Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.
The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.
A angiogênese é desencadeada por sinais extracelulares de sinalização que promovem células endoteliais (ECS) para polarizar, migrar com especificidade direcional, e formam nova vasculatura em tecidos que exigem fornecimento de sangue. Os factores contributivos pensados para conduzir a angiogénese são sinais a partir da matriz extracelular (ECM). Em resposta a estímulos físicos, ECs conceder novos ramos com especificidade direcional para guiar o movimento direcional na formação do 1,2 rede vascular. A arquitetura da morfologia CE e ramificação é definida por regulamento localizada do citoesqueleto de microtúbulos (MT) de uma forma que é coordenado com o regulamento da OTCA-miosina contratilidade 3. Para que ramos da CE para formar, miosina-II deve ser localmente reprimidos, resultando em saliências membrana localizadas 4. Ao mesmo tempo e no mesmo local no interior da célula, a dinâmica de crescimento tornam-se MT modificado resultando em crescimento lento MT e persistente para promover elon ramogação e estabilidade 5. Este regulamento do citoesqueleto coordenado permite ECs para polarizar sua morfologia para facilitar a migração direcional.
O desenvolvimento de uma morfologia celular polarizada requer montagem MT polarizada 6. Na migração células epiteliais, o MTS crescer lentamente e persistentemente especificamente no bordo de ataque da célula 7-9; enquanto nos neurónios, o início e o alongamento dos axónios ou dendritos requer que o MTS não só estão presentes, mas que estão a ser sujeitos dinamicamente os processos de montagem e desmontagem de 10-15. Desta forma, o controlo da dinâmica de crescimento localizada MT determina a arquitectura da célula e permite a rápida remodelação da morfologia celular como ECs navegar através da sua ECM.
dinâmica de crescimento MT são regulados por famílias de proteínas motor molecular e proteínas não-motorizado, denominado microtúbulos Proteínas Associadas ou microtúbulos proteínas que interagem (doravante referred como mapas). Os mapas podem ser localmente activado ou inactivado, normalmente através de cascatas de sinalização iniciadas na interface célula-ECM 16,17. função, mapas Uma vez ativo através da ligação à MT e alterando a cinética de montagem e desmontagem MT; funcionando assim para localmente regular a dinâmica MT, a fim de promover a forma da célula e polaridade 18-20. Mitótico Centromere Associated Cinesina (MCAK) é um mapa família Cinesina-13 que se liga a extremidades MT e casais hidrólise do ATP para MT desmontagem 21-23. Este papel funcional de MCAK é conhecido por ser crítico dentro do fuso mitótico 24-28, bem como durante a interfase 29,30. Dentro interfase ECs, desmontagem MT mediada por MCAK é regulada por localizada Aurora-A fosforilação induzida de MCAK em resposta a ferida de ponta a ativação induzida da pequena GTPase Rac1. O resultado desta cascata de sinalização é a inibição de MCAK no bordo de ataque de células endoteliais, resultando em crescimento MT polarizada para o leading borda e desmontagem MT induzida por MCAK no bordo de fuga de migrar ECs 31.
metodologias tradicionais para medir a dinâmica de crescimento MT têm tipicamente usado rastreamento mão de qualquer tubulina fluorescente marcado ou, mais recentemente, fluorescente marcado com proteína de ligação MT End 1 ou 3 (EB1 ou EB3, respectivamente). A abordagem tubulina fluorescentes tem a vantagem de rotular a matriz MT inteiro. No entanto, porque a maioria dos tipos de células mitóticas manter um agregado radial de Mts durante a interfase 8,32,33, Mts perto do centrossoma são muito denso, e, como resultado, o crescimento de rastreamento MT e desmontagem da tubulina com fluorescente é geralmente limitada ao periférico regiões da célula. Devido a essas limitações, a utilização de proteínas EB marcado com fluorescência (EB1 ou EB3) tem sido a abordagem mais comum para avaliar a dinâmica MT. Porque EBs única rotular as crescentes mais-extremidades dos MTs, eles aparecem como pequenos (1-3 mm), fluorescente brilhantemente vemts, proporcionando assim um marcador facilmente discernível de MT polimerização com fundo muito limitado de fluorescência 34-37. Embora o facto de que a EBS etiqueta apenas um subconjunto da matriz MT representa uma grande força da abordagem EB, também realça uma limitação importante, que o MTS não-crescimento não são rotulados pela abordagem EB3. No entanto, a capacidade de medir e controlar cometas EB3 ao longo do tempo e visualizar o crescimento MT dentro das regiões sub-celular que esta abordagem seja ideal para aplicações que requerem avaliação regional da organização MT.
Outra limitação crítica das metodologias tradicionais de medição dinâmica de crescimento MT tem sido muito grandes conjuntos de dados e o tempo necessário para a análise de dados. Essa limitação decorre da necessidade de acompanhamento lado de centenas de cometas EB na resolução temporal alta. Além disso, estas medições devem ser feitas num número estatisticamente significativo de células e também realizada sob uma variedade de controlo e experimecondições ntal. Recentemente, estas restrições foram superados através de técnicas de análise computacional especificamente dirigidas a cometas rastreamento EB3 meio de microscopia de lapso de tempo em células vivas 35. Quando usado adequadamente, esta abordagem computacional serve tanto para restringir a possibilidade de erro humano associado com a mão-de rastreamento, além de fornecer um método de alto rendimento de medição MT polimerização. Análise computacional da dinâmica MT utilizando o pacote de software baseado em MatLab, plusTipTracker, permite medições de crescimento MT por rastreamento cometas EB3 fluorescente-etiquetados 5,31,35,38. Além disso, o software plusTipTracker permite cálculos de eventos catastróficos MT (aka desmontagem) com base no desaparecimento de cometas EB3 dentro de uma faixa MT crescendo, e permite a análise de sub-celular (aka regional) da dinâmica de crescimento MT dentro de regiões definidas pelo usuário de interesse . Para os nossos estudos, a dinâmica de crescimento MT foram comparadas dentroregiões ramificada contra regiões não ramificados, ou dentro de líder em relação à direita bordas celulares. A saída de dados a partir de software plusTipTracker também pode ser usado para gerar sobreposições de pista com código de cores para células individuais e as regiões sub-celulares.
Aqui nós descrevemos a metodologia utilizada para investigar o papel do MCAK na modulação da dinâmica de crescimento MT e a contribuição deste depolimerase MT para a regulamentação da EC ramificação morfologia e migração direcional. A nossa abordagem utilizada uma linha celular humana primária, Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana (HUVECs), que são facilmente cultivadas e altamente passível de induzida por electroporação, transfecção transiente de ADNc de plasmídeo. Em seguida, usamos de alta resolução, microscopia de fluorescência de lapso de tempo de HUVECs transfectadas com MT End Binding Protein 3 (EB3) e cDNA espec�ico mitótico Centromere Associated Cinesina (MCAK) constrói para avaliar os efeitos sobre a dinâmica MT transfectadas HUVECs. análise de imagem com base computacional de PlusTipTracker-EB3MT marcado com mais extremidades foi medir as velocidades de crescimento MT e vidas de crescimento MT em imagens de lapso de tempo, para medir e comparar os efeitos das manipulações experimentais sobre a dinâmica de crescimento MT. Esta metodologia permite o estudo da dinâmica de MT e a identificação de como a regulação da dinâmica MT localizada dentro de regiões sub-celulares contribui para os processos angiogénicos CE de ramificação e a migração. Estas técnicas são aplicáveis às investigações de qualquer mapa que podem ser marcados com fluorescência e expressos em células vivas.
Usando HUVECs na morfologia e Migração Experiências.
processamento de imagem de células vivas da dinâmica de crescimento MT marcado com EB3 dentro HUVECs requer condições de cultura de células adequadas e reprodutíveis, a fim de medir e avaliar alterações no crescimento e morfologia MT HUVEC, de tal forma que eles podem ser atribuídos a uma sugestão ECM sinalização. HUVECs representam um excelente modelo para estudar a forma da célula e a motilidade. Eles são altamente passíveis de transfecção com cDNAs fluorescente marcado, eles exibem morfologias dramáticas em resposta a ambas as pistas de sinalização solúveis e físicos, e eles manter a capacidade de organizar-se em tubos vasculares quando fornecido condições de cultura de células apropriadas 65-70. culturas de células primárias, tais como HUVECs, requerem um tratamento e acompanhamento de passagem número de células cuidado para assegurar que as células são saudáveis e que eles vão se comportar normalmente durante a experimentação. Por exemplo, quando a realização de experiências que investigam a cytoskeletonelada e / ou a morfologia das células, células HUVEC não devem ser utilizados em experiências para além da décima passagem de cultura de células, como células HUVEC tipicamente começam a apresentar morfologias não-uniforme em torno passagem doze a quinze.
A densidade celular é também um regulador crítico de saúde HUVEC e a proliferação. investigações ramificação HUVEC (ver Protocolo de 10,1-10,4, acima) utilizar culturas de células de densidade relativamente baixa, a fim de fornecer as células de espaço físico para interagir com a sua ECM e estender as saliências ramificada. Em contraste, nos estudos de migração ferida de ponta (ver Protocolo 10,5-10,8), células HUVEC são cultura numa monocamada antes do ferimento. Como tal, as células HUVEC ferida de ponta exibir uma morfologia relativamente não-ramificado, levando saliências se estendem da borda, e exibem interacções célula-célula com os seus vizinhos imediatos à medida que migram para dentro da ferida.
Advertências e vantagens do rastreamento MT Dynamics em viver HUVECs.
Spinning microscopia de disco é uma excelente abordagem paratestar hipóteses experimentais que requerem clareza de imagem confocal com tempo de resolução. Com o módulo da câmara e do laser apropriado, esta abordagem é sensível a microscopia de fluorescência de baixa emissão e pode ajudar na fotodegradação reduzida em comparação com outros tipos de microscopia de fluorescência. Mais importante, esta abordagem é também adequada para moderada a imagem de alta resolução de tempo, como é necessário para a geração de medições abrangentes da dinâmica do crescimento MT utilizando a abordagem de marcação EB3, em uma variedade de diferentes tipos de células.
Embora a metodologia de rotulagem EB3 crescente MT-Plus extremidades tem vantagens distintas em relação a outros métodos de marcação fluorescente MTS, que também tem desvantagens únicas. Por exemplo, há uma proporção da matriz MT que não está a crescer activamente, em qualquer momento dado, incluindo a população de Mts desmontagem e a população de Stábile MT não dinâmicos 71-74. EB3 não rotular essas duas populações de MTs ePor conseguinte, a contribuição destas duas populações não seria incluído na análise de dados experimentais. metodologias alternativas para avaliar a matriz MT todo têm-se centrado sobre a expressão da tubulina marcada com fluorescência, que incorpora em todas as populações de MTs e permite a identificação de crescimento, encolhimento e estável MTs. No entanto, devido à densidade relativamente elevada da matriz MT perto do centro da célula e adjacente ao centro do organizador de microtúbulos (MTOC), etiquetagem, a matriz MT toda cria uma desvantagem na realização de análise de imagem de extremidades MT que não estão perto da célula periferia 75-77. Experimentos usando co-rotulagem de duas cores de MTs com a tubulina fluorescentes e EB3 fluorescente em células vivas têm revelado, qualitativamente, que a grande maioria das MTs marcado com tubulina também são 78 marcados com EB3. Além disso, não tem sido um método eficiente de seguimento automatizado de Mts marcadas com fluorescente tubulina. Isto significa que os dados Collecção e as medidas de dinâmica de MT em células expressando tubulina fluorescentes requerem acompanhamento mão do MTs individuais, um processo que é propenso a erros e tedioso. Como resultado, a análise computacional automatizado de EB3 MT marcado tornou-se a metodologia preferida para a medição dinâmica MT, uma vez que pode ser aplicada a MT dinâmica experiências em vários tipos de células e dentro de uma variedade de regimes experimentais 35,79.
Ligando MT Crescimento Dynamics para HUVEC Morfologia e Migração.
Do ponto de vista de um pesquisador do citoesqueleto, uma adaptação extremamente útil na análise de rastreamento plusTipTracker automatizado é a capacidade de medir e avaliar ambas as alterações celulares e regionais inteiros na dinâmica de crescimento MT. A exigência de uma célula para se tornar polarizada é um pré-requisito essencial para migração de células direcional. Como tal, os sinais de sinalização polarizados têm sido conhecidos como fatores determinantes fundamentais para a migração de células direcional 30,31,51,54,56,80,81 </sup>. Por exemplo, as moléculas de sinalização solúveis em água tais como VEGF induzir a polimerização de actina e crescimento MT para a sinalização de VEGF em tipos de células endoteliais 2,82-87. Além disso, em resposta às interações físicas com a ECM (por exemplo, conformidade e mechanosensing dimensionalidade), HUVECs modular a sua dinâmica MT regulando localmente mapas para promover o crescimento MT dentro alongando saliências ramificados, e isso serve para orientar a migração HUVEC na direção do cue 5,31,88. Assim, a polarização em resposta às sugestões de sinalização extracelulares destaca a necessidade de uma avaliação experimental de alterações localizadas na dinâmica do citoesqueleto.
processamento de imagem de células vivas simultânea de dinâmica MT de crescimento (utilizando a abordagem EB3) e a migração de células HUVEC é extremamente difícil de realizar, porque MT crescer numa escala de tempo de segundos, ao passo que as alterações na morfologia celular e migração direccional ocorre numa escala de tempo de horas. No entanto, ambos os processos estão intimamente Linked. Além disso, imagiologia contínua, rápida de EB3 marcado com fluorescência na segunda escala de tempo conduz a fotodegradação do sinal EB3. As tentativas para superar este problema através da realização de séries de imagens com falta de EB3 (séries aquisição 1-2 min) a cada 30 minutos foram bem sucedidos, mas só poderia ser realizado em um pequeno número de ECs que teve expressão ideal de EB3 e que não exibir adverso para efeitos de iluminação laser foi repetida 5.
Uma abordagem alternativa que permite interpretações de como a dinâmica de crescimento MT contribuir para alterações na morfologia celular e migração é a Região plusTipTracker de Interesse (ROI) da ferramenta 35 (ver Protocol 6.6). Esta metodologia permite o crescimento de células MT toda faixas para ser sub-dividido em regiões definidas pelo utilizador, a partir do qual MT faixas de crescimento podem em seguida ser extraídos e analisados. Por exemplo, comparações de "ramificado" versus regiões "não-ramificados" da célula revelaram que MTs crescer mais spequenos e mais persistente no interior das regiões ramificadas em relação à periferia da célula não-ramificado 5. Em polarizada ferida de ponta HUVECs, as comparações dos principais borda e de fuga dinâmica de crescimento borda MT revelou que induzida por MCAK desmontagem MT é inibida especificamente dentro do bordo de ataque, mas não a bordo de fuga. avaliação de ataque e de fuga dinâmica de crescimento borda MT em HUVECs expressando Rac1 e / ou mutantes de fosforilação de MCAK Regional revelou ainda que a ativação induzida por Rac1 da Aurora-A cinase especificamente e localmente inibe a atividade MCAK dentro da ponta para conduzir HUVEC polarização e migração direcional 31. Assim, a combinação de monitoramento automatizado da dinâmica de crescimento MT e avaliação regional da dinâmica de crescimento MT dentro das saliências ramificados e / ou o bordo de ataque da ferida de ponta HUVECs nos permitiu ligar dinâmica de crescimento MT à morfologia HUVEC e migração.
Os protocolos descritos são designed para fornecer uma metodologia geralmente simples e altamente repetível para a cultura HUVEC e investigação experimental. No entanto, muitos dos pormenores de protocolos são complexos e morosos, o que, por sua vez, proporciona uma oportunidade para erros ou dificuldades em conduzir a metodologia experimental. Embora tenha sido tentado resolver problemas potenciais ao longo do protocolo, aqui é fornecida solução de problemas adicionais, detalhado de potenciais problemas que são menos comuns ou de outra forma abreviada como notas dentro dos protocolos de metodologia.
Relacionado com lamelas de revestimento com substratos de poliacrilamida (Protocolo de 2,2), um problema comum que se levanta é a natureza complexa da activação de lamelas de vidro, o acoplamento de poliacrilamida para o vidro, a activação de poliacrilamida, e depois acoplamento ECM para a poliacrilamida. Um passo particularmente difícil e potencialmente problemática é a cultura de células HUVEC sobre o gel de f ibronectina / poliacrilamida após a exposição do poliAlamelas revestidas com crylamide a 2 mM de sulfo-SANPAH (passo 2.2.2.6, supra). É crítico para o sucesso da cultura de células HUVEC sobre estes substratos que sulfo-SANPAH ser completamente removido do sistema experimental que se segue conjugação ECM. Isto pode ser melhor conseguida por lavagem com ddH2O e incubando as lamelas em ddH2O num agitador durante a noite. Se as células cultivadas sobre as ECMs poliacrilamida não sobrevivem, ou se a viabilidade é menor do que o esperado, o aumento e a lavagem repetida da sulfo-SANPAH após conjugação a fibronectina (passo 2.2.2.9) é recomendado para potencialmente aliviar este problema.
Relacionadas com Protocol 3 (transfecção cDNA e da cultura HUVEC em uma lamela), uma grande influência para o sucesso do processo de eletroporação é a manipulação das HUVECs tanto durante tripsinização das células para removê-los do frasco de plástico, e após a conclusão da a electroporação (passos 3,3-3,4, supra). É crítico para cuidarmonitorar completamente o HUVEC enquanto em tripsina, e não deve exceder o tempo necessário para que as células "round-up" na superfície do balão (normalmente 1-2 minutos). tempo excessivo em tripsina é uma das principais causas de morte de HUVEC, que normalmente não é realizada até que as células são plaqueadas em lamelas revestidas com fibronectina (passo 3.4) e, em seguida, deixar de anexar ao substrato.
De importância semelhante, HUVECs (ea maioria dos tipos de células primário) não se saem bem quando suspenso por longos períodos no buffer de eletroporação. Durante as experiências em maior escala, por exemplo, onde o utilizador tem cinco ou mais condições que requerem a electroporação, é preferível manter as células sedimentadas em tubos individuais (um tubo por transfecção) e misturá-los, uma-a-uma-vez , no tampão de electroporação imediatamente antes da electroporação. Esta aproximação minimiza o tempo de incubação em tampão de electroporação e sobrevivência HUVEC maximizada. Além disso, o salvamento imediato em meios de cultura completos é também Critical Após a electroporação. atrasos de resgate de mais uma sequência eletroporação minuto ou pode resultar em quase morte completa HUVEC e, portanto, deve ser evitado.
Relacionado ensaio de migração de células (Protocolo 9), a técnica de cultura de HUVEC a extremamente alta densidade depende de uma modificação crítica (descrito no passo 9.2) da metodologia de cultura celular tradicional HUVEC (descrito no Protocolo 3) que requer a secagem da lamela fibronectina revestido , a fim de permitir que a cultura de HUVEC a uma área muito pequena da lamela. Muitas vezes, se a lamela não é completamente seca ou se o revestimento antes de a lamela com fibronectina (passos 2.1 ou 2.2) não foi eficaz, as células contendo meios de comunicação que é colocada sobre a lamela irá perder a sua tensão superficial e expandir-se para o arestas da lamela, reduzindo assim a densidade de células na lamela. Um método para resolver este problema potencial é para aspirar a mídia da lamela e, em seguida,colocar a lamela (ainda na sua placa de 35 mm) para a parte de trás do armário de segurança biológica durante 5-10 min. Esta adaptação pode ajudar a permitir que o fluxo de ar dentro do armário para ajudar na secagem do prato. Se qualquer líquido visível permanece sobre a lamela depois de secagem ao ar, aspirar os pontos líquidos e novamente deixar secar ao ar durante 5-10 minutos adicionais na cabine de segurança biológica. É importante notar que não há nenhuma maneira de evitar completamente este problema potencial, mas torna-se menos de um problema com a prática repetida do protocolo. É também uma recomendação solução de problemas que, na preparação para o ensaio de lamelas migração de células (ou de qualquer ensaio, em geral), para preparar lamelas adicionais e tem HUVECs extras pronto-a-go em caso de problemas ao longo do caminho.
Com estas considerações de resolução de problemas em mente, também é importante destacar a utilidade dos protocolos discutidos e suas implicações na investigação em biologia celular futuro. A aplicabilidade ao polyacrabordagem carboxílico é amplo, e inclui não apenas estudos bidimensionais de engajamento célula-ECM (descrito acima), mas também investigações tridimensionais 5. Esta aplicação é fundamental para aumentar a nossa compreensão de como HUVECs regular a forma e migração celular em ambientes fisiológicos e deve fornecer aos investigadores uma compreensão básica de como as mudanças morfológicas são coordenadas com as alterações do citoesqueleto. Embora os protocolos descritos aqui estão focados nas medições da dinâmica do crescimento MT, a maioria dos protocolos pode e deve ser adaptado para medir qualquer número de outros aspectos microscopicamente mensuráveis de interacções célula-ECM. Com relação à dinâmica MT, há inúmeros mapas, incluindo pelo menos 14 famílias de kinesins 89, cada um com um papel potencial na contribuição para HUVEC polaridade e migração dirigida, e tudo o que pode ser investigadas utilizando os protocolos apresentados.
futuras investigações deve umlso ser alvo de envolvimento célula-ECM no normal versus estados doentes. HUVEC protocolos aqui apresentados são aplicáveis para investigações de processos homeostáticos vasculares normais, bem como para estados de doença, incluindo doença cardíaca, a retinopatia, o crescimento de tumores e metástases, para citar alguns. Conjugando visivelmente transparentes ECM e poliacrilamida substratos de conformidade receptivo com os estudos microscópicos permitirá estudos de noivado célula-ECM tais que a angiogênese vascular endotelial pode ser monitorada com alta resolução espacial e temporal. Estes tipos de abordagens experimentais já começaram a revelar diferenças importantes na forma da célula endotelial, polaridade, a migração e os efeitos de proteínas que regulam estes processos 5,31,90. Os futuros esforços devem visar a identificação como a combinação de conformidade ECM e mechanosensing dimensionalidade pode servir para localmente proteínas de controle que têm como alvo e regulam a dinâmica do citoesqueleto.
The authors have nothing to disclose.
Um agradecimento especial ao Dr. Clare M. Waterman para orientação e discussões, Michelle Baird e Mike Davidson para fornecer muitas das construções de cDNA fluorescentes utilizadas nestes estudos, e Kathryn Applegate e Gaudenz Danuser para o desenvolvimento de software de análise de plusTipTracker MT. Este trabalho foi apoiado, em parte, por uma concessão para KAM from the Heart, Lung Blood Institute (NHLBI) e os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) Nacional. (Grant: 4K22HL113069).
Aurora A Inhibitor I | Selleck Chemicals | S1451 | |
2% Bis solution | Bio-Rad | 1610142 | |
3-aminopropyltrimethyloxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
40% acrylamide | Bio-Rad | 1610140 | |
405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module | Agilent Technologies | 99462 | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
anti–mouse IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-1688-31 | |
anti–rabbit IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-7788-31 | |
ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET455/50m | |
ET525/36m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET525/36m | |
ET605/70m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET605/70m | |
ET700/75m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET700/75m | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | RPI Products | A30075-100.0 | |
Clara cooled charge-coupled device camera | Andor Technology | 77026010 | |
Cy3 donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
Dyelight 649 goat anti-rat | Jackson ImmunoResearch | 112-496-068 | |
EGM-MV SingleQuot Supply & Growth Factors (contents shown below) | Lonza | CC-4143 | |
Fetal bovine serum 25 mL | |||
Bovine brain extract 2.0 mL | |||
Gentamycin sulfate 0.5 mL | |||
Epidermal growth factor 0.5 mL | |||
Hydrocortisone 0.5 mL | |||
Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/mL, 10,000 ug Strep/mL) 10.0 mL | |||
EGTA | Sigma-Aldrich | E3884-100G | |
Electronic shutter | Sutter instrument | 77016099 | |
Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
Glutaraldehyde | Thermo Fisher Scientific | S80026 | |
HALT Protease inhibitor | Thermo Fisher Scientific | PI-78425 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
HRP goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-036-062 | |
HRP goat anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-036-045 | |
Immuno-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad | 162-0174 | |
Lanolin | Thermo Fisher Scientific | 8006-54-0 | |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643-500G | |
Microscope | Nikon TiE | MEA53100 | |
Motorized stage | ASI Technologies | MS-2000 | |
Mounting medium | Dako | CS70330-2 | |
Mouse anti-Aurora A | Abcam | ab130156 | |
Mouse anti-GAPDH | Abcam | ab9484 | |
Mouse anti-MCAK | Abcam | ab50778 | |
Mouse anti-tubulin (DM1A) | Cell Signaling Technology | 3873S | |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
NIS Elements software | Nikon | MQS310000 | |
Nucleofector Kit V | Lonza | VACA-1003 | Contains the electroporation buffer |
Paraffin | Thermo Fisher Scientific | P31-500 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000IU Pen/mL,10,000ug Strep/mL) | MP Biomedicals | 91670249 | |
Petroleum jelly | Dow Corning | 2021854-1113 | |
Pipes | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
plusTipTracker | |||
Rabbit anti-GFP | Abcam | ab290 | |
Rabbit anti–pT288–Aurora A | Abcam | ab18318 | |
Rat anti–α-tubulin | AbD Serotec | MCA78G | |
Sodium borohydride | Thermo Fisher Scientific | 678-10 | |
Spinning disk | Andor Technology | Yokagawa CSU-X1 | |
Sulfo-SANPAH | Thermo Fisher Scientific | PI-22589 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34080 | |
Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP151-500 | |
Trypsin | Corning | MT25053CI | |
Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337 |