몇 방울을 추가하여 메틸렌 블루 용액으로 세포를 Counterstain과 4 분 동안 품어. deio에 슬라이드를 담가2 분 동안 물을 nized하고 자연 건조로 할 수 있습니다. , 슬라이드 마운트 세포 매체 (2)를 장착 한 방울을 적용하려면, 슬라이드에 커버 유리의 한쪽 끝을 배치하고 신중하게 집게를 사용하여 세포에 그것을 내립니다. 부드럽게 커버 유리에 눌러 기포를 제거합니다. 월 – 그룬 왈드 김사 (MGG) 염색 3 분 5 월 – 그룬 왈드 솔루션을 포함하는 코 플린 항아리에 슬라이드를 침지하여 (섹션 1.3에서 준비) 세포를 얼룩. 1 분 동안의 pH 6.8 완충액을 함유하는 코 플린 항아리에 슬라이드 이동. 10 분 동안 (pH를 6.8 완충액에 1/20로 희석)을 R 김사 용액을 함유하는 코 플린 병에 넣어서 슬라이드 얼룩. 10 초 동안 중성 (PH 7)와 슬라이드를 씻으십시오. 배수 및 슬라이드를 공기 건조. 세포 상 매체 (2)를 장착 한 방울을 가하여 슬라이드 마운트. 슬라이드에 커버 유리의 한쪽 가장자리를 놓고 조심스럽게 그것을 낮출세포에 집게를 사용. 부드럽게 커버 유리에 눌러 기포를 제거합니다. 생체 개발 2. 및 급성 백혈병의 특성 참고 : 4 주 된 여성 congenic C57BL / 6J-Ly5.1 마우스가 (무균 환경에서, 예) 특정 병원균이없는 조건에서 유지 하였다. 그들은 5 ~ 6 주 오래했다 때 마우스를 주사 하였다. C1498 세포와 정맥 주사 피펫 팅에 의해 현탁액의 배양 C1498 세포를 수확. 10 분 동안 350 XG에 50 ML의 튜브와 원심 분리기에 세포를 전송합니다. 회 냉 PBS 10 ㎖로 세포를 세척하고 PBS에서 107 세포 / ml의 세포 현탁액을 제조. 주사를 수행하기 전에 얼음에 세포 현탁액을 놓습니다. 제한 수단에 마우스를 위치시키고 층류 후드에서 무균 상태에서 주사를 수행한다. 로 세포를 주입 주사기와 29G 바늘을 사용하여꼬리 정맥. 선단에 꼬리를 잡고, 70 % 에탄올에 적신 거즈 스폰지를 소독. 주사기에 기포가 없는지 반드시 확인하고 천천히 꼬리 정맥에 C1498 세포 현탁액 100 ㎕ (10 6 세포)를 주입. 주입 후, 꼬리 바늘을 제거하고, 주사 부위 멸균 거즈 스펀지에 압력을 적용하여 출혈을 제어한다. 다음 시간 일 동안 그 상태를 확인 조심스럽게 케이지에 동물을 반환합니다. 레트로 궤도 혈액 수집 백혈병 질환 (예를 들어, 경직, 그룹에서 분리, 감소 또는 케이지없이 운동)의 흔적에 대한 PBS-및 C1498 주입 마우스의 동작을 모니터링합니다. 참고 : 세포가 주입 된 후이 보통 17 ~ 19 일 사이에 발생합니다. 그냥 안락사 전에 복고풍 궤도 혈액 수집을 수행 층류에서 무균 조건 하에서 (단계 2.2.7 참조)후드와 가열 램프 아래 저체온증을 방지 할 수있다. 마취를 들어, 10 ㎎ / ㎏에서 150 ㎎ / ㎏과 자일 라진에서 케타민을 사용합니다. PBS 용액 18 ㎖에 자일 라진 1.5 케타민 ml의 0.5 ml에 희석하여 마취 솔루션을 준비합니다. 제어 및 백혈병 쥐를 마취. 26G 바늘을 사용하여 마우스의 10g 당 마취 용액 200 μL의 복강 내 주사하고 1 ML의 주사기를 진행합니다. 마취를 확인하기 위해 페달 반사의 손실을 확인합니다. 눈의 안쪽 눈구석에 모세관 튜브를 삽입합니다. 혈액은 모세관 튜브 내로 안와 부비동에서 일어날 것이다. 부드럽게 멸균 거즈 스펀지 눈에 압력을 적용하여 출혈을 제어한다. 주 : 혈액 100-200 μL의 양이이 방법을 사용하여 회수 할 수있다. EDTA 튜브 내로 혈액을 수집하고, 단핵 세포를 분리하기 전에 얼음에 샘플을 저장한다. 경추 탈구를 사용하여 마우스를 안락사 및장기 (2.3 절)을 분리로 진행합니다. 장기 및 세포 분리 장기 격리 플라스틱 보드의 후면 상에 안락사 마우스를 놓고 기관의 분리를 용이하게하기 위해 동물의 발을 고정하기 위해 바늘을 사용합니다. 절개를 수행하기 전에 70 % 에탄올을 사용하여 마우스를 소독. 멸균 가위를 사용하여, 목 복부 피부에서 복부 절개를 수행한다. 간 액세스 할 복벽의 실수. 흉곽과 폐에 액세스 할 수있는 격막을 잘라. 옆에 장을 이동하고 멸균 가위와 집게를 사용하여 비장을 제거합니다. 골수를 분리하기 위해, 멸균 가위를 사용하여 상기 대퇴골 관절의 상단에서 다리를 잘랐다. 부드럽게 잡아 당겨 대퇴골의 경골을 분리하고 집게와 가위를 사용하여 뼈의 피부와 근육을 제거합니다. 차가운 PBS가 포함 된 50 ML 튜브의 각 장기와 뼈를 배치하고 얼음에 배치합니다. 기관에서 세포의 분리 세포를 파괴하기 전에 비장의 무게를. 기계적 50 ㎖ 튜브에서 주사기 플런저를 사용하여 70 ㎛의 여과기를 통해 가압하여 비장, 폐 및 간을 방해하고, 차가운 PBS 30 ㎖ 중에 세포를 수집한다. 골수 세포를 수집 얼음 페트리 접시의 대퇴골과 경골을 넣어 멸균 가위를 사용하여 사지 절단, 차가운 PBS 5 ㎖를 함유하는 10 mL의 주사기에 부착 26G 바늘을 삽입하여 골수를 플러시. 니들 / 주사기를 통해 세포 현탁액을 전달하여 골수 세포를 파괴하고 50 ㎖ 튜브에서 70 ㎛의 여과기를 통하여 세포 현탁액을 필터. 원심 10 분 동안 350 XG에 장기 및 골수 세포를 각각 함유하는 모든 튜브. 상층 액을 제거하고,이 세포 용해 완충액 ㎖ (1X) 및 셀 내에서 폐, 골수로부터 수집 한 세포를 재현 탁부드럽게 상하 혼합물을 피펫 팅하여 세포 용해 완충액 (1X) 5 ml의 간 및 비장에서 분리 s는. 차가운 PBS와 50ml로 튜브를 입력합니다. 10 분 동안 350 XG에서 세포를 원심 분리기. 유동 세포 계측법 분석 FACS 완충액에 세포를 재현 탁하거나 현미경 세포를 제조 하였다. 트리 판 블루로 염색 한 후 토마 셀 카운팅 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 유동 세포 계측법 분석을 위해 기관에서 분리 된 세포의 세포 표면 얼룩 튜브 유세포 라벨 FACS 완충액 100 ㎕에서 정제 된 항 CD16은 / 32 항체 10 μg의 / ㎖으로 기관으로부터 분리 된 106 세포. 106 골수 세포, FACS 완충액에 희석 한 다음 항체 또는 이들 항체의 자신의 상응하는 아이소 타입 컨트롤 100 ㎕를 추가 항 -CD11b / 항 CD3 (1) / 항 Ly6C / 안티 Ly6G (2) 항 B220 (1) /anti-CD45.2/anti-CD19 방지 CD115 / 항 CD3 (1) /TI-Ly6C / 안티 Ly6G (2) 항 CD45.2 방지 Ly6G (2) 항 -CD11b, 항 CD115 또는 단독 보정 설정 안티 CD19. 비장 세포, FACS 완충액에 희석 된 100 다음 항체 μL 및 해당 아이소 타입 컨트롤을 추가 / 항 CD3 (1) / 항 Ly6C이 방지 / Ly6G (2) 항 B220 항 -CD11b의 조합 (1, ) /anti-CD45.2/anti-CD19 방지 CD45.2 방지 Ly6G (2) 항 -CD11b 또는 보정 설정 안티 CD19. 폐와 간 세포에, 100 항 CD45.2 항체의 μL 및 FACS 버퍼에 1/100로 희석 해당 아이소 타입 컨트롤을 추가합니다. 4 ° C에서 30 분 동안 셀 솔루션을 모두 품어. 각 튜브를 FACS 완충액 2 ㎖를 첨가하여 세포를 세척 하였다. 350 XG에 5 분 동안 튜브를 원심 분리기와 피펫으로 상층 액을 폐기. 이 단계를 한 번 더 반복합니다. 차가운 PBS 500 μL에 표시된 세포를 재현 탁. 얼음에 세포를 유지하고 교류를위한 유동 세포 계측법을 수행하기 전에 빛으로부터 보호quisition 및 분석 10. 유세포 분석을위한 혈액 단핵 세포와 면역 염색의 단리 프로토콜을 시작하기 전에, RT로 분리 용액을 미리 가온. 미세 원심 분리 관에 (단계 2.2에서 얻어진 100 내지 200 μL), 용액의 부피 500 μL 때까지 PBS / 1 mM의 EDTA 용액을 추가 혈액 샘플을 전송. 조심스럽게 30G 바늘 및 1 mL의 주사기를 이용하여 혈액을 함유하는 용액 하에서 분액 500 ㎕를 계층. 혈액과 분리 솔루션을 함께 사용하지 마십시오. 실온에서 20 분 동안 (브레이크없이) 800 XG에 튜브를 원심 분리기. 원심 분리 후, 피펫을 사용하여 세포 링 (불투명 한 흰색 층)을 수집합니다. 미세 원심 튜브에 세포를 전송합니다. 주 : 불투명 한 백색 층은 림프구뿐만 아니라 단핵구를 포함하며, 하부 층 사이에 나타나는 – 분리 용액 – 상층. 1 ML을 추가PBS 용액에서 원심 분리를 10 분 동안 350 XG에 튜브. FACS 완충액 600 ㎕를 상기 세포를 재현 탁. (100 μL 각)를 정제 항 CD16 / 32 항체의 10 ㎍ / ㎖의 추가 여섯 별도의 튜브에 세포 현탁액 100 μl를 배포 할 수 있습니다. FACS 완충액에 희석 한 다음 항체 또는 관련 이소 타입 컨트롤 100 ㎕에 세포를 라벨 : (1) / 항 B220 (1) /anti-CD45.2 안티 Ly6C 방지 / CD115 항 CD3의 조합을 /anti-CD45.2 또는 항 CD45.2 혼자 보상 설정에 대한 안티 CD115. 30 분 동안 39 ° C에서 튜브 모든 부화. 각 튜브에 FACS 버퍼 2 ㎖를 첨가하여 세포를 세척 한 다음 350 XG에 10 분 동안 튜브를 원심 분리하고, 피펫을 사용하여 상층 액을 버린다. 500 μl의 차가운 PBS에 표시된 세포를 재현 탁. 얼음에 세포를 유지하고 수집 및 분석 (10) 유동 세포 계측법을 수행하기 전에 빛으로부터 보호. 현미경 슬라이드에 골수 세포 현탁액의 제조 1.3 절에 설명 된 단계를 수행하지만, 단계 1.3.1에서 10 분 동안 72.26 XG에서 각 챔버에 세포를 10 5 골수 세포를 사용하고, 단계 1.3.4에서, 스핀. 에스 테라 제 활성 분석 골수 세포를 사용하여 골수 에스 테라 제의 cytochemistry 분석을 수행하려면, 단계 1.5.3.7 1.5에서 진행합니다. 골수 세포의 Grunwald 월 – 김사 염색 골수 세포를 염색하기 위해, 1.6 절에 설명 된 프로토콜을 수행하되, 단계 1.6.1에서 5 분 동안 5-6의 Grunwald 용액 슬라이드를 배양한다.