Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.
The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.
एंजियोजिनेसिस बाह्य सिगनल संकेत है कि endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) को बढ़ावा देने, फूट डालना दिशात्मक विशिष्टता के साथ विस्थापित हो, और ऊतकों है कि रक्त की आपूर्ति की आवश्यकता में नए वाहिका के लिए फार्म से शुरू हो रहा है। कारकों angiogenesis ड्राइव करने के लिए सोचा योगदान बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) से संकेत कर रहे हैं। शारीरिक संकेतों के जवाब में, ईसीएस दिशात्मक विशिष्टता के साथ नई शाखाओं का विस्तार संवहनी नेटवर्क 1,2 के गठन में दिशात्मक आंदोलन मार्गदर्शन करने के लिए। चुनाव आयोग आकृति विज्ञान और शाखाओं की वास्तुकला का एक तरीका है कि Acto-मायोसिन सिकुड़ना 3 के विनियमन के साथ समन्वित है में microtubule (एमटी) cytoskeleton के स्थानीय विनियमन द्वारा परिभाषित किया गया है। चुनाव आयोग की शाखाओं के रूप में करने के लिए आदेश में, मायोसिन- द्वितीय स्थानीय स्तर पर downregulated किया जाना चाहिए, स्थानीय झिल्ली उभार 4 में जिसके परिणामस्वरूप। एक ही समय में और सेल के भीतर एक ही स्थान में, मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता धीमी गति से और लगातार मीट्रिक टन विकास में जिसके परिणामस्वरूप शाखा एलोन को बढ़ावा देने के लिए संशोधित हो जाते हैंgation और स्थिरता 5। इस समन्वित cytoskeletal विनियमन ईसीएस उनकी आकृति विज्ञान का ध्रुवीकरण करने के लिए दिशात्मक प्रवास की सुविधा के लिए अनुमति देता है।
एक ध्रुवीकृत सेल आकृति विज्ञान के विकास ध्रुवीकृत मीट्रिक टन विधानसभा 6 की आवश्यकता है। उपकला कोशिकाओं पलायन में, एमटीएस सेल 7-9 के अग्रणी धार पर धीरे-धीरे और लगातार विशेष रूप से बढ़ने; न्यूरॉन्स में रहते हुए, दीक्षा और एक्सोन या डेन्ड्राइट के बढ़ाव की आवश्यकता है कि एमटीएस न केवल मौजूद हैं, लेकिन लगता है कि वे गतिशील विधानसभा और disassembly 10-15 की प्रक्रिया के दौर से गुजर रहे हैं। इस तरह, मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता के स्थानीय नियंत्रण सेल की वास्तुकला निर्धारित करता है और के रूप में ईसीएस उनकी ईसीएम के माध्यम से नेविगेट सेल आकृति विज्ञान के तेजी से remodeling के लिए अनुमति देता है।
मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता आणविक मोटर प्रोटीन और गैर-मोटर प्रोटीन के परिवारों द्वारा विनियमित रहे हैं, करार दिया microtubule जुड़े प्रोटीन या microtubule बातचीत प्रोटीन (अब refeनक्शे के रूप में करने के लिए rred)। नक्शे स्थानीय स्तर पर सक्रिय किया जा सकता या निष्क्रिय, आम तौर पर सेल ईसीएम इंटरफेस 16,17 पर शुरू cascades संकेत के माध्यम से। मीट्रिक टन करने के लिए बाध्य है और मीट्रिक टन विधानसभा और disassembly के कैनेटीक्स बदलकर एक बार सक्रिय, नक्शे समारोह; जिससे कार्य कर स्थानीय स्तर पर आदेश सेल आकार और polarity 18-20 बढ़ावा देने के लिए मीट्रिक टन गतिशीलता को विनियमित करने के लिए। Mitotic गुणसूत्रबिंदु एसोसिएटेड kinesin (MCAK) एक kinesin-13 परिवार नक्शा है कि मीट्रिक टन समाप्त होता है और जोड़ों मीट्रिक टन disassembly 21-23 एटीपी हाइड्रोलिसिस को बांधता है। MCAK की यह कार्यात्मक भूमिका mitotic धुरा 24-28 के भीतर महत्वपूर्ण है, साथ ही अंतरावस्था 29,30 के दौरान किया जाता है। अंतरावस्था ईसीएस के भीतर, MCAK की मध्यस्थता मीट्रिक टन disassembly के जवाब में MCAK के स्थानीय अरोड़ा-ए प्रेरित फोस्फोराइलेशन द्वारा विनियमित है घाव-किनारे करने के लिए Rac1 छोटे GTPase प्रेरित सक्रियण। इस संकेत झरना के परिणाम, ईसीएस के अग्रणी धार पर MCAK का निषेध है le की ओर ध्रुवीकृत मीट्रिक टन विकास में जिसके परिणामस्वरूपईसीएस 31 पलायन के अनुगामी किनारे पर बढ़त और MCAK प्रेरित मीट्रिक टन disassembly ading।
मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता को मापने के लिए पारंपरिक तरीके में आमतौर पर या तो fluorescently लेबल tubulin या, और अधिक हाल ही में, fluorescently लेबल मीट्रिक टन समाप्ति बाइंडिंग प्रोटीन 1 या 3 (EB1 या EB3, क्रमशः) के हाथ पर नज़र रखने के लिए इस्तेमाल किया है। फ्लोरोसेंट tubulin दृष्टिकोण पूरे मीट्रिक टन सरणी लेबलिंग का लाभ दिया है। हालांकि, क्योंकि mitotic प्रकार की कोशिकाओं के बहुमत अंतरावस्था 8,32,33 दौरान लाख टन की एक रेडियल सरणी बनाए रखने, केंद्रपिंड पास एमटी बहुत घने हैं, और एक परिणाम के रूप में, फ्लोरोसेंट ट्यूबिलिन साथ मीट्रिक टन विकास और disassembly ट्रैकिंग आम तौर पर परिधीय तक सीमित है सेल के क्षेत्रों के। क्योंकि इन सीमाओं के कारण, fluorescently लेबल ईबी प्रोटीन (EB1 या EB3) के उपयोग मीट्रिक टन गतिशीलता को मापने के लिए और अधिक आम दृष्टिकोण से किया गया है। क्योंकि ईबीएस केवल लाख टन की बढ़ती प्लस समाप्त होता लेबल, वे के रूप में छोटे (1-3 माइक्रोन) दिखाई देते हैं, चमकीले फ्लोरोसेंट आटीएस, इस प्रकार बहुत ही सीमित पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति 34-37 मीट्रिक टन के साथ polymerization के एक आसानी से discernable मार्कर प्रदान करते हैं। तथ्य यह है कि ईबीएस लेबल केवल मीट्रिक टन सरणी के एक सबसेट ईबी दृष्टिकोण का एक प्रमुख शक्ति का प्रतिनिधित्व करता है, यह भी एक महत्वपूर्ण सीमा पर प्रकाश डाला गया है, जबकि यह है कि गैर-बढ़ रही टन EB3 दृष्टिकोण से लेबल नहीं हैं। फिर भी, मापने के लिए और समय के साथ EB3 धूमकेतु पर नज़र रखने और उप सेलुलर क्षेत्रों के भीतर मीट्रिक टन विकास की कल्पना करने की क्षमता के अनुप्रयोगों है कि मीट्रिक टन संगठन के क्षेत्रीय मूल्यांकन की आवश्यकता के लिए इस दृष्टिकोण आदर्श बनाते हैं।
मापने मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता के लिए पारंपरिक तरीके का एक अन्य महत्वपूर्ण सीमा बहुत बड़े डेटा सेट और समय डेटा विश्लेषण के लिए आवश्यक हो गया है। यह सीमा उच्च समय संकल्प पर ईबी धूमकेतु के सैकड़ों हाथ नज़र रखने के लिए जरूरत से उपजा है। इसके अलावा, इन मापों कोशिकाओं का एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण संख्या में किया जा करने के लिए और भी नियंत्रण और experime की एक किस्म के तहत प्रदर्शन की जरूरत हैntal की स्थिति। हाल ही में, इन बाधाओं को जीवित कोशिकाओं 35 में समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग कम्प्यूटेशनल विश्लेषण तकनीक विशेष रूप से ट्रैकिंग EB3 धूमकेतु पर निर्देशित के माध्यम से दूर किया गया है। जब उचित इस्तेमाल किया, यह कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोण दोनों मीट्रिक टन polymerization को मापने का एक उच्च throughput विधि के लिए प्रदान करने के अलावा हाथ से नज़र रखने के साथ जुड़े मानव त्रुटि के लिए क्षमता को सीमित करने के लिए कार्य करता है। MATLAB आधारित सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग मीट्रिक टन गतिशीलता के कम्प्यूटेशनल विश्लेषण, plusTipTracker, fluorescently लेबल EB3 धूमकेतु 5,31,35,38 पर नज़र रखने से मीट्रिक टन विकास के मापन के लिए अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, plusTipTracker सॉफ्टवेयर मीट्रिक टन तबाही घटनाओं (उर्फ disassembly) एक से बढ़ मीट्रिक टन ट्रैक के भीतर EB3 धूमकेतु के लापता होने के आधार पर की गणना के लिए अनुमति देता है, और ब्याज के उपयोगकर्ता परिभाषित क्षेत्रों के भीतर मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता के उप सेलुलर (उर्फ क्षेत्रीय) के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है । हमारे अध्ययन के लिए, मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता के भीतर की तुलना में थेbranched क्षेत्रों बनाम गैर शाखाओं क्षेत्रों, या सेल किनारों अनुगामी बनाम प्रमुख के भीतर। plusTipTracker सॉफ्टवेयर से डेटा उत्पादन भी व्यक्ति की कोशिकाओं और उप सेलुलर क्षेत्रों के लिए कलर-कोडेड ट्रैक ओवरले उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
यहाँ हम मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता और चुनाव आयोग के विनियमन आकृति विज्ञान और दिशात्मक प्रवास शाखाओं में बंटी को यह मीट्रिक टन depolymerase का योगदान नियमन में MCAK की भूमिका की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया पद्धति का वर्णन है। हमारा दृष्टिकोण एक प्राथमिक मानव कोशिका लाइन, मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVECs) है, जो आसानी से सुसंस्कृत और अत्यधिक electroporation प्रेरित, प्लाज्मिड सीडीएनए के क्षणिक अभिकर्मक के लिए उत्तरदायी हैं प्रयोग किया जाता है। हम तो उच्च संकल्प इस्तेमाल किया, मीट्रिक टन समाप्ति के साथ ट्रांसफ़ेक्ट HUVECs बाइंडिंग प्रोटीन 3 (EB3) और mitotic गुणसूत्रबिंदु एसोसिएटेड kinesin (MCAK) विशिष्ट सीडीएनए के समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी मीट्रिक टन गतिशीलता पर प्रभाव ट्रांसफ़ेक्ट HUVECs मूल्यांकन करने के लिए निर्माण करती है। EB3 की PlusTipTracker आधारित कम्प्यूटेशनल छवि विश्लेषण-labeled मीट्रिक टन से अधिक सिरों समय चूक छवियों में मीट्रिक टन विकास की गति और मीट्रिक टन विकास जन्मों को मापने के लिए, उपाय और मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता पर प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के प्रभाव की तुलना करने के लिए किया गया था। इस पद्धति मीट्रिक टन गतिशीलता का अध्ययन और कैसे उप सेलुलर क्षेत्रों के भीतर मीट्रिक टन गतिशीलता के स्थानीय विनियमन चुनाव आयोग शाखाओं में बंटी और प्रवास की एन्जियोजेनिक प्रक्रियाओं के लिए योगदान की पहचान के लिए अनुमति देता है। इन तकनीकों में किसी भी नक्शे की जांच कि fluorescently लेबल किया जा सकता है और व्यक्त जीवित कोशिकाओं में करने के लिए लागू कर रहे हैं।
आकृति विज्ञान और प्रवासन प्रयोगों में HUVECs का उपयोग करना।
HUVECs भीतर मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता EB3 लेबल का लाइव सेल इमेजिंग आदेश मापने के लिए और मीट्रिक टन की वृद्धि और HUVEC आकृति विज्ञान में परिवर्तन, जैसे कि वे तो एक ईसीएम संकेत क्यू को सौंपा जा सकता मूल्यांकन करने के लिए उचित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सेल संस्कृति शर्तों की आवश्यकता है। HUVECs सेल आकार और गतिशीलता के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रतिनिधित्व करते हैं। वे अत्यधिक fluorescently लेबल cDNAs साथ अभिकर्मक के लिए उत्तरदायी हैं, वे दोनों घुलनशील और शारीरिक सिगनल संकेतों के जवाब में नाटकीय morphologies दिखा रहे हैं, और वे जब उचित सेल संस्कृति शर्तों 65-70 प्रदान की खुद को संवहनी ट्यूबों में व्यवस्थित करने की क्षमता बनाए रखने के लिए। ऐसे HUVECs के रूप में प्राथमिक सेल संस्कृतियों, ताकि यह सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को स्वस्थ हैं और वे प्रयोग के दौरान सामान्य रूप से व्यवहार करेंगे कि सावधानी से निपटने और सेल बीतने संख्या की निगरानी की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, जब cytoskele की जांच के प्रयोगों का आयोजनटन और / या सेल आकृति विज्ञान, HUVECs दसवें सेल संस्कृति पारित होने से परे प्रयोगों के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए के रूप में HUVECs आम तौर पर पंद्रह बीतने के बारह के आसपास गैर वर्दी morphologies प्रदर्शित करने के लिए शुरू करते हैं।
सेल घनत्व भी HUVEC स्वास्थ्य और प्रसार का एक महत्वपूर्ण नियामक है। HUVEC शाखाओं में बंटी जांच (प्रोटोकॉल 10.1-10.4, ऊपर देखें) आदेश कोशिकाओं उनके ईसीएम के साथ बातचीत करने के लिए भौतिक स्थान उपलब्ध कराने के लिए और शाखाओं उभार का विस्तार करने में अपेक्षाकृत कम घनत्व सेल संस्कृतियों का उपयोग करें। इसके विपरीत, घाव बढ़त प्रवासन अध्ययन में (प्रोटोकॉल 10.5-10.8 देखें), HUVECs लोग घायल हो गए करने से पहले एक monolayer में संस्कृति है। इस तरह, घाव बढ़त HUVECs एक अपेक्षाकृत संयुक्त राष्ट्र के branched आकृति विज्ञान प्रदर्शन के रूप में, अग्रणी धार उभार का विस्तार, और उनकी तत्काल पड़ोसियों के साथ सेल सेल बातचीत प्रदर्शनी के रूप में वे घाव में पलायन।
निरंतर और लिविंग HUVECs में ट्रैकिंग मीट्रिक टन गतिशीलता का लाभ।
डिस्क माइक्रोस्कोपी कताई के लिए एक शानदार तरीका हैप्रयोगात्मक परिकल्पना है कि उच्च समय संकल्प के साथ confocal छवि स्पष्टता की आवश्यकता होती है परीक्षा। उचित कैमरा और लेजर मॉड्यूल के साथ, इस माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण कम उत्सर्जन प्रतिदीप्ति के प्रति संवेदनशील है और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के अन्य प्रकार की तुलना में कम photobleaching में सहायता कर सकते हैं। महत्वपूर्ण बात, इस दृष्टिकोण को भी अच्छी तरह से उच्च समय संकल्प इमेजिंग के लिए उदार के लिए अनुकूल के रूप में, EB3 लेबलिंग दृष्टिकोण का उपयोग मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता के व्यापक माप पैदा विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की एक किस्म में के लिए आवश्यक है।
लेबलिंग की EB3 कार्यप्रणाली से बढ़ रही है जबकि मीट्रिक टन से अधिक सिरों fluorescently लेबलिंग लाख टन के अन्य तरीकों पर अलग फायदे हैं, यह भी अद्वितीय नुकसान है। उदाहरण के लिए, वहाँ है कि सक्रिय रूप से किसी भी समय पर नहीं बढ़ रहा है, दोनों disassembling लाख टन की आबादी और स्थिर, गैर गतिशील लाख टन 71-74 की आबादी सहित मीट्रिक टन सरणी के एक अनुपात है। EB3 लाख टन के इन दो आबादी लेबल नहीं होता औरइसलिए इन दो आबादी के योगदान की प्रयोगात्मक डेटा विश्लेषण में शामिल नहीं किया जाएगा। पूरे मीट्रिक टन सरणी के मूल्यांकन के लिए वैकल्पिक तरीकों fluorescently लेबल tubulin, एमटीएस के सभी आबादी में शामिल किया गया और बढ़ रही है, सिकुड़ने की पहचान के लिए अनुमति देता है, और स्थिर लाख टन की अभिव्यक्ति पर ध्यान केंद्रित किया है। हालांकि, microtubule का आयोजन केंद्र (MTOC) के लिए सेल के केंद्र और आसन्न पास मीट्रिक टन सरणी, पूरे मीट्रिक टन सरणी लेबलिंग के अपेक्षाकृत उच्च घनत्व की वजह से मीट्रिक टन सिरों की छवि विश्लेषण प्रदर्शन में एक नुकसान यह है कि सेल के पास नहीं हैं बनाता है परिधि 75-77। जीवित कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट ट्यूबिलिन और फ्लोरोसेंट EB3 साथ टन के दो रंग सह-लेबलिंग का उपयोग कर प्रयोगों से पता चला है, गुणात्मक, कि tubulin लेबल लाख टन के विशाल बहुमत भी EB3 लेबल 78 हैं। इसके अतिरिक्त, वहाँ फ्लोरोसेंट ट्यूबिलिन के साथ लेबल लाख टन की स्वचालित ट्रैकिंग का एक कारगर तरीका नहीं किया गया है। यह है कि डेटा संग्रह का मतलबtion और फ्लोरोसेंट ट्यूबिलिन व्यक्त कोशिकाओं में मीट्रिक टन गतिशीलता का माप अलग-अलग लाख टन के हाथ पर नज़र रखने के लिए एक प्रक्रिया है कि त्रुटि प्रवण और थकाऊ की आवश्यकता होती है। नतीजतन, EB3 लेबल लाख टन की स्वचालित कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के रूप में यह कई प्रकार की कोशिकाओं के पार और प्रयोगात्मक शासनों 35,79 की एक किस्म के भीतर मीट्रिक टन गतिशीलता प्रयोगों के लिए लागू किया जा सकता मीट्रिक टन गतिशीलता को मापने के लिए पसंदीदा पद्धति बन गया है।
HUVEC आकृति विज्ञान और प्रवासन के लिए मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता जोड़ने।
एक cytoskeletal अन्वेषक के दृष्टिकोण से, plusTipTracker स्वचालित ट्रैकिंग विश्लेषण का एक अत्यंत उपयोगी अनुकूलन मापने के लिए और मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता में दोनों पूरे सेल और क्षेत्रीय परिवर्तन का मूल्यांकन करने की क्षमता है। आवश्यकता है एक सेल ध्रुवीकृत बनने के लिए दिशात्मक सेल प्रवास के लिए एक अनिवार्य पूर्वापेक्षा है। इस तरह, ध्रुवीकरण सिगनल संकेतों लंबे दिशात्मक सेल प्रवास 30,31,51,54,56,80,81 के लिए महत्वपूर्ण कारकों ड्राइविंग के रूप में जाना जाता है के रूप में </sup>। उदाहरण के लिए, इस तरह के वीईजीएफ़ के रूप में घुलनशील संकेतन अणुओं actin polymerization और endothelial सेल प्रकार 2,82-87 में वीईजीएफ़ क्यू की ओर मीट्रिक टन विकास को प्रेरित। इसके अतिरिक्त, ईसीएम के साथ शारीरिक बातचीत (उदाहरण के लिए, अनुपालन और dimensionality mechanosensing के लिए) के जवाब में, HUVECs उनकी मीट्रिक टन गतिशीलता स्थानीय स्तर को विनियमित करने के नक्शे शाखाओं उभार elongating भीतर मीट्रिक टन विकास को बढ़ावा देने से मिलाना है, और इस की दिशा में HUVEC प्रवास मार्गदर्शन करने के लिए कार्य करता है क्यू 5,31,88। इस प्रकार, बाह्य सिगनल संकेतों के जवाब में ध्रुवीकरण cytoskeletal गतिशीलता में स्थानीय परिवर्तन की प्रायोगिक मूल्यांकन के लिए आवश्यकता पर प्रकाश डाला।
मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता (EB3 दृष्टिकोण का उपयोग) और HUVEC सेल प्रवास का एक साथ रहते सेल इमेजिंग क्योंकि लाख टन सेकंड के एक समय के पैमाने पर विकसित प्रदर्शन करने के लिए है, जबकि सेल आकृति विज्ञान और दिशात्मक प्रवास में परिवर्तन घंटे के समय के पैमाने पर होते हैं बेहद मुश्किल है। फिर भी दोनों प्रक्रियाओं परिचित Linke हैंघ। इसके अलावा, लगातार दूसरी बार पैमाने पर fluorescently लेबल EB3 के तेजी से इमेजिंग EB3 संकेत के photobleaching की ओर जाता है। EB3 (1-2 मिनट के अधिग्रहण श्रृंखला) हर 30 मिनट में सफल रहे हैं की छोटी इमेजिंग श्रृंखला का आयोजन करके इस मुद्दे पर काबू पाने के लिए प्रयास करता है, लेकिन केवल कि EB3 का इष्टतम अभिव्यक्ति थी ईसीएस की एक छोटी संख्या में पूरा किया जा सकता है और कहा कि प्रतिकूल प्रदर्शित नहीं किया था बार-बार लेजर रोशनी से 5 प्रभाव।
एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि कैसे मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता सेल आकृति विज्ञान और प्रवास में परिवर्तन करने के लिए योगदान व्याख्याओं के लिए अनुमति देता है ब्याज (आरओआई) उपकरण 35 (प्रोटोकॉल 6.6 देखें) की plusTipTracker क्षेत्र है। इस पद्धति पूरे सेल मीट्रिक टन विकास के लिए उप-विभाजित उपयोगकर्ता परिभाषित क्षेत्रों, जिसमें से मीट्रिक टन विकास पटरियों तो निकाले और विश्लेषण किया जा सकता है में होना करने के लिए पटरियों की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, बनाम सेल की "गैर शाखाओं" क्षेत्र "branched" की तुलना से पता चला है कि लाख टन बढ़ने की अधिक रोंनीच और गैर शाखाओं सेल परिधि 5 की तुलना में branched क्षेत्रों के भीतर और अधिक लगातार। ध्रुवीकृत घाव बढ़त HUVECs में अग्रणी धार और अनुगामी किनारे मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता की तुलना से पता चला है कि MCAK प्रेरित मीट्रिक टन disassembly के अग्रणी धार के भीतर विशेष रूप से हिचकते हैं, लेकिन नहीं अनुगामी किनारे। अग्रणी और HUVECs में बढ़त मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता Rac1 और / या MCAK के फोस्फोराइलेशन म्यूटेंट व्यक्त अनुगामी के क्षेत्रीय मूल्यांकन आगे से पता चला है कि अरोड़ा-ए काइनेज का Rac1 प्रेरित सक्रियण विशेष और स्थानीय स्तर पर HUVEC ध्रुवीकरण और दिशात्मक प्रवास ड्राइव करने के लिए अग्रणी धार के भीतर MCAK गतिविधि को रोकता है 31। इस प्रकार, मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता और शाखाओं उभार और / या घाव बढ़त HUVECs के अग्रणी धार के भीतर मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता के क्षेत्रीय मूल्यांकन के स्वचालित ट्रैकिंग का संयोजन हमें HUVEC आकृति विज्ञान और प्रवास के लिए मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता से जोड़ने के लिए अनुमति दी गई है।
प्रोटोकॉल वर्णित तैयार बनाया गया हैंडी HUVEC संस्कृति और प्रायोगिक जांच के लिए एक आम तौर पर सीधा और अत्यधिक repeatable कार्यप्रणाली प्रदान करने के लिए। फिर भी, प्रोटोकॉल विवरण के कई जटिल और समय लेने वाली हैं, जो, बारी में, त्रुटियों या प्रयोगात्मक कार्यप्रणाली के संचालन में कठिनाइयों के लिए अवसर प्रदान करता है। हालांकि यह प्रोटोकॉल भर में संभावित समस्याओं का समाधान करने का प्रयास किया गया था, यहाँ संभावित समस्या है कि कम आम या अन्यथा कार्यप्रणाली प्रोटोकॉल के भीतर नोटों के रूप में संक्षिप्त कर रहे हैं के अतिरिक्त, विस्तृत समस्या निवारण प्रदान की जाती है।
polyacrylamide substrates के साथ कोटिंग coverslips (प्रोटोकॉल 2.2), एक आम समस्या यह है कि उठता है, कांच coverslips को सक्रिय करने के लिए कांच polyacrylamide युग्मन, polyacrylamide को सक्रिय करने, और फिर polyacrylamide के लिए ईसीएम युग्मन के जटिल प्रकृति से संबंधित। एक विशेष रूप से कठिन है और संभावित समस्याग्रस्त कदम Polya के प्रदर्शन के बाद फ़ाइब्रोनेक्टिन / polyacrylamide जेल पर HUVECs संवर्धन कर रहा है2 मिमी sulfo-SANPAH को crylamide लेपित coverslips (कदम 2.2.2.6, ऊपर)। यह इन substrates कि पर HUVECs संवर्धन की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है Sulfo-SANPAH पूरी तरह से ईसीएम विकार निम्नलिखित प्रायोगिक प्रणाली से हटा दिया जाना। यह सबसे अच्छा DDH 2 हे के साथ धोने और रात में एक प्रकार के बरतन पर DDH 2 हे में coverslips incubating द्वारा पूरा किया जा सकता है। polyacrylamide ईसीएम पर संवर्धित कोशिकाओं जीवित नहीं है, या यदि व्यवहार्यता कम उम्मीद है, वृद्धि हुई है और फ़ाइब्रोनेक्टिन (कदम 2.2.2.9) के विकार के बाद sulfo-SANPAH की धुलाई दोहराया से सिफारिश की है संभवतः इस समस्या को कम करने के लिए।
प्रोटोकॉल 3 (सीडीएनए अभिकर्मक और एक coverslip पर HUVEC संस्कृति) से संबंधित है, electroporation प्रक्रिया की सफलता के लिए एक प्रमुख प्रभाव उन्हें प्लास्टिक की कुप्पी से दूर करने के लिए दोनों कोशिकाओं के trypsinization दौरान HUVECs की हैंडलिंग, और के समापन के बाद है electroporation (3.3-3.4 कदम, ऊपर)। यह ध्यान करने के लिए महत्वपूर्ण हैपूरी तरह से HUVECs पर नजर रखने, जबकि trypsin में, और समय कुप्पी (आमतौर पर 1-2 मिनट) की सतह पर 'राउंड अप "के लिए कोशिकाओं के लिए आवश्यक से अधिक नहीं। trypsin में अत्यधिक समय HUVEC मौत, जो आम तौर पर एहसास नहीं है जब तक कोशिकाओं fibronectin लेपित coverslips (3.4 कदम) पर चढ़ाया जाता है और फिर सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न करने के लिए असफल का एक प्रमुख कारण है।
समान महत्व की, HUVECs (और सबसे प्राथमिक प्रकार की कोशिकाओं) अच्छी तरह से जब electroporation बफर में लंबे समय के लिए निलंबित कर दिया किराया नहीं है। बड़े पैमाने पर प्रयोग के दौरान, उदाहरण के लिए, जहां उपयोगकर्ता पांच या उससे अधिक की स्थिति है कि electroporation की आवश्यकता होती है, तो यह बेहतर है एक-पर-एक-समय कोशिकाओं व्यक्ति ट्यूबों में pelleted (अभिकर्मक प्रति 1 ट्यूब) रखने के लिए और उन्हें मिश्रण करने के लिए है, , electroporation से पहले electroporation बफर तुरंत में। यह दृष्टिकोण electroporation बफर और अधिकतम HUVEC अस्तित्व में ऊष्मायन समय को कम करता है। इसके अतिरिक्त, पूरी संस्कृति मीडिया में तत्काल बचाव भी करोड़ हैitical निम्नलिखित electroporation। एक मिनट या अधिक electroporation निम्न में से बचाव देरी पूरा HUVEC मौत के पास में परिणाम कर सकते हैं और इस तरह से बचा जाना चाहिए।
संबंधित सेल प्रवास परख (प्रोटोकॉल 9), अत्यंत उच्च घनत्व पर HUVECs संवर्धन की तकनीक एक महत्वपूर्ण संशोधन पारंपरिक HUVEC सेल संस्कृति कार्यप्रणाली (प्रोटोकॉल 3 में वर्णित) के (कदम 9.2 में वर्णित) कि fibronectin लेपित coverslip के सूखने की आवश्यकता पर निर्भर करता है आदेश coverslip के एक बहुत छोटे से क्षेत्र में HUVEC संस्कृति सक्षम करने के लिए। अक्सर बार, अगर coverslip पूरी तरह से सूख नहीं है या यदि फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ coverslip की पूर्व कोटिंग (कदम 2.1 या 2.2) कुशल नहीं था, मीडिया युक्त कोशिकाओं है कि coverslip पर रखा गया है इसकी सतह तनाव कम है और करने के लिए विस्तार होगा coverslip के किनारों, जिससे coverslip पर कोशिकाओं के घनत्व को कम करने। इस संभावित समस्या के निवारण के लिए एक विधि coverslip से और फिर मीडिया aspirate करने के लिए है5-10 मिनट के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट की पीठ में coverslip (अभी भी अपने 35 मिमी डिश में) जगह है। यह अनुकूलन पकवान सुखाने में सहायता करने के लिए कैबिनेट के भीतर हवा के प्रवाह को अनुमति देने के लिए मदद कर सकते हैं। किसी भी दृश्य तरल हवा सुखाने के बाद coverslip पर रहता है, तरल स्पॉट aspirate और फिर से जैव सुरक्षा कैबिनेट में 5-10 मिनट के लिए अतिरिक्त शुष्क हवा के लिए अनुमति देते हैं। यह नोट करने के लिए कोई रास्ता पूरी तरह से इस संभावित समस्या से बचने के लिए है कि वहाँ महत्वपूर्ण है, लेकिन यह प्रोटोकॉल का बार-बार अभ्यास के साथ एक मुद्दे के कम हो जाता है। यह भी एक समस्या निवारण सिफारिश है कि जब सेल प्रवास परख (या किसी भी परख सामान्य रूप में,) के लिए coverslips की तैयारी, अतिरिक्त coverslips तैयार करने और अतिरिक्त HUVECs तैयार करने के लिए जाना जिस तरह से साथ समस्याओं के मामले में है।
मन में इन समस्या निवारण विचारों के साथ, यह भी प्रोटोकॉल पर चर्चा की और भविष्य कोशिका जीव विज्ञान अनुसंधान के क्षेत्र में अपने प्रभाव की उपयोगिता पर प्रकाश डाला करने के लिए महत्वपूर्ण है। polyacr को प्रयोज्यताylamide दृष्टिकोण व्यापक है, और न केवल सेल ईसीएम सगाई (ऊपर वर्णित) के दो आयामी अध्ययन, लेकिन यह भी तीन आयामी जांच 5 शामिल हैं। यह आवेदन कैसे HUVECs सेल आकार और प्रवास को विनियमित शारीरिक वातावरण में की हमारी समझ को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है और जांचकर्ताओं को कैसे morphological परिवर्तन cytoskeletal परिवर्तन के साथ समन्वय कर रहे हैं की एक बुनियादी समझ प्रदान करना चाहिए। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल मीट्रिक टन विकास की गतिशीलता की माप पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, प्रोटोकॉल का बहुमत और सेल ईसीएम बातचीत के अन्य microscopically measureable पहलुओं के किसी भी संख्या को मापने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए सकता है। मीट्रिक टन गतिशीलता के लिए सम्मान के साथ, वहाँ kinesins 89 से कम से कम 14 परिवारों, HUVEC polarity और निर्देशित प्रवास करने के लिए योगदान करने में एक संभावित भूमिका के साथ एक, और सभी का जो प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग जांच की जा सकता सहित, कई नक्शे हैं।
भविष्य में जांच करना चाहिए एकLSO रोगग्रस्त राज्यों की तुलना में सामान्य में सेल ईसीएम सगाई पर लक्षित किया। यहाँ प्रस्तुत HUVEC प्रोटोकॉल सामान्य संवहनी होमियोस्टैटिक प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए लागू है, साथ ही, हृदय रोग, रेटिनोपैथी, ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस सहित एक ही नाम के लिए रोग राज्यों के लिए कर रहे हैं। सूक्ष्म अध्ययन के साथ उत्तरदायी अनुपालन का दिख पारदर्शी ईसीएम और polyacrylamide substrates conjugating सेल ईसीएम सगाई की पढ़ाई के लिए अनुमति देगा कि इस तरह के endothelial सेल संवहनी angiogenesis उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ नजर रखी जा सकती है। प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के इन प्रकार के पहले से ही endothelial सेल आकार, polarity, प्रवास में महत्वपूर्ण मतभेद, और प्रोटीन है कि इन प्रक्रियाओं 5,31,90 विनियमित के प्रभाव को प्रकट करने के लिए शुरू कर दिया है। भविष्य प्रयासों कैसे ईसीएम अनुपालन और dimensionality mechanosensing के संयोजन स्थानीय स्तर पर नियंत्रण प्रोटीन है कि लक्ष्य और cytoskeletal गतिशीलता को विनियमित करने के लिए सेवा कर सकते हैं की पहचान करने का लक्ष्य रखना चाहिए।
The authors have nothing to disclose.
plusTipTracker मीट्रिक टन विश्लेषण सॉफ्टवेयर को विकसित करने के लिए सदस्यता और विचार विमर्श, मिशेल बेयर्ड और माइक डेविडसन इन अध्ययनों में प्रयुक्त फ्लोरोसेंट सीडीएनए निर्माणों के कई प्रदान करने के लिए के लिए डॉ क्लेयर एम डांडी, और कैथरीन Applegate और Gaudenz Danuser लिए विशेष धन्यवाद। इस काम के हिस्से में समर्थन किया था, से KAM करने के लिए एक अनुदान द्वारा राष्ट्रीय हृदय फेफड़े और रक्त संस्थान (NHLBI) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच)। (अनुदान: 4K22HL113069)।
Aurora A Inhibitor I | Selleck Chemicals | S1451 | |
2% Bis solution | Bio-Rad | 1610142 | |
3-aminopropyltrimethyloxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
40% acrylamide | Bio-Rad | 1610140 | |
405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module | Agilent Technologies | 99462 | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
anti–mouse IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-1688-31 | |
anti–rabbit IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-7788-31 | |
ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET455/50m | |
ET525/36m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET525/36m | |
ET605/70m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET605/70m | |
ET700/75m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET700/75m | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | RPI Products | A30075-100.0 | |
Clara cooled charge-coupled device camera | Andor Technology | 77026010 | |
Cy3 donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
Dyelight 649 goat anti-rat | Jackson ImmunoResearch | 112-496-068 | |
EGM-MV SingleQuot Supply & Growth Factors (contents shown below) | Lonza | CC-4143 | |
Fetal bovine serum 25 mL | |||
Bovine brain extract 2.0 mL | |||
Gentamycin sulfate 0.5 mL | |||
Epidermal growth factor 0.5 mL | |||
Hydrocortisone 0.5 mL | |||
Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/mL, 10,000 ug Strep/mL) 10.0 mL | |||
EGTA | Sigma-Aldrich | E3884-100G | |
Electronic shutter | Sutter instrument | 77016099 | |
Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
Glutaraldehyde | Thermo Fisher Scientific | S80026 | |
HALT Protease inhibitor | Thermo Fisher Scientific | PI-78425 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
HRP goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-036-062 | |
HRP goat anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-036-045 | |
Immuno-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad | 162-0174 | |
Lanolin | Thermo Fisher Scientific | 8006-54-0 | |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643-500G | |
Microscope | Nikon TiE | MEA53100 | |
Motorized stage | ASI Technologies | MS-2000 | |
Mounting medium | Dako | CS70330-2 | |
Mouse anti-Aurora A | Abcam | ab130156 | |
Mouse anti-GAPDH | Abcam | ab9484 | |
Mouse anti-MCAK | Abcam | ab50778 | |
Mouse anti-tubulin (DM1A) | Cell Signaling Technology | 3873S | |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
NIS Elements software | Nikon | MQS310000 | |
Nucleofector Kit V | Lonza | VACA-1003 | Contains the electroporation buffer |
Paraffin | Thermo Fisher Scientific | P31-500 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000IU Pen/mL,10,000ug Strep/mL) | MP Biomedicals | 91670249 | |
Petroleum jelly | Dow Corning | 2021854-1113 | |
Pipes | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
plusTipTracker | |||
Rabbit anti-GFP | Abcam | ab290 | |
Rabbit anti–pT288–Aurora A | Abcam | ab18318 | |
Rat anti–α-tubulin | AbD Serotec | MCA78G | |
Sodium borohydride | Thermo Fisher Scientific | 678-10 | |
Spinning disk | Andor Technology | Yokagawa CSU-X1 | |
Sulfo-SANPAH | Thermo Fisher Scientific | PI-22589 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34080 | |
Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP151-500 | |
Trypsin | Corning | MT25053CI | |
Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337 |