Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.
The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.
Angiogenese er utløst av ekstracellulære signal signaler som fremmer endotelceller (ECS) for å polarisere, migrere med retnings spesifisitet, og danne nye blodkar i vev som krever blodtilførsel. Medvirkende faktorer som antas å drive angiogenese er signaler fra den ekstracellulære matriks (ECM). Som svar på fysiske signaler, egenkapitalbevis utvide nye grener med retnings spesifisitet for å veilede retningsbevegelse i dannelsen av det vaskulære nettverket 1,2. Arkitekturen av EC morfologi og forgrening er definert ved lokalisert regulering av mikrotubuli (MT) cytoskjelettet på en måte som er koordinert til regulering av acto-myosin kontraktilitet 3. For at EC grener for å danne, må myosin-II være lokalt nedregulert, noe som resulterer i lokaliserte membranfremspring 4. På samme tid og på samme sted i cellen, blir MT vekst dynamikk endret som resulterer i langsom og vedvarende MT vekst for å fremme gren Elonsøkelsen og stabilitet fem. Dette koordineres cytoskeletal regulering tillater egenkapitalbevis for å polarisere deres morfologi å lette retnings migrasjon.
Utviklingen av en polarisert cellemorfologi krever polarisert MT montering 6. I migrere epitelceller, MTS vokser langsomt og vedvarende spesielt ved den fremre kant av cellen 7-9; mens i nevroner, initiering og forlengelse av aksoner eller dendritter krever at MT'er ikke bare er til stede, men at de er dynamisk omgår prosessene for montering og demontering 10-15. På denne måten lokalisert kontroll av MT vekstdynamikk bestemmer arkitekturen av cellen og gir mulighet for rask ombygging av celle morfologi som egenkapitalbevis navigere gjennom deres ECM.
MT vekstdynamikk er regulert av familier av molekylære motor proteiner og ikke-motoriske proteiner, kalt microtubule assosierte proteiner eller microtubule samspill proteiner (heretter RefeRøed til kart). Kart kan lokalt aktiveres eller deaktiveres, typisk gjennom signaliserer kaskader initiert ved celle-ECM grensesnitt 16,17. Når aktiv, kart funksjon ved binding til MT og endre kinetikken MT montering og demontering; dermed fungerer til lokalt regulere MT dynamikk for å fremme celle form og polaritet 18-20. Mitotisk cent Associated kinesin (MCAK) er en kinesin-13 familien MAP som binder seg til MT ender og par ATP hydrolyse til MT demontering 21-23. Dette funksjonelle rolle av MCAK er kjent for å være kritisk i den mitotiske spindel 24-28, så vel som under interfase 29,30. Innenfor interegenkapitalbevis, er MCAK-mediert MT demontering regulert av lokaliserte Aurora-A indusert fosforylering av MCAK som svar på såret-kant indusert aktivering av Rac1 liten GTPase. Resultatet av dette signalkaskade er inhiberingen av MCAK ved den fremre kant av ECS, noe som resulterer i polarisert MT vekst mot leading kant og MCAK-indusert MT demontering i bakkant av trekkende egenkapitalbevis 31.
Tradisjonelle metoder for måling av MT vekst dynamikk har typisk anvendt hånd sporing av enten fluorescent-merkede tubulin eller, mer nylig, fluorescens-merket MT Slutt-bindende protein 1 eller 3 (EB1 eller EB3, henholdsvis). Den fluorescerende tubulin tilnærmingen har den fordelen merking hele MT array. Imidlertid, fordi de fleste av mitotiske celletyper opprettholde en radial rekke MT'er i løpet av inter 8,32,33, mts nær den sentrosomen er meget tette, og som et resultat, relativ MT vekst og demontering med fluorescerende tubulin er vanligvis begrenset til den perifere områder av cellen. På grunn av disse begrensningene, har utnyttelse av fluoresceinmerkede EB proteiner (EB1 eller EB3) vært mer felles tilnærming til måling MT dynamikk. Fordi EBS bare merke den voksende pluss-endene av MTS, vises de som små (1-3 mm), sterkt fluorescerende kommerts, og dermed gi en lett merkbar markør for MT polymerisasjon med svært begrenset bakgrunnsfluorescens 34-37. Mens det faktum at EBS etiketten bare et delsett av MT matrisen representerer en stor styrke av EB tilnærming, er det også fremhever en viktig begrensning er at ikke-voksende MT'er ikke merkes av EB3 tilnærming. Likevel, evnen til å måle og spore EB3 kometer over tid og å visualisere MT vekst innen sub-cellulære regioner gjør denne tilnærmingen ideelle for applikasjoner som krever regional evaluering av MT organisasjon.
En annen viktig begrensning av tradisjonelle metoder for måling MT vekstdynamikk har vært svært store datasett og den tiden som kreves for dataanalyse. Denne begrensningen stammer fra behovet for hånd sporing av hundrevis av EB komet med høy tidsoppløsning. Dessuten, disse målingene må gjøres i et statistisk signifikant antall celler og også utføres under en rekke forskjellige kontroll- og experimental forhold. Nylig har disse begrensningene blitt overvunnet gjennom beregningsorientert analyse teknikker spesielt rettet mot sporing EB3 kometer ved hjelp av time-lapse mikroskopi i levende celler 35. Når den brukes på riktig måte, fungerer dette beregnings tilnærming til både begrense potensialet for menneskelige feil i forbindelse med hånd-sporing i tillegg til å gi for en high-throughput metode for å måle MT polymerisasjon. Computational analyse av MT dynamikk ved hjelp av Matlab-baserte programvarepakke, plusTipTracker, åpner for målinger av MT vekst ved å spore fluorescently-merket EB3 kometer 5,31,35,38. I tillegg gir plusTipTracker programvare for beregninger av MT katastrofehendelser (aka demontering) basert på forsvinningen av EB3 kometer innenfor en voksende MT spor, og gir mulighet for sub-mobilnettet (aka regional) analyse av MT vekstdynamikk innenfor brukerdefinerte områder av interesse . For våre studier, ble MT vekstdynamikk i forhold innenforforgrenede regioner versus ikke-forgrenede regioner, eller innen ledende versus følgende cellekantene. Datautgang fra plusTipTracker programvare kan også brukes til å generere fargekodede spor overlegg for de enkelte celler og sub-cellulære regioner.
Her beskriver vi metodene som er brukt for å undersøke hvilken rolle MCAK i moduler MT vekstdynamikk og bidraget fra denne MT depolymerase til regulering av EF forgrening morfologi og retnings migrasjon. Vår tilnærming benyttes en primær human cellelinje, Human Umbilical Vein endotelceller (HUVECs), som er lette å dyrke og meget mottagelig for elektroporering-indusert, transient transfeksjon av plasmid cDNA. Vi brukte høy oppløsning, time-lapse fluorescens mikroskopi av HUVECs transfektert med MT End bindende protein 3 (EB3) og Mitotisk cent Associated kinesin (MCAK) -spesifikk cDNA konstruerer for å vurdere effekter på MT dynamikk transfektert HUVECs. PlusTipTracker-baserte beregningsbildeanalyse av EB3-merket MT pluss endene var å måle MT veksthastighet og MT vekst liv i intervallbilder, for å måle og sammenligne effekten av eksperimentelle manipulasjoner på MT vekstdynamikk. Denne metodikken gir mulighet for studier av MT dynamikk og identifisering av hvordan lokalisert regulering av MT dynamikk innen sub-cellulære regioner bidrar til angiogeneprosesser i EU forgrening og migrasjon. Disse teknikkene er aktuelt for undersøkelser av alle MAP som kan fluorescensmerkede og uttrykt i levende celler.
Bruke HUVECs i morfologi og migrering eksperimenter.
Levende-cell imaging av EB3-merket MT vekstdynamikk innenfor HUVECs krever egnede og reproduserbare celledyrkningsforhold for å måle og vurdere endringer i MT vekst og HUVEC morfologi, slik at de kan da bli tildelt en ECM signale kø. HUVECs representerer en utmerket modell for å studere celleform og bevegelighet. De er svært mottagelig for transfeksjon med fluoresceinmerkede cDNA, de utviser dramatiske morfologier som reaksjon på både oppløselige og fysiske signal signaler, og de opprettholde evnen til å organisere seg i vaskulære rør når tilgjengelig egnede celledyrkningsbetingelser 65-70. Primære cellekulturer, for eksempel HUVECs, krever forsiktig håndtering og kontroll av celle passasje nummer for å sikre at cellene er friske, og at de vil oppføre seg normalt under eksperimentering. For eksempel når gjennomføre eksperimenter som undersøker cytoskeleton og / eller cellemorfologi, HUVECs bør ikke brukes til eksperimenter utover den tiende cellekultur passasje, som HUVECs begynner vanligvis å vise ikke-uniforme morfologier rundt passasje tolv til femten.
Celletetthet er også en viktig regulator av HUVEC helse og proliferasjon. HUVEC forgrening undersøkelser (se protokoll 10/1 til 10/4, ovenfor) bruke celletetthetskulturer med relativt lav for å gi cellene fysisk rom til å interagere med sin ECM og for å forlenge forgrenede fremspring. I motsetning til i såret ende migrasjonsstudier (se protokoll 10.05 til 10.08), HUVECs er kultur i en mono før såret. Som sådan, sår bryt HUVECs vise et relativt un-forgrenet morfologi, utvide ledende kantfremspring, og viser celle-celle interaksjoner med sine nærmeste naboer som de vandrer inn i såret.
Advarsler og Fordeler av Spore MT Dynamics i stue HUVECs.
Spinning disk mikroskopi er en utmerket måte åteste eksperimentelle hypoteser som krever konfokal bildeklarhet med høy tidsoppløsning. Med det passende kamera og laser-modul, er denne tilnærmingen mikros følsomme for lav emisjon fluorescens og kan hjelpe til med redusert fotobleking i forhold til andre typer av fluorescens mikroskopi. Viktigere er denne tilnærmingen også godt egnet for moderat til høy tidsoppløsning avbildning som er nødvendig for å generere omfattende målinger av MT vekst dynamikk ved hjelp av EB3 merking tilnærming, i en rekke forskjellige celletyper.
Mens EB3 metodikken for merking voksende MT pluss-endene har klare fordeler fremfor andre fremgangsmåter for fluorescerende merking MTS, har det også spesielle ulemper. For eksempel er det en del av MT tabellen som ikke aktivt vokser til enhver tid, inkludert både befolkningen i demontering MTS og befolkningen i stabile, ikke-dynamiske MTS 71-74. EB3 ville ikke merke disse to populasjoner av MTS ogderfor bidraget fra disse to populasjonene ikke ville bli inkludert i eksperimentelle dataanalyse. Alternative metoder for å evaluere hele MT utvalg har fokusert på uttrykk for fluorescens-merket tubulin, som inkorporerer i alle bestander av MTS og muliggjør identifisering av vekst, krymper, og stabil MTS. Men på grunn av den relativt høye tetthet av MT matrisen nær sentrum av cellen og ved siden av mikrotubuli organiserende senter (MTOC), merking av hele MT matrisen danner en ulempe i å utføre bildeanalyse på MT-ender som ikke er i nærheten av cellen periferien 75-77. Eksperimenter med to farger co-merking av MTS med fluorescerende tubulin og fluorescerende EB3 i levende celler har avslørt, kvalitativt, at det store flertallet av tubulin-merket MTS er også EB3-merket 78. I tillegg har det ikke vært en effektiv metode for automatisk sporing av MT'er merket med fluorescerende tubulin. Dette betyr at data som innkrevingsjon og målinger av MT dynamikk i celler som uttrykker fluorescerende tubulin krever hånd sporing av enkelt MTS, en prosess som er feilutsatt og langtekkelig. Som et resultat, har automatisert matematisk analyse av EB3-merket MTS blitt den foretrukne metode for måling av MT dynamikk som den kan anvendes på MT dynamiske forsøk på tvers av en rekke celletyper og innenfor en rekke eksperimentelle regimer 35,79.
Linking MT Vekst Dynamics til HUVEC Morfologi og migrasjon.
Fra perspektivet til en cytoskeletal etterforsker, en svært nyttig tilpasning av plusTipTracker automatisert sporing analyse er muligheten til å måle og vurdere både fullcelle og regionale endringer i MT vekstdynamikk. Kravet for en celle for å bli polarisert er en viktig forutsetning for retningscellemigrering. Som sådan, polariserte signal signaler har lenge vært kjent som nøkkelfaktorer for kjøreretningscellemigrering 30,31,51,54,56,80,81 </sup>. For eksempel, oppløselige signalmolekyler slik som VEGF indusere aktin polymerisasjon og MT vekst mot VEGF kø i endoteliale celletyper 2,82-87. I tillegg, som svar på fysiske interaksjoner med ECM (for eksempel, compliance og dimensjonalitet mechanosensing), HUVECs modulere sine MT dynamikk av lokalt regulere Maps for å fremme MT vekst innen elongating forgrenede fremspring, og dette tjener til å HUVEC migrasjon i retning av cue 5,31,88. Dermed polarisering i respons til ekstracellulære signal signaler streker behovet for eksperimentell evaluering av lokaliserte endringer i cytoskeletal dynamikk.
Samtidig levende celle avbildning av MT vekstdynamikk (ved hjelp av EB3 tilnærming) og HUVEC celle migrasjon er ekstremt vanskelig å utføre fordi MTS vokse på en tidsskala på sekunder, mens endringer i celle morfologi og retnings migrasjon forekommer på en tidsskala på timer. Likevel begge prosessene er nært Linked. Videre, kontinuerlig, hurtig avbildning av fluorescens-merket EB3 på den andre tidsskalaen fører til fotobleking av EB3-signalet. Forsøk på å løse dette problemet ved å gjennomføre korte bilde serie EB3 (1-2 min oppkjøpet serien) hvert 30. minutt har vært vellykket, men kan bare oppnås i et lite antall egenkapitalbevis som hadde optimalt uttrykk for EB3 og som ikke viser negativ effekter til gjentatte laserbelysning fem.
En alternativ tilnærming som gjør det mulig for tolkninger av hvordan MT vekstdynamikken bidra til endringer i celle morfologi og migrasjon er plusTipTracker aktuelle området (ROI) verktøyet 35 (se Protocol 6.6). Denne metodikken gir mulighet for hele cellen MT vekst sporer til å være delt inn i brukerdefinerte områder, der MT vekst spor kan da bli hentet og analysert. For eksempel, er sammenligninger av "forgrenet" versus "ikke-forgrenede" områder av cellen viste at MT'er gror mer sringe og mer vedvarende innenfor forgrenede områder sammenlignet med ikke-forgrenet celle periferi 5. I polarisert såret bryt HUVECs, sammenligninger av de ledende kant og bakkanten MT vekstdynamikk avslørte at MCAK-indusert MT demontering hemmes spesifikt i forkant, men ikke bakkanten. Regional evaluering av fremre og bakre kant MT vekst dynamikk i HUVECs som uttrykker Rac1 og / eller fosforylering mutanter av MCAK videre avslørt at Rac1-indusert aktivering av Aurora-A kinase spesifikt og lokalt inhiberer MCAK aktivitet i forkanten for å drive HUVEC polarisasjon og retnings migrasjon 31. Dermed har kombinasjonen av automatisert sporing av MT vekstdynamikk og regional evaluering av MT vekstdynamikk innenfor de forgrenede fremspring og / eller i forkant av sår-edge HUVECs mulig for oss å knytte MT vekstdynamikken til HUVEC morfologi og migrasjon.
Protokollene som beskrives er designed for å gi et generelt grei og svært repeterbare metodikk for HUVEC kultur og eksperimentell undersøkelse. Ikke desto mindre er mange av de protokollen detaljene er komplisert og tidkrevende, noe som i sin tur gir mulighet for feil eller vanskeligheter med å gjennomføre den eksperimentelle metode. Selv om det ble forsøkt å løse potensielle problemer i hele protokollen, her er gitt ytterligere, detaljert feilsøking av potensielle problemer som er mindre vanlig eller på annen måte forkortet til notater innenfor metodikk protokoller.
Relatert til belegg dekk med polyakrylamid-substrater (2,2 Protocol), et vanlig problem som oppstår er den komplekse natur av aktiverende dekkglass, kobling av polyakrylamid til glasset, aktivere polyakrylamid, og deretter kobling av ECM til polyakrylamid. En spesielt vanskelig og potensielt problematisk trinnet er å dyrke HUVECs på fibronektin / polyakrylamidgel etter eksponering av Polyacrylamide-belagt Dekk til 2 mm sulfo-SANPAH (trinn 2.2.2.6 ovenfor). Det er avgjørende for å lykkes med dyrking HUVECs på disse underlag som sulfo-SANPAH fjernes fullstendig fra det eksperimentelle systemet følgende ECM konjugasjon. Dette kan best oppnås ved å vaske med DDH 2 O og inkubering glassene i DDH 2 O på en rister over natten. Hvis celler dyrket på polyakrylamid-ECM-er ikke overleve, eller hvis levedyktighet er mindre enn forventet, økt og gjentatt vasking av sulfo-SANPAH etter konjugering til fibronektin (trinn 2.2.2.9) anbefales for potensielt eliminere dette problemet.
Relatert til protokoll 3 (cDNA-transfeksjon og HUVEC kultur på et dekkglass), en stor innflytelse på suksessen av electroporation prosedyren er håndteringen av HUVECs både under trypsinisering av cellene for å fjerne dem fra plast kolbe, og etter avslutningen av electroporation (trinn 3.3 til 3.4, ovenfor). Det er viktig å bry segfullt ut overvåke HUVECs mens i trypsin, og for ikke å overskride den tid som er nødvendig for å få cellene til "round-up" på overflaten av kolben (typisk 1-2 minutter). For mye tid i trypsin er en hovedårsak til død HUVEC, som vanligvis er ikke realisert inntil cellene blir sådd ut på fibronektin-belagte dekkglass (trinn 3.4) og deretter ikke klarer å feste til underlaget.
Av lignende betydning, trenger HUVECs (og de fleste primære celletyper) ikke så bra når suspendert i lange tider i electroporation buffer. Under større skala eksperimenter, for eksempel, der brukeren har fem eller flere forhold som krever electroporation, er det bedre å holde cellene pelleterte i enkelte rør (1 tube per transfeksjon) og å blande dem, en-til-en-gang i electroporation buffer umiddelbart før elektroporering. Denne tilnærmingen reduserer inkubasjonstid i electroporation buffer og maksimert HUVEC overlevelse. I tillegg umiddelbar redning i fullstendig dyrkningsmedier er også crerkritisk følgende electroporation. Rednings forsinkelser av ett minutt eller mer etter elektroporering kan resultere i nær komplett HUVEC død, og bør derfor unngås.
Relaterte cellemigrering assay (protokoll 9), teknikken for dyrking HUVECs ved ekstremt høy tetthet er avhengig av en kritisk modifikasjon (beskrevet i trinn 9.2) av den tradisjonelle HUVEC cellekultur metode (beskrevet i protokoll 3) som krever tørkingen av fibronektin belagte dekkglass for å muliggjøre HUVEC kultur i et meget lite område av dekkglass. Ofte, hvis dekkglasset ikke er helt tørket, eller hvis den forutgående belegning av dekkglass med fibronektin (trinn 2.1 eller 2.2) var ikke effektiv, media inneholdende celler som er plassert på dekkglass vil miste sin overflatespenning og ekspandere til kantene på dekkglass, og dermed redusere tettheten av celler på dekkglass. En metode for å feilsøke dette potensielle problemet er å aspirere media fra dekkglass og deretterplassere dekkglass (fremdeles i sin 35 mm skål) inn på baksiden av biosikkerhet skapet i 5-10 min. Denne tilpasningen kan bidra til at strømmen av luft inne i kabinettet for å hjelpe til med tørking av fatet. Hvis noen synlig væske forblir på dekkglass etter lufttørking, å suge de flytende flekker og igjen la det lufttørke i 5-10 minutter ytterligere i biosikkerhet skapet. Det er viktig å merke seg at det ikke er mulig helt å unngå dette potensielle problem, men den gjør det blir mindre av et problem med gjentatt utøvelse av protokollen. Det er også en feilsøkings anbefaling om at når du forbereder Dekk for celle migrasjon analysen (eller noen analyse, generelt), for å forberede ekstra Dekk og har ekstra HUVECs ready-to-go i tilfelle problemer underveis.
Med disse feilsøkings hensyn i tankene, er det også viktig å understreke nytten av protokollene diskutert og deres implikasjoner i fremtiden cellebiologi forskning. Gyldig til polyacrylamid fremgangsmåte er omfattende, og omfatter ikke bare todimensjonale undersøkelser av celle-ECM inngrep (beskrevet ovenfor), men også tredimensjonale undersøkelser 5. Dette programmet er avgjørende for å øke vår forståelse av hvordan HUVECs regulere cellen form og migrasjon i fysiologiske miljøer og bør gi etterforskere en grunnleggende forståelse av hvordan morfologisk endringer samordnes med cytoskeletal endringer. Mens protokollen beskrevet her er rettet mot målinger av MT vekst dynamikk, de fleste av protokollene kan og bør være tilpasset til å måle en rekke andre mikroskopisk målbare aspekter ved celle-interaksjoner ECM. Med hensyn til MT dynamikk, er det mange kart, inkludert minst 14 familier av kinesins 89, hver med en potensiell rolle i å bidra til HUVEC polaritet og rettet migrasjon, og alle kan bli undersøkt ved hjelp av protokollene som presenteres.
Framtidige undersøkelser bør enLSO være rettet mot celle ECM engasjement i normal versus syke tilstander. HUVEC-protokoller som presenteres her er anvendbare for undersøkelser av normale homeostatiske vaskulære prosesser, så vel som til sykdomstilstander, inkludert hjertesykdom, retinopati, tumorvekst og metastaser, for å nevne noen. Konjugering synlig gjennomsiktige ECM og polyakrylamid substrater av mottagelig samsvar med mikroskopiske undersøkelser vil gi rom for celle-ECM engasjement studier slik at endotelceller vaskulær angiogenese kan overvåkes med høy romlig og tidsmessig oppløsning. Disse typer eksperimentelle tilnærminger har allerede begynt å avdekke viktige forskjeller i endotelceller form, polaritet, migrasjon, og effekten av proteiner som regulerer disse prosessene 5,31,90. Videre arbeidet bør sikte på å identifisere hvordan kombinasjonen av ECM etterlevelse og dimensjonalitet mechanosensing kan tjene til lokalt kontroll proteiner som er rettet mot og regulerer cytoskeletal dynamikk.
The authors have nothing to disclose.
Spesiell takk til Dr. Clare M. Waterman for mentorer og diskusjoner, Michelle Baird og Mike Davidson for å gi mange av de fluorescerende cDNA-konstruksjoner som brukes i disse studiene, og Kathryn Applegate og Gaudenz Danuser for å utvikle plusTipTracker MT analyse programvare. Dette arbeidet ble støttet delvis av en bevilgning til KAM fra nasjonale hjerte lunge og blod Institute (NHLBI) og National Institutes of Health (NIH). (Grant: 4K22HL113069).
Aurora A Inhibitor I | Selleck Chemicals | S1451 | |
2% Bis solution | Bio-Rad | 1610142 | |
3-aminopropyltrimethyloxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
40% acrylamide | Bio-Rad | 1610140 | |
405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module | Agilent Technologies | 99462 | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
anti–mouse IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-1688-31 | |
anti–rabbit IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-7788-31 | |
ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET455/50m | |
ET525/36m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET525/36m | |
ET605/70m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET605/70m | |
ET700/75m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET700/75m | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | RPI Products | A30075-100.0 | |
Clara cooled charge-coupled device camera | Andor Technology | 77026010 | |
Cy3 donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
Dyelight 649 goat anti-rat | Jackson ImmunoResearch | 112-496-068 | |
EGM-MV SingleQuot Supply & Growth Factors (contents shown below) | Lonza | CC-4143 | |
Fetal bovine serum 25 mL | |||
Bovine brain extract 2.0 mL | |||
Gentamycin sulfate 0.5 mL | |||
Epidermal growth factor 0.5 mL | |||
Hydrocortisone 0.5 mL | |||
Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/mL, 10,000 ug Strep/mL) 10.0 mL | |||
EGTA | Sigma-Aldrich | E3884-100G | |
Electronic shutter | Sutter instrument | 77016099 | |
Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
Glutaraldehyde | Thermo Fisher Scientific | S80026 | |
HALT Protease inhibitor | Thermo Fisher Scientific | PI-78425 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
HRP goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-036-062 | |
HRP goat anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-036-045 | |
Immuno-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad | 162-0174 | |
Lanolin | Thermo Fisher Scientific | 8006-54-0 | |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643-500G | |
Microscope | Nikon TiE | MEA53100 | |
Motorized stage | ASI Technologies | MS-2000 | |
Mounting medium | Dako | CS70330-2 | |
Mouse anti-Aurora A | Abcam | ab130156 | |
Mouse anti-GAPDH | Abcam | ab9484 | |
Mouse anti-MCAK | Abcam | ab50778 | |
Mouse anti-tubulin (DM1A) | Cell Signaling Technology | 3873S | |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
NIS Elements software | Nikon | MQS310000 | |
Nucleofector Kit V | Lonza | VACA-1003 | Contains the electroporation buffer |
Paraffin | Thermo Fisher Scientific | P31-500 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000IU Pen/mL,10,000ug Strep/mL) | MP Biomedicals | 91670249 | |
Petroleum jelly | Dow Corning | 2021854-1113 | |
Pipes | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
plusTipTracker | |||
Rabbit anti-GFP | Abcam | ab290 | |
Rabbit anti–pT288–Aurora A | Abcam | ab18318 | |
Rat anti–α-tubulin | AbD Serotec | MCA78G | |
Sodium borohydride | Thermo Fisher Scientific | 678-10 | |
Spinning disk | Andor Technology | Yokagawa CSU-X1 | |
Sulfo-SANPAH | Thermo Fisher Scientific | PI-22589 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34080 | |
Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP151-500 | |
Trypsin | Corning | MT25053CI | |
Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337 |