Een gedetailleerd protocol voor het karakteriseren van het Muizen C1498 Cell Line en de bijbehorende Leukemie muismodel
Summary
Het manuscript geeft een technische procedure die kan worden gebruikt om C1498 celkweken karakteriseren in vitro en acute leukemie geïnduceerd in muizen na de injectie. Fenotypische en functionele analyses worden uitgevoerd met behulp van flowcytometrie, immunofluorescentie microscopie, cytochemie en May-Grünwald Giemsa kleuring.
Abstract
De intraveneuze injectie van C1498-cellen in syngene of congene muizen is uitgevoerd sinds 1941. Deze injecties leiden tot de ontwikkeling van acute leukemie. De aard van deze ziekte is nog niet goed gedocumenteerd in de literatuur. Hier geven we een technisch protocol voor het karakteriseren van C1498-cellen in vitro en voor het bepalen van de aard van de geïnduceerde leukemie in vivo. Het eerste deel van deze procedure is gericht op het bepalen van hematopoietische afkomst en het stadium van differentiatie van gekweekte cellen C1498. Hiertoe wordt meerdere parametrische flowcytometrische kleuring gebruikt om hematopoietische cel markers detecteren. Immunofluorescentiemicroscopie, cytochemie en May-Grünwald Giemsa kleuring worden vervolgens uitgevoerd om de expressie van myeloperoxidase, de activiteit van esterases en cellulaire morfologie beoordelen respectievelijk. Het tweede deel van dit protocol is gewijd aan het beschrijven van de leukemie ziekte die wordt opgewekt devivo. Dit laatste kan worden bereikt door het bepalen van de frequentie van leukemische en inherent cellen in het bloed, hematopoëtische organen (bijvoorbeeld, beenmerg en milt) en niet-lymfoïde weefsel (zoals lever en longen) met specifieke kleuring en flowcytometrie analyse. De aard van de leukemie wordt vervolgens bevestigd met May-Grünwald Giemsa kleuring en kleuring voor specifieke esterasen in het beenmerg. Hier presenteren we de resultaten die werden verkregen met behulp van dit protocol in vergelijkbare leeftijd C1498- en PBS-geïnjecteerde muizen.
Introduction
Acute myeloïde leukemie (AML) wordt gekenmerkt door een ongecontroleerde proliferatie van hematopoietische myeloïde cellen die zijn geblokkeerd in verschillende stadia van rijping. Deze ontregeling kan invloed hebben op de granulocyten, monocyten, erythrocytaire of megaryocytic differentiatieomzettingswegen 1. AML cellen accumuleren in het beenmerg, wat leidt tot verminderde hematopoiese, waardoor trombopenie, lymfopenie en anemie. De leukemische cellen ook binnenvallen het bloed en niet-lymfoïde organen.
De C1498 muismodel wordt al tientallen jaren als een model voor acute leukemie omdat kankercellen van een leukemische 10 maanden oude C57BL / 6 (H-2 b) vrouwtjes werden geïsoleerd in 1941. De literatuur beschrijft de invasie in het bloed , hematopoëtische organen (bijvoorbeeld de milt en lymfeknopen) en niet-hematopoëtische organen (bijvoorbeeld de lever, longen, ovaria en nieren) door zeer proliferatieve C1498 cellen nadat ze werden geïnjecteerd via een ininjecterende, subcutaan of intra-peritoneale route in gevoelige muizen 2-4. Echter was dit muismodel gerapporteerd ofwel granulocytaire 2,5 of 6 myeloïde leukemie veroorzaken. Meer recent een studie gepubliceerd in 2002 beschreef deze vorm van kanker als muizen NKT cel leukemie 7. Aldus verschilt de literatuur betreffende de aard van deze cellijn C1498 en bijbehorende leukemie induceert bij muizen. Deze verschillen zijn voornamelijk te wijten aan een gebrek aan gedetailleerde en actuele gepubliceerde informatie over de cellen en de leukemische ziekten in het algemeen, omdat veel studies werden uitgevoerd in de 1950-1970's.
Hier hebben we een gedetailleerd protocol te beschrijven hoe C1498 cellen te karakteriseren en de aard van de leukemische ziekte die wordt geïnduceerd door de intraveneuze injectie in muizen geanalyseerd. Het eerste deel van dit protocol is gewijd aan een beschrijving van C1498-cellen die zijn gekweekt in vitro. fluorescerende antilichamen tegen oppervlak en intracellulaire hematopoïetische merkers werden gebruikt om het fenotype te bepalen middels flowcytometrie. De aanwezigheid van myeloperoxidase werd beoordeeld met behulp van immunofluorescentie microscopie, werden de hematopoietische afkomst en differentiatiestadium geëvalueerd met cytochemie de activiteit van esterasen beoordelen en May-Grünwald Giemsa kleuring werd uitgevoerd. De C1498 cellen werden vervolgens geïnjecteerd in muizen, en de acute leukemie ziekte die geïnduceerd wordt beschreven in het tweede deel van dit manuscript. Dezelfde technieken werden gebruikt om de frequenties en de fenotypen van leukemische cellen en inherent in het beenmerg, perifeer bloed, milt en non-hematopoïetische organen (lever en longen) te bepalen.
Dit protocol is zeer reproduceerbaar en de hier gepresenteerde gegevens helpt onderzoekers om de effecten van nieuwe therapeutische strategieën te beoordelen. Dit leukemie muismodel is al gebruikt om te testen immunotherapie benaderingen eennd verschillende kanker chemotherapeutische geneesmiddelen 8,9. Hun effectiviteit werd geëvalueerd door bepaling van de ontwikkeling van tumorlast overlevingskansen. Dit protocol kan worden gebruikt om extra informatie over de verdeling en verblijfkosten van leukemie en andere hematopoietische celpopulaties tijdens de behandeling te bieden.
Protocol
Stalruimte en alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de lokale Animal Care Ethische Commissie, CEEA.NPDC (overeenkomst no.512012), en alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Franse en Europese richtlijnen voor de zorg en het gebruik van proefdieren. 1. In vitro karakterisering van de C1498 Cell Line In vitro kweek van C1498-cellen Bereid compleet RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 medium door toevoeging van 50 ml foetaal runderserum (FBS), 5 ml penicilline (100 U / ml) -streptomycin (100 ug / ml), 500 ui 50 mM β-mercaptoethanol , 5 ml N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethaansulfonzuur (HEPES), 5 ml van niet-essentiële aminozuren en 5 ml natriumpyruvaat tot 500 ml RPMI medium. Groeien de C1498-cellijn in volledige RPMI. Oogst de cellen in suspensie door pipetteren en breng de cellen om een 50 ml buis. Centrifugeren bij 350 g gedurende 10 min, en verwijder de Supernatant. Voeg 20 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (1x) oplossing, centrifugeer bij 350 xg gedurende 10 min en de bovenstaande vloeistof. Resuspendeer de cellen in 10 ml Fluorescence-Activated Cell Sorter (FACS) buffer (2,5 g runderserumalbumine (BSA) poeder en 2 ml 0,5 M ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) oplossing in 500 ml PBS-oplossing). Tel de cellen met een cel Thoma telkamer na kleuring van de cellen met trypan blauw. Fenotypische karakterisering van de C1498-cellijn met behulp van immunologische en Flowcytometrieanalyse Celoppervlak kleuring Bereid FACS-buffer. Stel de geoogste cellen in FACS buffer 10 7 cellen / ml en verdeel 10 6 cellen (in 100 pl) per experiment met kleuring in flowcytometrie buizen. Label de cellen met 100 ul van de volgende antilichamen of hun bijbehorende isotype controles verdund in FACS-buffer: voor markers precursor en gedifferentieerde cellen labelen van de cellen met anti-CD 11 b / anti-CD18 (1), anti-Ly-6G (1), anti-CD19, anti-B220 (2), anti-NK1.1, anti- CD49b, anti-CD4 (1), anti-CD8 (2), anti-CD3 (3), anti-CD21 / 35, anti-CD115 en anti-TCRVβ antilichamen. Voor hematopoïetische stamcellen / voorlopercellen markers, een combinatie van anti-CD34 / anti-CD117 / anti-Sca-1, anti-CD150 / anti-CD117 / anti-Sca-1, anti-CD117 / anti-CD127 of anti- CD16 / 32-biotine antilichamen alleen. Voor markers van celfuncties (bijvoorbeeld hechting, antigeenpresentatie, co-stimulerende moleculen en receptoren), vlekken de cellen met anti-CD18 (2) / anti-CD 11 a, anti-MHC klasse I, anti-MHC klasse II anti- CD31, anti-CD44, anti-CD80-biotine, anti-CD86 en anti-CD274 antilichamen. Incubeer alle flowcytometrie buizen bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Was de cellen tweemaal door toevoeging van 2 ml FACS-buffer aan elke buis, centrifugeer bij 350 xg gedurende 5 minuten en de bovenstaande vloeistof. </li> Voeg 100 gl FACS buffer aan elke buis en ga naar secundair kleuring door toevoeging van 100 pl fluorescent streptavidine (1/100 in FACS buffer voor een eindverdunning van 1/200) aan de gebiotinyleerde-geconjugeerde antilichamen. Incubeer de buizen bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Was de cellen tweemaal als volgt: voeg 2 ml FACS-buffer aan elke buis Centrifugeer de buizen bij 350 g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant door pipetteren. Resuspendeer de cellen in 500 ul koud PBS en plaats de cellen op ijs, waardoor ze in het donker met aluminiumfolie om de buizen te dekken. Analyseer resultaten met een cytometer 10. intracellulaire kleuring Bereid fixatie buffer door toevoeging van 125 ml van een 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing van 375 ml van PBS-oplossing. OPMERKING: Aan 500 ml van 4% PFA, hitte 400 ml PBS-oplossing op een roerplaat bereiden tot ongeveer 60 ° C in een geventileerde afzuigkap. Voeg 20 g PFA poeder, en de pH te verhogentotdat de PFA opgelost. Laat de oplossing afkoelen, breng de pH op 6,9, en vul aan tot 500 ml met PBS. Bereid de permeabilisatie buffer door het toevoegen van 0,5 g saponine en 0,5 g BSA tot 500 ml PBS oplossing. Stel de geoogste cellen in FACS buffer 10 7 cellen / ml en verdeel 10 6 van de cellen (100 ui) voor elk experiment met kleuring in flowcytometrie buizen. Centrifugeer de cellen op 350 xg gedurende 5 minuten, en verwijder het supernatant. Fixeer de cellen in 200 gl 1% PFA-oplossing en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Voeg 2 ml van permeabilisatie buffer aan elke buis, centrifuge de buizen bij 350 g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant door pipetteren. Voeg 100 pl permeabilisatie buffer aan elke buis. Label de cellen met 100 ul van de volgende antilichamen of hun overeenkomstige isotype controles na uithollen in permeabilisatie buffer: anti-CD3 (2) / anti-CD8 (1), anti-CD3 (3) / anti-CD4 (2), anti-CD107b en anti-CD3 (3) / anti-TCRVβ. Incubeer de cellen bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Was de cellen tweemaal door toevoeging van 2 ml permeabilisatie buffer aan elke buis. Centrifugeer de buizen bij 350 g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Voeg 100 pl buffer doordringbaar aan de cellen. Overgaan tot secundaire kleuring door toevoeging van 100 pl fluorescerende streptavidine verdund in permeabilisatie buffer gebiotinyleerd geconjugeerde antilichamen. Incubeer de buizen bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Voeg 2 ml permeabilisatie buffer aan elke buis, centrifuge de buizen bij 350 g gedurende 5 minuten en de bovenstaande vloeistof. Herhaal deze stap nog een keer. Resuspendeer de cellen in 500 ul koud PBS, en plaats dan de cellen op ijs in het donker. Analyseer de resultaten met een flow cytometer 10. Bereiding van een celsuspensie op objectglaasjes voor microscopie Wash 10 6 van de harvested C1498 cellen (verkregen in stap 1.1.4) met 5 ml koude FACS-buffer tweemaal, en verdun de cellen in 1 ml koude FACS-buffer. Plaats de buizen op ijs. Plaats de dia's in wegwerp camera met vooraf bevestigd filter en leg deze in een cytocentrifuge. Voeg 100 gl FACS buffer aan elke kamer en filterkaart en draaien ze gedurende 2 min bij 4,52 x g. Voeg 100 ul van cellen aan elke kamer en filterkaart en draai de cellen bij 4,52 xg gedurende 2 minuten. Haal de dia's uit de kamers en air-Droog de glaasjes voor hen kleuring met myeloperoxidase (stap 1.4), esterases (stap 1.5) of May-Grünwald Giemsa (stap 1.6). Myeloperoxidase kleuring voor immunofluorescentie Fixeer de cellen op de objectglaasjes door onderdompeling van de objectglaasjes in een koude methanol: aceton (1: 1) oplossing gedurende 2 minuten, en vervolgens aan de lucht drogen de glaasjes. De vloeistof beperken tot het gebied van de dia met de cellen, teken een circle rond de cellen met een waterafstotend pen. Spoel de cellen in 200 ul koud PBS gedurende 10 min. Blokkeer de cellen in 200 gl 3% BSA / PBS buffer die 10 pl normale ezel serum en 10 ug / ml gezuiverd anti-CD16 / 32 antilichamen. Toepassen 200 ul van anti-muis myeloperoxidase (verdund tot 20 ug / ml in 3% BSA / PBS buffer). Incubeer de cellen O / N bij 4 ° C in een vochtige kamer. Was de cellen met 200 pi koude 0,1% BSA / PBS. Toepassen 200 ul van anti-geit IgG antilichamen verdund 1/250 in 3% BSA / PBS buffer. Incubeer de cellen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in een vochtige kamer. Was de cellen 3 maal met 200 gl 0,1% BSA / PBS-buffer en tweemaal met koud PBS. Vlekken de celkernen met 200 ul Hoechst verdund tot 1/1000 in PBS (tot een eindconcentratie van 1 ug / ml) gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Was de dia's met water en laat ze aan de lucht drogen alvorens mounting. Breng één druppel 1 montage medium aan de cellen plaats een rand van het dekglas op de dia en kantel het naar de cellen met behulp van een tang. Druk voorzichtig op de cover-glas om eventuele luchtbellen te verwijderen. esterase cytochemie Let op: Pre-warm alle reagentia tot kamertemperatuur. fixatief voorbereiding Aan de oplossing citraat-aceton-Formaldehyde (CAF) te bereiden, voeg 2,5 ml citraatoplossing 6,5 ml aceton en 0,8 ml 37% formaldehyde aan een glazen fles. Meng voorzichtig en bewaar bij 4 ° C. Naftol AS-D chlooracetaat esterase (CAE) activiteit assay Warm gedeïoniseerd water tot 37 ° C. In een 50 ml buis, voeg 1 ml natriumnitriet oplossing 1 ml kleurstofoplossing. Meng voorzichtig en laat gedurende 2 minuten. Voeg 40 ml voorverwarmd gedemineraliseerd water, 5 ml van pH 6,3 buffer concentraat en 1 ml naftol AS-D chlooracetaat oplossing. Mix en overbrengen in een Coplin pot. Fixeer de cellen op dedia's (zie paragraaf 1.3) gedurende 30 seconden met CAF-oplossing (zie stap 1.5.1.1), en was de dia's voor 45 sec met gedemineraliseerd water. Breng de dia's in de oplossing die bereid is in stap 1.5.2.2 en incubeer de objectglaasjes bij 37 ° C gedurende 30 min in een vochtige kamer beschermd tegen licht. Droog de dia's en spoel ze via onderdompeling in gedemineraliseerd water gedurende 2 minuten. Tegenkleuring de cellen door toevoeging van enkele druppels hematoxyline oplossing en incuberen hen 1 min. Was de dia's met neutraal water (pH 7) en laat ze aan de lucht drogen. Breng één druppel montage medium 2 aan de cellen plaats een rand van het dekglas op de glijbaan en voorzichtig zakken op de cellen met behulp van een tang. Druk voorzichtig op de cover-glas om eventuele luchtbellen te verwijderen. Alpha-naftyl butyraat esterase (NBE) activiteit assay Warm α-naftyl butyraat oplossing tot 37 ° C voor gebruik. Verdun één tablet natrium nitrite in 6,25 ml gedemineraliseerd water. In een 50 ml buis, voeg 1,5 ml natriumnitriet tabletoplossing en 1,5 ml van een oplossing Pararosaniline. Meng voorzichtig en laat de oplossing gedurende 5 minuten staan. Vullen de oplossing met 40 ml fosfaat gebufferde oplossing. Breng aan de pH 6 met 10 N NaOH druppelsgewijs voorzichtig toe te voegen. Voeg 5 ml van de α-naftyl butyraat oplossing, meng de volledige oplossing, en deze hoeveelheid in een Coplin jar. Fixeer de cellen op de objectglaasjes gedurende 10 seconden met het CAF oplossing bij kamertemperatuur en 45 seconden spoelen met gedeïoniseerd water. Transfer glijdt in de Coplin pot met de oplossing die bereid is in stap 1.5.3.2 en incubeer samen 1 uur bij 37 ° C in een vochtige kamer terwijl beschermd tegen licht. Spoel de dia's voor 2 min in neutraal water (pH 7) en de lucht drogen. Tegenkleuring de cellen met methyleenblauw door toevoeging van enkele druppels van de glijbaan en incubeer gedurende 4 min. Dompel de dia's in Deioseerd water gedurende 2 minuten en laat ze aan de lucht drogen. De dia monteren één druppel montage medium 2 aan de cellen toe te passen, plaatst een rand van het dekglas op de dia en kantel het naar de cellen met behulp van een tang. Druk voorzichtig op de cover-glas om eventuele luchtbellen te verwijderen. May-Grünwald Giemsa (MGG) kleuring Vlekken op de cellen (bereid in paragraaf 1.3) door onderdompeling van de dia's in een Coplin pot met May-Grünwald oplossing voor 3 min. Breng de dia in een Coplin pot met pH 6,8 bufferoplossing gedurende 1 min. Vlekken op de dia's door ze in een Coplin pot met de Giemsa R-oplossing (verdund tot 1/20 in pH 6,8 bufferoplossing) gedurende 10 min. Was de dia's met neutraal water (pH 7) voor 10 sec. Giet ze af en air-droog de dia's. Monteer de dia's door het aanbrengen van een druppel van montage medium 2 op de cellen. Leg één rand van de cover-glas op de dia en kantel het opde cellen met behulp van een tang. Druk voorzichtig op de cover-glas om eventuele luchtbellen te verwijderen. 2. In vivo Ontwikkeling en karakterisering van acute leukemie OPMERKING: Vier weken oude vrouwelijke congenic C57BL / 6J-muizen werden Ly5.1 onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden gehouden (dat wil zeggen, in een steriele omgeving). De muizen werden geïnjecteerd wanneer deze tussen 5 en 6 weken oud waren. Intraveneuze injectie met C1498 cellen Oogst de gekweekte cellen in C1498 schorsingen door pipetteren. Overdracht van de cellen om een 50 ml buis en centrifugeer bij 350 xg gedurende 10 min. Was de cellen in 10 ml koude PBS tweemaal, en stelt een celsuspensie van 10 7 cellen / ml in PBS. Plaats de celsuspensie op ijs voordat de injectie. Plaats de muis in een weerhouder en het uitvoeren van de injectie onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming kap. Gebruik een 29G naald met een injectiespuit naar de cellen in de spuitenstaartader. Pak de staart aan het distale einde en gedesinfecteerd met een gaasje spons gedrenkt in 70% ethanol. Controleer om zeker te zijn dat er geen luchtbellen in de spuit, en dan langzaam injecteer 100 ul van de C1498 celsuspensie (10 6 cellen) in de staartader. Na de injectie, verwijder de naald uit de staart, en de eventuele bloeden te controleren door druk uit te oefenen met een steriel gaasje spons op de injectieplaats. Breng het dier naar zijn kooi, en goed te controleren zijn gezondheid in de komende uren en dagen. Retro orbitale bloedafname Monitor het gedrag van de PBS en C1498-geïnjecteerde muizen tekenen van leukemische ziekten (bijvoorbeeld, pilo-erectie, los van de groep, en verminderde of geen beweging in de kooi). NB: Dit gebeurt meestal tussen de 17 tot 19 dagen na de cellen worden geïnjecteerd. Voer retro orbitale bloedafname vlak voor euthanasie (zie stap 2.2.7) onder steriele omstandigheden in een laminaire stromingafzuigkap en onder een warmtelamp om onderkoeling te voorkomen. Voor anesthesie Gebruik ketamine 150 mg / kg en xylazine 10 mg / kg. Bereid de verdoving oplossing door verdunning 1,5 ml ketamine en 0,5 ml xylazine in 18 ml PBS-oplossing. Verdoven de controle en leukemische muizen. Doorgaan met een intraperitoneale injectie van 200 ul van het anestheticum per 10 gram muis met behulp van een 26G naald en een 1 ml injectiespuit. Controleer voor het verlies van het pedaal reflex om anesthesie te bevestigen. Plaats een capillaire buis in de mediale ooghoek van het oog. Bloed zal stijgen van de orbitale sinus in de capillaire buis. Controle van de bloeden door voorzichtig druk uit te oefenen op het oog met een steriel gaasje spons. OPMERKING: Een volume van 100-200 gl bloed kunnen worden verzameld met behulp van deze techniek. Verzamel het bloed in een EDTA buis, en op te slaan van het monster op het ijs voor het isoleren van de mononucleaire cellen. Euthanaseren de muis met behulp van cervicale dislocatie, enga dan naar de organen (paragraaf 2.3) te isoleren. Organen en cellen isolatie organen isolatie Plaats de inslapen muis op zijn rug op een plastic bord en het gebruik van naalden aan de voeten van het dier vastmaken aan orgel isolement te vergemakkelijken. Ontsmet de muis met behulp van 70% ethanol voor het uitvoeren van een insnijding. Met behulp van een steriele schaar, het uitvoeren van een ventrale incisie van de buikhuid aan de nek. Knip de buikwand om de lever. Knip de ribbenkast en het membraan om de longen. Verplaats de darm naar de zijkant en verwijder de milt met steriele scharen en pincetten. Naar het beenmerg te isoleren, snijd de poten aan de bovenkant van de dijbenen boven het gewricht met behulp van steriele schaar. Koppel het scheenbeen van het femur door zachtjes te trekken, en verwijder de huid en spieren van de botten met behulp van pincet en een schaar. Plaats elk orgaan en been in een 50 ml buis met koude PBS, en leg ze op ijs. Isolatie van cellen van de organen Weeg de milt voor het verstoren van de cellen. Mechanisch verstoren de milt, longen en lever door erop te drukken door een 70 urn zeef met een zuiger in een 50 ml buis en verzamel de cellen in 30 ml koude PBS. Voor het verzamelen van beenmergcellen, zet de dijbenen en scheenbeen in een petrischaal op ijs, snijd de uiteinden met steriele schaar en spoelen van het beenmerg door het invoegen van een 26G naald bevestigd aan een 10 ml spuit met 5 ml koud PBS. Breek de beenmergcellen door het passeren van de celsuspensie door de naald / spuit en filter de celsuspensie door een 70 urn zeef in een 50 ml buis. Centrifuge alle buizen met elk van de organen en de beenmergcellen bij 350 xg gedurende 10 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de vanuit de longen en beenmerg in 2 ml lysis buffer (1x) en de cel cellens geïsoleerd uit de lever en milt in 5 ml lysis buffer (1x) door voorzichtig pipetteren het mengsel en neer. Vul de buizen 50 ml met koude PBS. Centrifugeer de cellen bij 350 xg gedurende 10 min. Resuspendeer de cellen in FACS buffer voor flowcytometrie analyse of om de cellen te bereiden voor microscopie. Tel de cellen met behulp van een Thoma cel telkamer na hen kleuring met trypan blauw. Celoppervlak kleuring van cellen geïsoleerd uit organen voor flowcytometrieanalyse In een flowcytometrie buis label 10 6 cellen die werden geïsoleerd uit organen met 10 ug / ml gezuiverd anti-CD16 / 32 antilichamen in 100 ui FACS-buffer. Tot 10 6 beenmergcellen, voeg 100 ul van de volgende antilichamen of combinaties van antilichamen en hun overeenkomstige isotype controles verdund in FACS buffer: anti-CD11b / anti-CD3 (1) / anti-Ly6C / anti-Ly6G (2), anti-B220 (1) /anti-CD45.2/anti-CD19, anti-CD115 / anti-CD3 (1) / eenti-Ly6C / anti-Ly6G (2), anti-CD45.2, anti-Ly6G (2), anti-CD 11, anti-CD115 of anti-CD19 alleen om schadevergoeding instellingen. Om splenocyten, voeg 100 ul van de volgende antilichamen en hun overeenkomstige isotype controles verdund in FACS buffer: een combinatie van anti-CD 11 b / anti-CD3 (1) / anti-Ly6C / anti-Ly6G (2), anti-B220 (1 ) /anti-CD45.2/anti-CD19, anti-CD45.2, anti-Ly6G (2), anti-CD 11 of anti-CD19 compensatie instellingen. Long en levercellen, voeg 100 pl anti-CD45.2 antilichamen en de bijbehorende isotype controle 1/100 verdund in FACS-buffer. Incubeer alle mobiele oplossingen gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Was de cellen door toevoeging van 2 ml FACS-buffer aan elke buis. Centrifugeer de buisjes gedurende 5 min bij 350 xg en werp de supernatant door pipetteren. Herhaal deze stap nog een keer. Resuspendeer het gemerkte cellen in 500 ul koud PBS. Houd de cellen op ijs en beschermd tegen licht voor het uitvoeren van flowcytometrie voor acinquisitie en analyse 10. Isolatie van mononucleaire cellen en immunofluorescentie kleuring voor flowcytometrieanalyse Voordat het protocol, pre-verwarm de oplossing tot kamertemperatuur scheiden. Breng het bloedmonster (100 tot 200 pl, verkregen uit stap 2.2) in een microcentrifugebuis en voeg PBS / 1 mM EDTA-oplossing tot de oplossing volume 500 pl. laag voorzichtig 500 pi oplossing onder scheiden van de oplossing die het bloed met behulp van een 30G naald en een 1 ml injectiespuit. Mis het bloed en de scheidende oplossing niet mengen. Centrifugeer de buizen bij 800 xg (zonder rem) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Na het centrifugeren, het verzamelen van de cellulaire ring (de ondoorzichtige witte laag) met behulp van een pipet. Overdracht van de cellen naar een microcentrifugebuis. OPMERKING: De ondoorzichtige witte laag bevat lymfocyten en monocyten en verschijnt tussen de onderlaag – de scheidingslaag oplossing – en de bovenlaag. Voeg 1 mlPBS oplossing en centrifugeer de buis bij 350 xg gedurende 10 min. Resuspendeer de cellen in 600 ui FACS-buffer. Voeg 10 ug / ml gezuiverd anti-CD16 / 32 antilichamen en distribueren 100 ul van de celsuspensie in zes afzonderlijke buizen (100 pi elk). Label de cellen met 100 ul van de volgende antilichamen of hun bijbehorende isotype controles verdund in FACS buffer: een combinatie van anti-CD3 (1) / anti-B220 (1) /anti-CD45.2 en anti-Ly6C / anti-CD115 /anti-CD45.2 of anti-CD45.2 en anti-CD115 alleen voor compensatie-instellingen. Incubeer alle buizen bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Was de cellen door toevoeging van 2 ml FACS-buffer aan elke buis en centrifugeer de buis gedurende 10 minuten bij 350 xg en verwijder het supernatant met een pipet. Resuspendeer het gemerkte cellen in 500 ul koud PBS. Houd de cellen op ijs en beschermd tegen licht voor het uitvoeren van flowcytometrie acquisitie en analyse 10. Bereiding van beenmerg celsuspensies op objectglaasjes voor microscopie Volg de stappen in paragraaf 1.3 beschreven, maar in stap 1.3.1, gebruiken 10 5 beenmergcellen, en in stap 1.3.4, draai de cellen in elke kamer op 72,26 g gedurende 10 min. Esterase activiteit assays met behulp van beenmergcellen Om het beenmerg esterase cytochemie assays voeren, gaat van stap 1,5 tot 1.5.3.7. May-Grünwald Giemsa kleuring van beenmergcellen Om beenmergcellen vlek, volg dan de in paragraaf 1.6 beschreven protocol, maar in stap 1.6.1, incubeer de dia's in May-Grünwald-oplossing gedurende 5 minuten.
Representative Results
Om de C1498 muismodel karakteriseren, gingen we met twee grote stappen. Eerst werden de cellen C1498 kenmerk hun hematopoietische afkomst en maturatie in vitro (figuur 1) te bepalen. Deze cellen werden vervolgens geïnjecteerd in congene muizen, en de aard van de geïnduceerde leukemische ziekten is onderzocht op verschillende eigenschappen te bepalen: leukemische infiltratie, hun fenotype, een kwantificering van de hematopoietische cellen (volwassen en voorlopers / voorlopers) in beenmerg, de frequenties van C1498-cellen en rijpe hematopoietische cellen in het bloed en een evaluatie van orgaan zwelling (in de milt, lever en longen) en cellulaire samenstelling. De C1498 cel fenotypes in vitro te karakteriseren, werden de cellen gelabeld met antilichamen gericht tegen moleculen die door hematopoietische voorlopers en volgroeide cellen (tabel 1) uitgedrukt en de resultaten werden geanalyseerd onder toepassing van stroming cytometry. De C1498-cellen waren positief voor celoppervlakte-expressie van Mac-1 (CD11b / CD18) (~ 7%), B220 (> 25%), en zij toonden intracellulaire expressie van CD3e, T-celreceptor (TCR) Vp ketens en Mac -3 (figuren 2A en B). De cellen waren negatief voor de celoppervlak markers Ly6G, Ly6C, CD115, CD21 / CD35, CD19, CD3, CD4, CD8, NK1.1 en pan-NK moleculen en voor de intracellulaire expressie van CD4 en CD8 (data niet getoond) . Zij werden vervolgens onderzocht op merkers van hematopoietische stamcellen en voorlopers (tabel 1). Ze waren ook negatief voor celoppervlak expressie van CD117, CD34, Sca-1, CD150 en CD16 / 32 (gegevens niet getoond). Deze leukemische cellen werden vervolgens getest op de expressie van adhesie, antigeenpresentatie en co-stimulerende moleculen te bepalen. De cellen brachten de oppervlakte markers LFA-1 (CD11a / CD18), CD44, CD31 (PECAM-1), en H-2D b en waren negatief voor MHC klasse II, CD80, CD86 en CD274 (gegevens niet getoond). C1498 cellen therefore uitgedrukt zowel myeloïde (Mac-1, Mac-3) en lymfatische markers (B220, CD3, TCR). Om beter te karakteriseren hun hematopoietische afkomst, werd myeloperoxidase expressie bepaald met immunofluorescentie microscopie. Alle cellen waren positief voor de myeloperoxidase, die hun myeloïde oorsprong (Figuur 3A) geverifieerd. Een meerderheid van de cellen ook positief voor gekleurd α-naftyl butyraat esterases (Figuur 3B, linker paneel), en sommige gekleurd voor het naftol AS-D chlooracetaat esterases (zwarte pijlen) (Figuur 3B, rechter paneel). De resultaten geven aan dat de cellen bevatten mengsels van monocytische cellen en granulocyten. Na May-Grünwald Giemsa kleuring werd uitgevoerd, werden de C1498 cellen waargenomen dat een ontploffing-achtige morfologie te tonen met een hoge nucleo-cytoplasmatische ratio, 3-5 nucleoli in de kern, een perinucleaire halo, tal van vacuolen en een basofiele cytoplasma (Figuur 3C ). thons, is de C1498 cellijn bestaat uit monoblast en myeloblasten. De C1498-cellen (CD45.2 +) werden vervolgens intraveneus geïnjecteerd in CD45.1 + muizen. De muizen bezweken 17 tot 19 dagen na de cellen werden geïnjecteerd. Deze muizen werden opgeofferd zodat de leukemie soort kunnen worden geanalyseerd voor hun dood aan de ziekte. De controlemuizen die waren geïnjecteerd met PBS, werden geanalyseerd tegelijkertijd voor de vergelijking. De C1498-cellen geïnjecteerde muizen weergegeven massale infiltratie van C1498-cellen in beenmerg, zoals blijkt uit de explosie-achtige uiterlijk van de cellen na May-Grünwald Giemsa kleuring werd uitgevoerd (Figuur 4A). Zij behouden eveneens hun monocyt en granulocyten fenotypen (Figuur 4B en C), waaruit een opeenstapeling van monoblastic en myeloblastische cellen die kenmerkend is voor acute myelomonocytische leukemie. om determine of medullaire hematopoietische cellen aantallen lager waren volgende leukemische cellen invasie, CD45.2 + C1498 cellen, B-lymfocyten, monocyten en granulocyten populatie (met inbegrip van voorouders, voorlopers en volgroeide cellen), werden gekwantificeerd met behulp van immunofluorescentie kleuring en multi-parametrische flowcytometrie analyse. Leukemische cellen vertegenwoordigde 16-36% van de hematopoietische cellen (gegevens niet getoond). De andere celtypen werden alle in aanzienlijk lagere aantallen in het C1498-geïnjecteerde muizen dan in de PBS-geïnjecteerde muizen (met 5-voudig gemiddeld B cellen, 4-voudige gemiddeld myeloïde cellen en 3-voudig gemiddeld voor monocytische subsets) (Figuur 5A tot C). Een onderzoek van de frequenties van mononucleaire cellen in leukemische en controlemuis bloedmonsters aangetoond dat ze een vergelijkbaar percentage lymfocyten (figuur 6A), maar een hogere frequentie van monocytische bevatteen leukemische cellen. Deze kenmerken zijn representatief voor acute myelomonocytische leukemie 11 (figuur 6B). Onder de andere kenmerken van acute myelomonocytische leukemie 12, het C1498-geïnjecteerde muizen gepresenteerd met gezwollen lever (hepatomegalie), longen en milt (splenomegalie) (Figuur 7A). Verschillende frequenties van CD45.2 + C1498 cellen werden gedetecteerd in deze organen middels immunofluorescentie kleuring en flowcytometrie-analyse (Figuur 7B). Aangezien splenomegalie kan het gevolg zijn van grote aantallen geïnfiltreerde monocyten, schatten we ook de verhoudingen van milt populaties. Het aantal cellen in het lymfatische B, monocyt en granulocyten celfracties significant groter, met gemiddeld 2-voudig, 2,5-voudig en 3-voudig, respectievelijk, in leukemische milten dan in de controle milten (figuur 7C). <p class="jove_content" fo:keep-together.wi thin-page = "1"> Figuur 1. Schematische weergave van het protocol instellen voor het karakteriseren in vitro gekweekte C1498 cellijnen en in vivo beschrijvingen van acute leukemie. De hematopoietische afkomst en het differentiatiestadium van weefsel gekweekte C1498 cellen werden eerst bepaald. C1498 cellen werden vervolgens geïnjecteerd in congene muizen om de ontwikkeling van acute leukemie veroorzaken. De isolatie van beenmerg, perifeer bloed, milt, lever en longen werd uitgevoerd om de frequenties fenotypes en morfologische veranderingen na de C1498 cellen infiltratie bepalen. IV: Intraveneuze MGG:. May-Grünwald Giemsa Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. ad / 54270 / 54270fig2.jpg "/> Figuur 2. Fenotypische analyse van C1498-cellen na in vitro cultuur. Representatieve flowcytometrie dot plots en histogrammen van celoppervlak (A) en intracellulaire (B) C1498-moleculen die tot expressie werden geassocieerd met volwassen hematopoietische celdifferentiatie getoond. C1498-cellen werden geoogst van kweken, gewassen en gelabeld met fluorescente antilichamen die specifiek zijn voor het celoppervlak CD11b, CD18 en B220 merkers of hun isotype controles waren. Voor intracellulaire kleuring werden de cellen gefixeerd, gepermeabiliseerd en geëtiketteerd met antilichamen gericht tegen Mac-3, CD3e en een gemeenschappelijke epitoop van de TCR (T-celreceptor) Vp keten of hun isotype controles. Analyses werden uitgevoerd met behulp van venstertijd met levende cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figuur 3. Functionele en morfologische karakterisering van Gekweekte C1498 Cells. C1498 cellen werden geoogst uit culturen en gecentrifugeerd op objectglaasjes voor microscopie. (A) Kleuring voor myeloperoxidase expressie werd uitgevoerd onder toepassing van immunofluorescentie. (B) Cytochemische reacties werden gebruikt voor de α-naftyl butyraat esterase (NBE) en naftol AS-D-chlooracetaat esterase analyseren (CAE) activiteiten in C1498-cellen. Cellen werden als positief beschouwd voor elk label als bruin en rood-paars, grote cytoplasmatische granules werden respectievelijk waargenomen worden. (C) May-Grünwald Giemsa (MGG) kleuring van C1498-cellen. Voor elke kleuring experiment wordt de microscopie objectiefvergroting aangegeven. Elk beeld is representatief voor drie afzonderlijke experimenten.large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4. Bone Marrow morfologie PBS en C1498-geïnjecteerde muizen. Beenmerg cellen werden uit PBS en C1498-cellen geïnjecteerde muizen geïsoleerd en gecentrifugeerd op dia's voor microscopie. (A) May-Grünwald Giemsa (MGG) kleuring. (B ) α-naftyl butyraat esterase (NBE) en (C) naftol AS-D chlooracetaat esterase (CAE) functies werden geëvalueerd middels cytochemie. In paneel A, de band (onrijpe) of gesegmenteerd (volwassen) neutrofielen minder zichtbaar in het beenmerg van de C1498-geïnjecteerde muizen dan de PBS-geïnjecteerde muizen. Paneel B en C geven aan dat er een accumulatie van monocytische cellen en granulocyten in de leukemische beenmerg vergelijking met de nummers waargenomen in de controle beenmerg. Allemicroscopische analyses werden uitgevoerd met behulp van een 100X vergroting doelstelling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5. Kwantitatieve Analyse van Medullaire Populaties in PBS en C1498-geïnjecteerde muizen. Beenmerg cellen werden uit PBS en C1498-cellen geïnjecteerde muizen geïsoleerd en naar schatting nadat cel telling werd uitgevoerd. De frequenties van de verschillende celpopulaties werden vastgesteld na immunokleuring en levende cellen gated flowcytometrieanalyse. (A) de B cellen opgenomen CD19 + B220 + -cellen in fasen van pro-B-cellen B-lymfocyten (B) granulocytische cellen in de volwassen CD3 – en CD11b + + Ly6G lineages De precursoren een inbegrepen. nd onvolwassen en volwassen granulocyten (C) De monocytische subsets werden gedefinieerd als CD3 – CD115 + en omvatte cellen in de voorlopercellen te monocyten stadia rijpen. n = 7 muizen / groep en de gegevens worden gepresenteerd als histogrammen tonen de gemiddelden ± SEM. *** P <0,0001 en **, p <0,01, t-testen ongepaarde Student's vergelijken PBS en C1498-geïnjecteerde muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6. Bloed Analyse van mononucleaire cel subsets in PBS en C1498-geïnjecteerde muizen. Representatieve flowcytometrie dot plots van (A) T en B lymfocyten percentages, die respectievelijk zijn gedefinieerd als CD3 + en B220 + cellen in PBS- en C1498 cellen geïnjecteerd. muizen (B) monocytische cel frequenties in C1498 leukemische en controle (PBS) muizen werden bepaald door het analyseren van CD115 + Ly6C – en CD115 + Ly6C hoge cellen. De analyse werd uitgevoerd door gating levende cellen. Om leukemische en controle muizen te vergelijken, CD45.2 + C1498-cellen werden uitgesloten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 7. Schatting van Milt Populaties in leukemie en controle muizen. (A) Representatieve foto van lever, long en milt zwelling in leukemische muizen in vergelijking met controle muizen. De milten werden verzameld en gewogen en splenocyten werden geteld na weefselverstoring. (B) Histogram die leukemische cellen frequenties diffErent organen na immunokleuring werd gedurende CD45.2 + cellen en de resultaten werden geanalyseerd met flowcytometrie. (C) Schattingen van milt B, myeloïde en monocytische celaantallen na immunokleuring en flowcytometrie analyse gating uitgevoerd om levende CD19 + B220 + identificeren , CD3 – CD11b + Ly6G +, CD3 – CD11b + Ly6C – en CD3 – CD11b + Ly6C hoge cellen. De schaalbalken getoond voor de longen, milt en lever geven 1 cm. .. n = 5-8 muizen / groep en de gegevens worden weergegeven in histogrammen als gemiddelden ± SEM *, p <0,05, ** p = 0,0033, t-proef ongepaarde Student's vergelijken PBS en C1498-geïnjecteerde muizen Zoom klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. <tbody> Cell Type Membraan of intracellulaire Molecules Voorlopers en volgroeide cellen NK-cellen NK1.1 +, pan-NK + NKT cellen NK1.1 +, pan-NK +, TCR Vbeta + (8.2), CD3 + T-lymfocyten TCR Vbeta +, CD3 +, CD4 +, CD8 + B-cellen en B-lymfocyten precursors B220 +, CD19 +, CD21 / 35 + granulocytic precursoren en granulocyten Ly6G +, Mac-1 +, CD11b + monocytische precursoren en monocyten / macrofagen CD11b +, Mac-1 +, Mac-3 +, CD21 / 35 +, CD115 +, Ly6Chi progenitors multipotente voorlopercellen CD117 + Sca-1+ CD34 + (Lin- CD150-) -Lymfoïde primer multipotente voorlopercellen CD117hi Sca-1hi CD127 + (Lin) gemeenschappelijke lymfoïde voorlopers CD117lo Sca-1LO CD127 + (Lin) gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen CD16 / 32lo CD117 + CD34int (Liri Sca-1-) granulocyten-macrofaag voorlopercellen CD16 / 32hi CD117 + CD34hi (Liri Sca-1-) megakaryocyt-erytroïde voorlopers CD16 / 32lo CD117 + CD34lo (Liri Sca-1-) Hematopoietische stamcellen CD117 + Sca-1 + CD150 + (Lin- CD34-) Tabel 1. Merkers van hematopoietische cellijnen en differentiatie. CD: cluster van differentiatie; Lin: markers van rijpe cellen; lo:lage expressie; hi: hoge expressie; int: gemiddeld meningsuiting; NK: natural killer cellen; TCR: T-celreceptor.
Discussion
In eerdere studies werd de C1498-cellijn beschreven als een inductor van acute granulocytaire 5, myelomonocytaire 6 of 7 NKT cel leukemie. Echter, demonstratieve literatuurgegevens waren ofwel afwezig of onvolledig. De hier gepresenteerde protocol maakt gebruik van verschillende technieken, zoals doorstroomcytometrie, immunofluorescentie, MGG kleuring en cytochemische analyses, C1498 gekweekte cellen te karakteriseren en de aard van de leukemie die wordt geïnduceerd in muizen na geïnjecteerd bepalen.
Wanneer we in vitro gekweekte cellen C1498 fenotype na immunokleuring en flowcytometrie werden uitgevoerd, namen wij een aantal beperkingen, omdat deze cellen tot expressie paar celoppervlak hematopoïetische merkers die eerder in de literatuur beschreven 6,7. In overeenstemming met onze resultaten, leverde Labelle et al. Niet het celoppervlak expressie van volwassen TCR observeren op C1498-cellen met behulp van stroom cytometry kleuring. Echter, als ze naar een NKT-cellijn nadat ze CD3e en TCRVβ8.2 mRNA 7 gedetecteerd. We observeerden ook intracellulaire expressie van TCRVβ CD3e ketens en moleculen in de meeste cellen (> 70%), maar hun hematopoietische lineages kon niet worden bepaald omdat er ook gelijktijdig intracellulaire expressie van Mac-3-molecuul.
Myeloperoxidase, MGG kleuring en evaluaties om functionele esterasen behulp cytochemie analyseren aangetoond dat de C1498 cellijn had een myeloïde oorsprong en was samengesteld uit monoblast en myeloblasten. Deze resultaten waren overeenstemmend met het percentage Mac-3 + cellen die in flow cytometrie werden verkregen kleuring analyse. Hoewel niet kwantitatief, stappen behelzen belangrijke experimenten uit te voeren. Zij blijven, tot nu toe, de beste bestaande werkwijzen voor het karakteriseren van de lijn en differentiatie stadium van hematopoietische cellen die geen of f uitdrukkenew specifieke fenotypische markers.
Flowcytometrie kleuring was nuttig voor het aantonen van de ontwikkeling van acute leukemie in muizen na congenic C1498 cellen intraveneus werden geïnjecteerd. De CD45.2 + C1498 cellen die geïnfiltreerd in het perifere bloed en verschillende organen werden geïsoleerd, en hun frequenties werden bepaald. Kwantificering werd ook uitgevoerd aan inherente medullaire en milt cellen te analyseren na immunofenotypering. Beperkingen werden ondervonden bij de C1498 cel fenotype in organen werd onderzocht omdat zij geuit enkele hematopoietische markers (slechts een paar van hen waren B220 +). De aard van de waargenomen acute leukemie, May-Grünwald Giemsa kleuring en analyse van de activiteiten van monocytische definiëren en granulocyten esterasen werden uitgevoerd met beenmerg. De resultaten toonden aan dat C1498 cellen behouden hun myeloblastische en monoblastic morfologie en functie, waaruit het ontstaan van myelomonocytische leukemie.
<p class = "jove_content"> Als tegenprestatie voor de kritische stappen in dit protocol beschreven, moet bijzondere aandacht worden besteed aan de pH bij het uitvoeren van cytochemische reacties en MGG kleuring, omdat fouten in pH kan leiden tot een onjuiste interpretatie van de resultaten. Bijvoorbeeld α-naftyl butyraat esterase activiteit specifiek voor monocytcellen Pas bij een pH van 6,0 omdat granulocyten en lymfocyten ook positief voor deze test bij hogere pH waarden kunnen bevlekken. Fixeren van de cellen wordt niet aanbevolen voor het uitvoeren van MGG kleuring, en we toonden aan dat alleen CAF fixatie bevredigende resultaten bij het uitvoeren van esterases cytochemische reacties met behulp van C1498-cellen. Om de expressie van CD115 molecuul en de detectie door flowcytometrie, alle monsters (bijvoorbeeld bloed, beenmerg en milt cellen) worden op ijs gehouden tijdens de procedure behouden. Indien geen kleuring wordt waargenomen in stromingscytometrie of / en immunofluorescentie experimenten, de referentie van de antilichamen, de bewaring recommendations en hun verdunningen moeten worden gecontroleerd. De in de tabel materialen / apparatuur referenties zijn geselecteerd vanwege flowcytometrie of immunofluorescentie toepassingen. De primaire / secundaire antilichamen of hun geconjugeerde fluoroforen kunnen hun activiteiten hebben verloren door verkeerde opslag (bijvoorbeeld blootstelling aan licht of warmte), onjuiste verdunning uitgebreide bevriezen / ontdooien of het gebruik van verontreinigde buffers. Ren positieve controles om ervoor te zorgen dat ze goed werken. Gebruik muis beenmerg en milt afgeleide cellen waarvan bekend is dat het eiwitten van belang tot expressie. Om een hoge achtergrond en niet-specifieke kleuring te vermijden, zorg ervoor dat de cellen goed worden gewassen en bewaard bij een hoge luchtvochtigheid (voor immunofluorescentie) en dat de antilichamen worden verdund volgens de instructies. Met dezelfde concentratie en verdunning van het isotype controle-antilichaam en het primaire antilichaam om nauwkeurig de achtergrondniveau in het monster. Voor esterase cytochemie experimenten, dereagentia kunnen worden getest met behulp van positieve en negatieve controleglaasjes die gezuiverde muis milt granulocytaire (Ly6G +) en monocytische (CD115 +) cellen.De in deze studie beschreven procedure toonde aan dat veel van de functies leukemische waargenomen bij muizen na de injectie van C1498-cellen gedeelde gemeenschappelijke kenmerken met humane acute myeloïde leukemie 11,12. Het binnengedrongen leukemische cellen resulteerde in een vermindering van rijpe en onrijpe (voorlopers en voorlopers) medullaire hematopoietische cellen. C1498-cellen aanwezig bij hoge frequentie (> 20%) in het perifere bloed, evenals monocytische cellen. Hepatomegalie en splenomegalie waargenomen het gevolg van de infiltratie van leukemische cellen en significante toename in B lymfocyten en myeloïde cellen werden ook waargenomen splenomegalie begeleiden. Trombopenie werd ook waargenomen wanneer bloedplaatjes aantallen werden geschat met behulp van een hematologie-analyse.
Het was te zienn, middels in vitro experimenten, dat C1498 cellen remmen normale muizen hematopoiese secreteren oplosbare factoren 13. In verscheidene tumor muismodellen zijn onrijpe myeloïde cellen (met inbegrip van monocytische cellen en granulocyten) ook aangetoond dat migreren van het beenmerg naar de milt waar ze remmen anti-tumorspecifieke T-celactivering en proliferatie 14. Aldus kan de verlaging van hematopoietische cellen dat werd waargenomen in het beenmerg resulteerde uit ofwel een tekort aan hematopoiese en / of hun emigratie. Dit laatste mechanisme zou de aanwezigheid van monocytose in het perifere bloed of waarneming vergrote myeloïde fracties in de milt verklaren. Het is ook denkbaar dat deze cellen kon worden ontleend verbeterde milt hematopoiese. Inderdaad, onder steady-state condities, sommige subsets van milt B-cellen werden geïdentificeerd als voorlopers van rijpe B-lymfocyten 15. Bovendien, onder inflammatoire aandoeningen, medullary stamcellen en voorlopers cellen is aangetoond dat verhuizen naar de milt om de productie van rijpe monocyten 16 induceren. Dit protocol maakt het niet mogelijk om conclusies over de mechanismen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van leukemie en andere functionele en moleculaire assays worden toegepast om dit te doen trekken. Echter, deze gegevens bevatten gedetailleerde informatie over de klinische kenmerken van acute myeloïde leukemie en zullen de onderzoekers te evalueren en de effecten van nieuwe therapeutische middelen te begrijpen helpen.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the “Ligue Nationale contre le Cancer” (Comité du Septentrion), the SIRIC ONCOLille (Grant INCa-DGOS-INSERM 6041) and the Institut pour la Recherche sur le Cancer de Lille (IRCL) for supporting this work. They would like to thank Delphine Taillieu and the animal facility staff for housing the mice and maintaining their welfare. We also thank Raphaëlle Caillerez and Nathalie Jouy for their respective help in microscopy and flow cytometry.
Materials
| C1498 cell line | ATCC | TIB 49 | |
| C57BL/6J-Ly5.1 | Charles River | B6.SJL-Ptprc a Pep3 b/BoyCrl | |
| Cells culture reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol, Gibco | ThermoFisher Scientific | 21985 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10270 | |
| HEPES, Gibco (1 M) | ThermoFisher Scientific | 15630 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution, Gibco | ThermoFisher Scientific | 11140 | |
| Penicillin-Streptomycin, Gibco | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| RPMI 1640 Medium (Gibco, GlutaMAX Supplement) | ThermoFisher Scientific | 61870 | |
| Sodium Pyruvate, Gibco (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360 | |
| Flow cytometry staining reagents | |||
| anti-mouse B220 APC (1) | ebiosciences | 17-0452 | clone RA3-6B2, final dilution 1/100 |
| anti-mouse B220 biotin (2) | ebiosciences | 13-0452 | clone RA3-6B2, 1/400 |
| anti-mouse CD3 eFluor450 (1) | ebiosciences | 48-0032 | clone 17A2, 1/100 |
| anti-mouse CD3 PE (2) | BD biosciences | 555275 | clone 17A2, 1/100 |
| anti-mouse CD3 PE-Cy5 (3) | ebiosciences | 15-0031 | clone 145-2C11, 1/100 |
| anti-mouse CD4 APC (1) | ebiosciences | 17-0041 | clone GK1.5, 1/500 |
| anti-mouse CD4 PE (2) | ebiosciences | 12-0041 | clone GK1.5, 1/200 |
| anti-mouse CD8 biotin (1) | ebiosciences | 13-0081 | clone 53-6.7, 1/100 |
| anti-mouse CD8 eFluor450 (2) | ebiosciences | 48-0081 | clone 53-6.7, 1/500 |
| anti-mouse CD11a biotin | ebiosciences | 13-0111 | clone M17/4, 1/100 |
| anti-mouse CD11b PE | ebiosciences | 12-0112 | clone M1/70, 1/200 |
| anti-mouse CD16/32 biotin | ebiosciences | 13-0161 | clone 93, 1/400 |
| purified anti-mouse CD16/32 (FcR blocking) | BD biosciences | 553141 | clone 2.4G2 |
| anti-mouse CD18 biotin (1) | ebiosciences | 13-0181 | clone M18/2, 1/100 |
| anti-mouse CD18 FITC (2) | ebiosciences | 11-0181 | clone M18/2, 1/50 |
| anti-mouse CD19 PE | ebiosciences | 12-0193 | clone 1D3, 1/200 |
| anti-mouse CD21/35 PE | ebiosciences | 12-0211 | clone 8D9, 1/50 |
| anti-mouse CD31 PE | ebiosciences | 12-0311 | clone 390, 1/100 |
| anti-mouse CD34 eFluor660 | ebiosciences | 50-0341 | clone RAM34, 1/20 |
| anti-mouse CD44 PE | BD biosciences | 553134 | clone IM7, 1/50 |
| anti-mouse CD45.2 FITC | ebiosciences | 11-0454 | clone 104, 1/100 |
| anti-mouse CD49b/Pan NK PE | BD biosciences | 553858 | clone DX5, 1/50 |
| anti-mouse CD80 biotin | ebiosciences | 13-0801 | clone 16-10A1, 1/200 |
| anti-mouse CD86 biotin | ebiosciences | 13-0862 | clone GL1, 1/200 |
| anti-mouse CD107b (Mac-3) PE | ebiosciences | 12-5989 | clone M3/84, 1/40 |
| anti-mouse CD115 PE | ebiosciences | 12-1152 | clone AFS98, 1/100 |
| anti-mouse CD117 eFluor450 | ebiosciences | 48-1171 | clone 2B8, 1/100 |
| anti-mouse CD127 PE | ebiosciences | 12-1271 | clone A7R34, 1/100 |
| anti-mouse CD150 APC | ebiosciences | 17-1501 | clone 9D1, 1/20 |
| anti-mouse CD274 (PD-L1) biotin | ebiosciences | 13-5982 | clone MIH5, 1/200 |
| anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE | ebiosciences | 12-5981 | clone D7, 1/100 |
| anti-mouse Ly-6C APC | ebiosciences | 17-5932 | clone HK1.4, 1/200 |
| anti-mouse Ly-6G (Gr-1) biotin (1) | ebiosciences | 13-5931 | clone RB6-8C5, 1/400 |
| anti-mouse Ly-6G FITC (2) | ebiosciences | 11-9668 | clone 1A8, 1/50 |
| anti-mouse MHC class I (H-2Db) biotin | ebiosciences | 13-5999 | clone 28-14-8, 1/50 |
| anti-mouse MHC class II (I-A/I-E) PE-Cy5 | ebiosciences | 15-5321 | clone M5/114.15.2, 1/1000 |
| anti-mouse NK1.1 PE | BD biosciences | 557391 | clone PK136, 1/50 |
| anti-mouse TCRVb FITC | BD biosciences | 553170 | clone H57-597, 1/50 |
| streptavidin PE-Cy5 | ebiosciences | 15-4317 | 1/200 |
| Immunofluorescence staining reagents | |||
| Anti-mouse myeloperoxidase (heavy chain antibody) | Santa Cruz Biotechnology | sc-16129 | 1/10 (20 µg/ml) |
| anti-goat IgG (Texas Red coupled antibody) | Jackson Immunoresearch | 705-076-147 | 1/250 |
| Normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | |
| Hoechst solution | BD Biosciences | 561908 | 1/1000 |
| Mounting medium 1 (Fluoromount) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Acetone | VWR | 20066 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| Esterase cytochemical staining reagents | |||
| Naphtol AS-D chloroacetate solution | Sigma-Aldrich | 911 | |
| Dye solution (Fast Red Violet LB Base solution) | Sigma-Aldrich | 912 | |
| pH6.3 buffer concentrate (TRIZMAL) | Sigma-Aldrich | 913 | |
| Sodium nitrite solution | Sigma-Aldrich | 914 | |
| Citrate solution | Sigma-Aldrich | 915 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GHS3 | |
| Acetone | VWR | 20066 | |
| Formaldehyde solution, 37% | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| α-naphthyl butyrate solution | Sigma-Aldrich | 1801 | |
| Phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 1805 | |
| Sodium nitrite Tablet | Sigma-Aldrich | 1809 | |
| Pararosaniline solution | Sigma-Aldrich | 1804 | |
| Methylene blue solution | Sigma-Aldrich | 1808 | 1/10 |
| mounting medium 2 (Clearmount) | Invitrogen | 00-8010 | |
| May-Grünwald Giemsa staining reagents | |||
| May-Grünwald solution | RAL Diagnostics | 320070 | |
| Giemsa R solution | RAL Diagnostics | 320310 | 1/20 |
| pH 6.8 buffer solution | RAL Diagnostics | 330368 | |
| Others materials, reagents and equipment | |||
| Ketamine 1000 (100 mg/mL) | VIRBAC | 3597132111010 | |
| Xylazine SEDAXYLAN (20 mg/mL) | CEVA | ||
| Bovin albumin serum (BSA) powder | ThermoFisher Scientific | BP671 | |
| PBS solution (1x concentrate) | ThermoFisher Scientific | 14190 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Ultra Pure 0.5 M EDTA solution, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575 | |
| Separating solution (Pancoll Mouse) | PANBIOTECH | P04-64100 | |
| Lysis buffer (Red Blood Cells Lysing Buffer) (10X) | BD Biosciences | 555899 | 1/10 |
| NaOH 10N | ThermoFisher Scientific | SS267 | |
| Trypan blue solution (0.4 %) | ThermoFisher Scientific | 15250-061 | 1/2 |
| 50 mL tube (Falcon) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70µm Cell Strainer (Falcon) | Corning Life Sciences | 352350 | |
| Chamber & filter card (EZ Cytofunnel Shandon) | Thermo Scientific | A78710003 | |
| Microscope Cover Glasses, 24x24mm | Knittel Glass | VD1 2424 Y100 | |
| Slides (Starfrost – ground edges 90) | Knittel Glass | VS1137# 077FKB | |
| EDTA Tube | Greiner Bio-One | 454034 | |
| Pasteur Pipette 150MM (capillary tube) | Fisherbrand | 1154-6963 | |
| 26G needle | Terumo | NN-2613R | |
| insulin syringe and needle 29G | Terumo | BS05M2913 | |
| 30G needle | Becton & Dickinson | 304000 | |
| Flow cytometry tubes (blue) | Beckman Coulter | 2523749 | |
| Water-repellent pen (Dakopen) | Dako | S200230 | |
| Sharp sterile scissors | Nessi-care | SCI-01 | |
| Sterile forceps | Dominique Dutscher | 956506 | |
| Thoma cell counting chamber | VWR | 631-0397 | |
| Petri Dishes (Fisherbrand Plastic) | ThermoFisher Scientific | S33580A | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
| Cylindrical Restrainer 15-30 gm | Stoelting | 51338 | |
| Shandon Cytospin 3 Cytocentrifuge | ThermoFisher Scientific | ||
| 10 mL syringe | Terumo | SS-10L | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Ethanol | Merck | 1.08543 | |
| Sterile gauze sponges | URGO | 501580 |
Referências
- Forthun, R. B., Hinrichs, C., Dowling, T. H., Bruserud, &. #. 2. 1. 6. ;., Selheim, F. The past, present and future subclassification of patients with acute myeloid leukemia. Curr. Pharm. Biotechnol. 17 (1), 6-19 (2016).
- Goldie, H., Butler, C. H., Anderson, M. M., Maxwell, M. C., Hahn, P. F. Growth characteristics of free C1498 (granulocytic leukemia) tumor cells in the peritoneal fluid and the blood of C57 mice. Cancer Res. 13 (2), 125-129 (1953).
- Tanaka, K. K., Roberts, E. Biological studies of E.L.4 lymphoma and C Leukemia in susceptible (C57BL) and resistant (B10.D2) mice. Cancer Res. 24 (1498), 1785-1797 (1964).
- Law, L. W. Characterization of an influence affecting growth of transplantable leukemias in mice. Cancer Res. 4, 257-260 (1944).
- Graham, J. D., McMahon Welch, C., Patchen, M. L. Studies of an implanted murine myelogenous leukemia C1498. Ohio J. Sci. 75 (4), 202-208 (1975).
- Boyer, M. W., Orchard, P. J., Gorden, K. B., Anderson, P. M., Mclvor, R. S., Blazar, B. R. Dependency on intercellular adhesion molecule recognition and local interleukin-2 provision in generation of an in vivo CD8+ T-cell immune response to murine myeloid leukemia. Blood. 85 (9), 2498-2506 (1995).
- Labelle, J. L., Truitt, R. L. Characterization of a murine NKT cell tumor previously described as an acute myelogenous leukemia. Leuk. Lymphoma. 43 (8), 1637-1644 (2002).
- Bradner, W. T., Pindell, M. H. Myeloid leukemia as a screen for cancer chemotherapeutic agents. Cancer Res. 26 (4), 375-390 (1966).
- Lin, J. M., Li, B., Rimmer, E., VanRoey, M., Jooss, K. Enhancement of the anti-tumor efficacy of a GM-CSF-secreting tumor cell immunotherapy in preclinical models by cytosine arabinoside. Exp. Hematol. 36 (3), 319-329 (2008).
- Robinson, J. P. . Handbook of Flow Cytometry Methods. , (1993).
- Xu, Y., McKenna, R. W., Wilson, K. S., Karandikar, N. J., Schultz, R. A., Kroft, S. H. Immunophenotypic identification of acute myeloid leukemia with monocytic differentiation. Leukemia. 20 (7), 1321-1324 (2006).
- Hassan, K., Qureshi, M., Shafi, S., Ikram, N., Akhtar, M. J. Acute myeloid leukemia-FAB classification and its correlation with clinico-haematological features. J. Pak. Med. Assoc. 43 (10), 200-203 (1993).
- Quesenberry, P. J., Rappeport, J. M., Fountebouni, A., Sullivan, R., Zuckerman, K., Ryan, M. Inhibition of normal murine hematopoiesis by leukemic cells. N.Engl.J. Med. 299 (2), 71-75 (1978).
- Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Immunol. 181 (8), 5791-5802 (2008).
- Loder, F., et al. B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals. J. Exp. Med. 190 (1), 75-89 (1999).
- Robbins, C. S., et al. Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions. Circulation. 125 (2), 364-374 (2012).
Citar este artigo
Mopin, A., Driss, V., Brinster, C. A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model. J. Vis. Exp. (116), e54270, doi:10.3791/54270 (2016).