Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.
The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.
Anjiyogenezis, polarize yönlü özgüllük ile göç ve kan temini gerektiren dokularda yeni damar sistemini oluşturmak için endotel hücreleri (EC) teşvik hücre dışı bir sinyal ipuçları ile tetiklenir. anjiogenezisi sürücü düşünce katkıda bulunan faktörler ekstrasellüler matriks (ECM) gelen sinyaller bulunmaktadır. Fiziksel uyaranlara yanıt olarak, EC damar ağı 1,2 oluşumunda yönlü hareketini yönlendirmek için yönlendirme spesifikliği olan şube uzanır. AK morfolojisi ve dallanma mimari acto-miyozin kasılmasının 3 düzenlenmesi ile koordineli bir şekilde mikrotübül (MT) hücre iskeletinin lokalize yönetmelikle belirlenir. Oluşturmak için AT dalları için, miyozin II yerel bölgesel membran çıkıntılar 4 sonuçlanan aşağı regüle edilmesi gerekmektedir. Aynı zamanda ve hücre içinde aynı yerde, MT büyüme dinamikleri şube Elon teşvik etmek yavaş ve kalıcı MT büyüme ile sonuçlanan değiştirilmiş halinegasyon ve stabilite 5. Bu koordine iskelet düzenleme EC yönlü göç kolaylaştırmak için kendi morfolojisi polarize sağlar.
Kutuplaşmış bir hücre morfolojisi gelişimi polarize MT takımını 6 gerektirir. Epitel hücreleri göç olarak, MTS hücrenin 7-9 öncü yavaş ve ısrarla özellikle büyümek; nöronlarda iken, akson veya dendrit başlaması ve uzama MTs sadece mevcut olmasını gerektirir, fakat onlar dinamik montaj ve demontaj 10-15 süreçlerini geçiyor. Bu şekilde, MT büyüme dinamiği lokalize kontrol hücre yapısını tespit eder ve EC bunların ECM gezinirken hücre morfolojisi hızla yeniden sağlar.
MT büyüme dinamikleri moleküler motor protein ve non-motor proteinlerin aileleri tarafından düzenlenir, Mikrotubul İlişkili proteinler veya Mikrotubul Etkileşen Proteinler (bundan sonra refe olarak adlandırılan) MAP'ler olarak rred. MAP yerel olarak, tipik olarak, hücre-ECM arayüzü 16,17 başlatılan sinyal basamaklarının ile, aktive edilmiş ya da inaktive edilebilir. MT bağlanarak ve MT montaj ve demontaj kinetik değiştirerek kez aktif MAP fonksiyonu; böylece lokal hücre şekli ve kutupları 18-20 teşvik etmek amacıyla MT dinamiklerini düzenleyen işleyen. Mitotik Sentromer İlişkili kinesin (MCAK) MT uçları ve çiftler MT sökme 21-23 ATP hidroliz bağlanan bir kinesin-13 aile MAP olduğunu. MCAK bu fonksiyonel rolü mitotik iğ 24-28 olan kritik olarak interfaz 29,30 ne olduğu bilinmektedir. interfaz EC içinde MCAK aracılı MT demontaj yara kenardan Rac1 küçük GTPaz indükte aktivasyonunu yanıt olarak MCAK lokalize Aurora-A indüklediği fosforilasyon ile düzenlenir. Bu sinyal akışının sonucu le doğru polarize MT büyümesi ile sonuçlanan, EC ön kenarında MCAK inhibisyonuECS 31 göç firar kenarında kenar ve MCAK kaynaklı MT sökme ading.
MT büyüme dinamiği ölçmek için geleneksel yöntemler, tipik olarak floresan etiketli tübülin ya da daha yakın zamanda, floresan etiketli MT sonu bağlayıcı protein 1 ya da 3 (sırasıyla EB1 ve EB3) ya da el izleme kullandık. floresan tubulin yaklaşımı tüm MT dizi etiketleme avantajına sahiptir. Mitotik hücre türlerinin çoğunluğu interfaz 8,32,33 sırasında MTS radyal sırasını korumak için, ancak, sentrozom civarındaki MTS çok yoğundur ve sonuç olarak, flüoresan tubulin MT büyüme ve sökme izleme, genellikle çevre sınırlıdır hücrenin bölgeleri. Bu kısıtlamalar nedeniyle, floresan etiketli EB proteinlerin (EB1 veya EB3) kullanım MT dinamiklerini ölçmek için daha ortak bir yaklaşım olmuştur. EBS sadece MTS büyüyen artı uçları etiket çünkü onlar parlak floresan gelip, (1-3 mikron) küçük görünürts, son derece sınırlı eşiğe 34-37 MT polimerizasyon kolayca ayırt edilebilir işaretleyici sağlar. MT dizinin yalnızca bir alt kümesi EBS etiket EB yaklaşımının önemli bir gücü temsil olması, aynı zamanda önemli bir sınırlama vurgular iken, non-büyüyen MTS EB3 yaklaşımla etiketlenmiş değildir. Bununla birlikte, ölçmek ve zamanla EB3 kuyruklu izlemek ve alt-hücresel bölgelerindeki MT büyüme görselleştirmek için yeteneği MT örgütün bölgesel değerlendirme gerektiren uygulamalar için bu yaklaşım ideal kılar.
Ölçüm MT büyüme dinamikleri açısından geleneksel yöntemlerin bir başka kritik sınırlama çok büyük veri setleri ve veri analizi için gereken zaman olmuştur. Bu sınırlama yüksek zaman çözünürlükte EB kuyruklu yüzlerce el izleme ihtiyacından kaynaklanıyor. Ayrıca, bu ölçümler hücrelerin istatistiksel olarak önemli sayıda yapılır ve aynı zamanda kontrol ve experime çeşitli altında gerçekleştirilmesi gerekenntal koşullar. Son zamanlarda, bu kısıtlamalar canlı hücreler 35 time-lapse mikroskopi kullanılarak özellikle izleme EB3 kuyrukluyıldızların yönelik hesaplama analiz teknikleriyle aşılmıştır. Uygun kullanıldığında, bu hesaplama yaklaşım hem MT polimerizasyonu ölçme yüksek verimli bir yöntem sağlamanın yanı sıra el-izleme ile ilişkili insan hatası potansiyelini sınırlamak için hizmet vermektedir. MatLab tabanlı yazılım paketi kullanarak MT dinamiklerinin hesaplama analizleri, plusTipTracker, floresan etiketli EB3 kuyruklu 5,31,35,38 izleme MT büyüme ölçümleri için izin verir. Ayrıca, plusTipTracker yazılım büyüyen MT parça içinde EB3 kuyruklu kayboluşu dayalı MT felaket olaylarının (aka demontaj) hesaplamalarına izin verir, ve ilgi kullanıcı tanımlı bölgeler içinde MT büyüme dinamikleri alt-hücresel (aka bölgesel) analizi için izin verir . Bizim çalışmaları için, MT büyüme dinamikleri içinde karşılaştırıldıdallanmamış bölgelerin karşı veya hücre kenarları arka karşılık gelen olan dallanmış bölgeleri. plusTipTracker yazılım veri çıkışı, aynı zamanda ayrı ayrı hücre ve hücre altı bölgelerde renk kodlu parça bindirmeleri oluşturmak için de kullanılabilir.
Burada MT büyüme dinamikleri ve morfolojisi ve yön göç dallanma AT yönetmeliğine bu MT depolimeraz katkısını modüle MCAK rolünü araştırmak için kullanılan metodolojiyi açıklamaktadır. Yaklaşımımız kolaylıkla kültürlenebilir ve plazmid cDNA elektroporasyon ile indüklenen, geçici transfeksiyon oldukça uygundurlar primer insan hücre hattı, insan göbek damarı endotelial hücreleri (HUVECler) kullanılmıştır. Daha sonra yüksek çözünürlüklü kullanılan protein 3 (EB3) ve Mitotik Sentromer İlişkili kinesin (MCAK) 'e özgü cDNA Bağlama MT sonu ile transfekte HUVEC zaman atlamalı floresan mikroskopi MT dinamikleri üzerindeki etkileri HUVECler transfekte değerlendirmek oluşturur. EB3 ve PlusTipTracker tabanlı hesaplama görüntü analiz-etiketli MT artı uçları ölçmek ve MT büyüme dinamikleri üzerinde deneysel manipülasyon etkilerini karşılaştırmak için, zaman atlamalı görüntüler MT büyüme hızları ve MT büyüme ömürleri ölçmek oldu. Bu metodoloji MT dinamiklerinin çalışma ve alt-hücresel bölgelerindeki MT dinamiklerinin lokalize düzenleme AK dallanma ve göç anjiyogenik süreçlere nasıl katkıda tanımlanması için izin verir. Bu teknikler floresan canlı hücreler etiketli ve ifade edilebilir herhangi MAP soruşturma için de geçerlidir.
Morfoloji ve Göç Denemelerde HUVECler kullanma.
HUVEC içinde EB3 etiketli MT büyüme dinamiklerinin Canlı hücre görüntüleme daha sonra bir ECM sinyal işaret atanabilir şekilde MT büyüme ve HUVEC morfolojisi değişiklikleri ölçmek ve değerlendirmek amacıyla uygun ve tekrarlanabilir hücre kültürü koşulları gerektirir. HUVECler hücre şekli ve hareketliliği incelemek için mükemmel bir model oluşturmaktadır. Onlar hem çözülebilir hem de fiziksel bir sinyal uyaranlara yanıt olarak dramatik morfolojileri sergileyen, floresan etiketli cDNA transfeksiyon son derece uygundurlar ve, uygun hücre kültürü koşullarının 65-70 Resim vasküler tüplere kendilerini düzenleme yeteneğini korur. Böyle HUVEC olarak primer hücre kültürleri, hücreler sağlıklı olmasını sağlamak amacıyla ve deney sırasında normal davranacaktır dikkatli kullanım ve hücre geçiş sayısının izlenmesini gerektirmektedir. Örneğin, cytoskele araştıran deneylerHUVECler, tipik olarak on beş geçiş on yaklaşık eşit olmayan morfolojilerini görüntülemek için başlarken ton ve / veya hücre morfolojisi, HUVECler, onuncu hücre kültür geçişi ötesinde deneyler için kullanılmamalıdır.
Hücre yoğunluğu HUVEC sağlık ve çoğalmasının kritik bir düzenleyicisidir. HUVEC dallanma araştırmalar (yukarıdaki protokole 10,1-10,4 bakınız) hücreler ECM ile etkileşim fiziksel alan sağlamak ve dallı uzantıların uzatmak için, nispeten düşük hücre yoğunluğu kültürleri kullanmak. Buna karşılık, yara-kenar göç çalışmalarında, HUVECler önce yaralama bir tek tabaka kültürü (Protokol 10,5-10,8 bakınız). Bu tür, yara-kenar HUVECler nispeten un-dallı morfolojisi görüntüler gibi, kenar çıkıntıları önde gelen genişletmek ve onlar yara içine göç olarak yakın komşuları ile hücre-hücre etkileşimleri sergiler.
Uyarılar ve Yaşam HUVEC içinde Takibi MT Dynamics Avantajları.
Disk mikroskobu Spinning için mükemmel bir yaklaşımdıryüksek zaman çözünürlüklü konfokal görüntü netliği gerektiren deneysel hipotezleri test. Uygun kamera ve lazer modülü ile, bu mikroskopi yaklaşım düşük emisyonlu floresan duyarlı ve floresan mikroskobu diğer türlerine oranla azalmış photobleaching yardımcı olabilir. Farklı hücre tipleri çok çeşitli, EB3 etiketleme yaklaşımı kullanılarak MT büyüme dinamiği kapsamlı ölçümler oluşturmak için gerekli olduğu gibi da önemlisi, bu yaklaşım aynı zamanda da yüksek zaman çözünürlüklü görüntüleme orta için uygundur.
etiketleme EB3 metodolojisi MT artı uçları büyürken floresan etiketleme MTS diğer yöntemlere göre belirgin avantajları vardır, o da benzersiz dezavantajları vardır. Örneğin, aktif sökülmesi MTS nüfus ve stabil olmayan, dinamik MTS 71-74 nüfusu hem de dahil olmak üzere herhangi bir zamanda büyümemesi MT dizisinin bir bölümü vardır. EB3 MTS bu iki popülasyonlarının etiket olmaz veBu nedenle bu iki nüfus katkısı deneysel veri analizi dahil olmaz. Tüm MT diziyi değerlendirmek için alternatif yöntemler floresan etiketli MTS tüm toplumlarda içine birleştirir ve büyüyen küçülen tanımlanması için izin veren tubulin, ve durağan MTS ifadesi üzerine odaklanmıştır. Bununla birlikte, tüm MT dizi etiketleme mikrotübül organizasyon merkezi, (MTOC) hücrenin merkezi ve bitişik Mt tadını nispeten yüksek yoğunluğu hücre civarındaki MT uçlarının görüntü analizi bir dezavantaj yaratmaktadır periferi 75-77. Canlı hücrelerde floresan tubulin ve floresan EB3 ile MTS iki renkli ko-etiketleme kullanarak deneyler tübülin etiketli MTS büyük çoğunluğu da EB3 etiketli 78 olduğunu, niteliksel, ortaya koymuştur. Buna ek olarak, floresan tubulin ile etiketlenmiş MTS otomatik izleme etkili bir yöntem olmamıştır. Bu, araştırmada veri toplama demektiryon ve floresan tubulin ifade eden hücrelerde MT dinamiklerinin ölçümleri, hata eğilimli ve sıkıcı bir süreç bireysel MTS el izleme gerektirir. Bunun bir sonucu olarak, EB3 etiketli MTS otomatik hesaplama analizi, çok sayıda hücre türleri arasında ve deneysel rejimleri 35,79 çeşitli olan MT dinamikleri deney tatbik edilebilir MT dinamiklerini ölçmek için tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir.
HUVEC Morfolojisi ve Göç MT Büyüme Dinamikleri Bağlama.
Bir iskelet araştırmacı açısından bakıldığında, plusTipTracker otomatik izleme analiz biri son derece yararlı adaptasyon ölçmek ve MT büyüme dinamikleri hem tam hücre ve bölgesel değişiklikleri değerlendirmek için yeteneğidir. Bir hücre polarize olmak şartı yönlü hücre göçü için önemli bir ön koşuldur. Böyle, polarize sinyal ipuçları uzun yönlü hücre migrasyonu 30,31,51,54,56,80,81 için önemli itici faktörleri olarak bilinmektedir olarak </> Sup. Örneğin, VEGF gibi çözünebilir sinyal molekülleri endotel hücre tipleri 2,82-87 VEGF cue doğru aktin polimerizasyonu MT büyümesini teşvik. Buna ek olarak, (örneğin, uyum ve boyut mechanosensing için) ECM ile fiziksel etkileşim yanıt olarak, HUVECler yerel MAP dallı uzantıların uzatılması olan MT büyümesini teşvik etmek için regüle ederek MT dinamiklerini modüle eden ve bu yönünde, HUVEC göçünün kılavuzlanmasına yarar işaret 5,31,88. Böylece, hücre dışı bir sinyal uyaranlara yanıt olarak polarizasyon iskelet dinamikleri lokalize değişikliklerin deneysel değerlendirilmesi gerekliliğini vurgulamaktadır.
(EB3 yaklaşımını kullanarak) MT büyüme dinamikleri ve HUVEC hücre göçü eşzamanlı canlı hücre görüntüleme MTS saniyelik bir zaman ölçeğinde büyümeye çünkü hücre morfolojisi ve yön göç değişiklikler saatlik bir zaman ölçeğinde meydana ederken, gerçekleştirmek son derece zordur. Oysa her iki süreç yakından linke vardırd. Ayrıca, ikinci kez ölçekte floresan etiketli EB3 sürekli, hızlı görüntüleme EB3 sinyalinin photobleaching yol açar. EB3 (1-2 dk edinme serisi) her 30 dakikada başarılı olmuş kısa görüntüleme serisi yaparak bu sorunu aşmak için çalışır, ancak sadece EB3 optimal ifade vardı EC küçük bir sayıda başarılı olabilir ve bu olumsuz görüntüler vermedi tekrarlanan lazer aydınlatma 5 etkileri.
MT büyüme dinamikleri hücre morfolojisi ve göç değişikliklere nasıl katkıda yorumlarıyla sağlayan alternatif bir yaklaşım Faiz (ROI) aracı 35 (Protokol 6.6 bakınız) plusTipTracker Bölgesidir. tüm hücre MT büyümesi alt bölünmüş MT büyüme parça daha sonra ayıklanır ve analiz edilebileceği kullanıcı tanımlı bölgeler, içine olmak izler Bu metodoloji sağlar. Örneğin, hücrenin "dallı olmayan" bölgelerde karşı "dallı" karşılaştırmaları MTs daha s büyümek olduğunu ortaya koymuşturaşağı ve daha fazla sürekli kollara ayrılmış bölgelerde dallanmamış hücre kenarına 5 ile karşılaştırıldığında. polarize yara kenarı HUVEC olarak, kenarı ve arka kenarı MT büyüme dinamiği karşılaştırmalar MCAK kaynaklı MT sökme arka kenarı kenarı olan spesifik inhibe değil, ortaya koymuştur. lider ve Rac1 ve / veya MCAK fosforilasyonu mutantlar ifade HUVEC kenar MT büyüme dinamiklerini firar Bölgesel değerlendirme ayrıca Aurora-A kinaz Rac1 kaynaklı aktivasyon özellikle ve yerel HUVEC kutuplaşma ve yön göç sürücü ön kenarında içinde MCAK aktivitesini inhibe ortaya 31. Böylece, MT büyüme dinamikleri ve dallı çıkıntılar ve / veya yara kenar HUVEC ön kenarına içinde MT büyüme dinamikleri bölgesel değerlendirilmesi otomatik izleme kombinasyonu bize HUVEC morfolojisi ve göç MT büyüme dinamiklerini bağlamak için izin verdi.
açıklanan protokoller designe vardırd HUVEC kültür ve deneysel araştırma için genellikle basit ve son derece tekrarlanabilir bir metodoloji sağlamaktır. Bununla birlikte, iletişim kuralı detayların bir çok da, deney yöntemi yapma hataları ya da zorluklar olanağı sağlayan, karmaşık ve zaman alıcı bir iştir. protokol boyunca potansiyel sorunları çözmek için teşebbüs ederken, burada daha az yaygın ya da başka yöntem protokolleri içinde notlar olarak kısaltılır potansiyel problemlerin ek, ayrıntılı sorun giderme sağlanır.
poliakrilamid yüzeylerde ile kaplama lamelleri (Protokol 2.2), cam lamelleri aktive cam poliakrilamid bağlanması, poliakrilamid aktive ve daha sonra poliakrilamid için ECM bağlanması karmaşık doğası doğar ortak sorunu ile ilgili. Bir özellikle zor ve potansiyel olarak sorunlu bir adım Polya maruz kalmasını takiben fibronektin / poliakrilamid jel üzerine HUVECler kültürleme olduğunu2 mM sülfo-SANPAH için crylamide kaplı lamelleri (yukarıda adım 2.2.2.6). Bu yüzeylerde HUVECler kültürleme başarısı için kritik öneme sahiptir sülfo-SANPAH tamamen ECM birleştikten sonra deneysel sistemden çıkarılmalıdır. Bu en iyi GKD 2 O ile yıkama ve gece boyunca bir karıştırıcıda GKD 2 O lamelleri inkübe edilmesi ile gerçekleştirilebilir. poliakrilamid ECMs kültüre hücreleri hayatta değilse canlılığı, beklenen artış ve fibronektin (adım 2.2.2.9) konjugasyon sonra sülfo-SANPAH yıkanması tekrarlanan küçükse potansiyel bu sorunu hafifletmek veya tavsiye edilir.
Protokolün 3 (a lamel cDNA transfeksiyonu ve HUVEC kültür) İlgili, elektroporasyon prosedürün başarısı için büyük bir etkisi hücrelerinin trypsinization sırasında hem HUVEC'lerin ele tamamlanmasının ardından plastik şişeden bunları kaldırmak ve etmektir elektroporasyon (yukarıda, 3.3-3.4 adım). Bakım için kritik öneme sahiptirtripsin ve şişeye (genellikle 1-2 dakika) yüzeyi üzerinde "yuvarlak-up" hücreleri için gereken zamanı aşmayacak şekilde ise, tam HUVECler izler. Tripsin Aşırı zaman hücreleri fibronektin kaplı lamelleri (3.4 adım) üzerine kaplama ve daha sonra yüzeye tutunur başarısız kadar genellikle fark edilmez HUVEC ölüm, önemli bir nedenidir.
elektroporasyon tamponunda uzun süre askıya zaman benzer öneme sahip, HUVECler (ve çoğu primer hücre tipleri) iyi ücret yoktur. daha büyük ölçekli deneyler esnasında, kullanıcı elektroporasyon gerektiren beş veya daha fazla koşulu vardır, örneğin, tek-a-zaman, tek tek tüpler içinde pelet hücreleri (transfeksiyon başına 1 tüp) tutmak ve bunları karıştırmak için daha da elektroporasyon hemen önce elektroporasyon tamponu içinde. Bu yaklaşım elektroporasyon tampon ve en üst düzeyde HUVEC hayatta kalma kuluçka süresini en aza indirir. Ayrıca, tam bir kültür ortamında acil kurtarma de cr olduğunuitical Elektroporasyondan. Bir dakika ya da daha fazla, aşağıdaki elektroporasyon kurtarma gecikme tam HUVEC ölüme yakın neden olabilir ve bu nedenle kaçınılmalıdır.
İlgili hücre göçü deneyi (Protokol 9), son derece yüksek bir yoğunlukta HUVECler kültür tekniği fibronektin kaplı lamel kurutma gerektirir (protokol 3'te tarif edilmiştir), geleneksel HUVEC hücre kültürü metodolojisi (aşama 9.2'de anlatıldığı gibi) kritik bir değişiklik bağlıdır lamel çok küçük bir alana HUVEC kültürü sağlamak için. lamel tamamen kurutulur edilmemiştir ya da fibronektin ile lamel ön kaplama (adım 2.1 veya 2.2) halinde etkin değildi Çoğu zaman, örtücü kısım üzerine yerleştirilmiştir ortam ihtiva eden hücreler, yüzey gerilimini kaybeder ve genişleyecektir böylece lamel hücrelerin yoğunluğunu azaltarak, lamel kenarları. bu potansiyel sorunu gidermek için bir yöntem lamel ve ardından ortamı aspire etmektir5-10 dakika biyogüvenlik kabini arkasına (hala 35mm çanak) lamel yerleştirin. Bu uyarlama çanak kurutmaya yardımcı olmak için kabin içinde hava akışına izin vermek için yardımcı olabilir. gözle görülür sıvı hava kuruduktan sonra lamel kalırsa, sıvı noktalar aspire ve tekrar biyogüvenlik kabini 5-10 ek dakika kurumaya bırakın. Tamamen bu olası sorunu önlemek için bir yol olduğuna dikkat etmek önemlidir, ancak bu protokolün tekrarlanan uygulama ile bir sorun daha az hale gelir. Aynı zamanda hücre göçü deneyi (ya da genel olarak herhangi bir tahlil,) için lamelleri hazırlarken, ekstra lamelleri hazırlamak ve ekstra HUVECler hazır-to-go yol boyunca sorunları durumunda sahip olduğu bir sorun giderme öneridir.
Akılda bu sorun giderme hususlar ile, tartışılan protokoller ve gelecekteki hücre biyolojisi araştırmalarında onların etkileri faydasını vurgulamak için de önemlidir. polyacr uygulanabilirliğiilamid yaklaşım, geniş, ve (yukarıda tarif edilen) hücre-ECM angajman iki boyutlu çalışmalar, aynı zamanda, üç-boyutlu bir inceleme 5 de içerir. Bu uygulama HUVECler fizyolojik ortamlarda hücre şekli ve göçü düzenleyen nasıl anlayışımızı artırarak için kritik öneme sahiptir ve araştırmacılar, hücre iskeleti değişikliklerle koordine nasıl morfolojik değişiklikler temel bir anlayış sağlamalıdır. Burada anlatılan protokoller MT büyüme dinamikleri ölçümleri odaklanmış olsa da, protokollerin çoğunluğu ve hücre-ECM etkileşimleri diğer mikroskobik ölçülebilir yönleriyle herhangi bir sayı ölçmek için adapte edilmelidir olabilir. MT dinamikleri açısından, sunulan protokolleri kullanarak incelenebilir en az 14 kinesinlerin 89 ailelerine, HUVEC kutupluluk ve yönetmenliğini göç katkıda potansiyel rolü olan her ve tüm dahil, çok sayıda haritalar bulunmaktadır.
Gelecekteki araştırmalar gereken birLSO hastalıklı devletlerin karşı normal hücre ECM angajman hedeflenmelidir. Burada sunulan HUVEC protokolleri normal vasküler homeostatik süreçlerin soruşturmalara uygulanabilir yanı sıra birkaç isim, kalp hastalığı, retinopati, tümör büyümesi ve metastazı da dahil olmak üzere hastalık durumlarıyla vardır. endotel hücre vasküler anjiyojenez, yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe ile izlenebilir şekilde hücre ECM birleştirme çalışmaları için sağlayacak mikroskopik çalışmaları ile müsait uyumu gözle saydam ECM ve poliakrilamid substratlar konjüge. Deneysel yaklaşımlara Bu tür zaten önemli endotel hücre şekli, polarite, göç farklılıkları ve bu süreçleri 5,31,90 düzenleyen proteinlerin etkilerini ortaya çıkarmak için başladı. Gelecek çabalar ECM uyum ve çok boyutluluk mechanosensing kombinasyonu hedef ve iskelet dinamiklerini düzenleyen yerel kontrol proteinlerine hizmet edebilir nasıl tespit hedeflemelidir.
The authors have nothing to disclose.
plusTipTracker MT analiz yazılımı geliştirmek için rehberlik ve bu çalışmalarda kullanılan floresan cDNA yapıları birçok sağlamak için tartışmalar, Michelle Baird ve Mike Davidson Dr. Clare M. Waterman ve Kathryn Applegate ve Gaudenz Danuser özel teşekkürler. Bu eser dan KAM bir hibe ile kısmen desteklenmiştir Ulusal Kalp Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH). (Grant: 4K22HL113069).
Aurora A Inhibitor I | Selleck Chemicals | S1451 | |
2% Bis solution | Bio-Rad | 1610142 | |
3-aminopropyltrimethyloxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
40% acrylamide | Bio-Rad | 1610140 | |
405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module | Agilent Technologies | 99462 | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
anti–mouse IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-1688-31 | |
anti–rabbit IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-7788-31 | |
ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET455/50m | |
ET525/36m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET525/36m | |
ET605/70m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET605/70m | |
ET700/75m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET700/75m | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | RPI Products | A30075-100.0 | |
Clara cooled charge-coupled device camera | Andor Technology | 77026010 | |
Cy3 donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
Dyelight 649 goat anti-rat | Jackson ImmunoResearch | 112-496-068 | |
EGM-MV SingleQuot Supply & Growth Factors (contents shown below) | Lonza | CC-4143 | |
Fetal bovine serum 25 mL | |||
Bovine brain extract 2.0 mL | |||
Gentamycin sulfate 0.5 mL | |||
Epidermal growth factor 0.5 mL | |||
Hydrocortisone 0.5 mL | |||
Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/mL, 10,000 ug Strep/mL) 10.0 mL | |||
EGTA | Sigma-Aldrich | E3884-100G | |
Electronic shutter | Sutter instrument | 77016099 | |
Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
Glutaraldehyde | Thermo Fisher Scientific | S80026 | |
HALT Protease inhibitor | Thermo Fisher Scientific | PI-78425 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
HRP goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-036-062 | |
HRP goat anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-036-045 | |
Immuno-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad | 162-0174 | |
Lanolin | Thermo Fisher Scientific | 8006-54-0 | |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643-500G | |
Microscope | Nikon TiE | MEA53100 | |
Motorized stage | ASI Technologies | MS-2000 | |
Mounting medium | Dako | CS70330-2 | |
Mouse anti-Aurora A | Abcam | ab130156 | |
Mouse anti-GAPDH | Abcam | ab9484 | |
Mouse anti-MCAK | Abcam | ab50778 | |
Mouse anti-tubulin (DM1A) | Cell Signaling Technology | 3873S | |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
NIS Elements software | Nikon | MQS310000 | |
Nucleofector Kit V | Lonza | VACA-1003 | Contains the electroporation buffer |
Paraffin | Thermo Fisher Scientific | P31-500 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000IU Pen/mL,10,000ug Strep/mL) | MP Biomedicals | 91670249 | |
Petroleum jelly | Dow Corning | 2021854-1113 | |
Pipes | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
plusTipTracker | |||
Rabbit anti-GFP | Abcam | ab290 | |
Rabbit anti–pT288–Aurora A | Abcam | ab18318 | |
Rat anti–α-tubulin | AbD Serotec | MCA78G | |
Sodium borohydride | Thermo Fisher Scientific | 678-10 | |
Spinning disk | Andor Technology | Yokagawa CSU-X1 | |
Sulfo-SANPAH | Thermo Fisher Scientific | PI-22589 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34080 | |
Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP151-500 | |
Trypsin | Corning | MT25053CI | |
Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337 |