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Medicina

L'esaurimento delle cellule di topo da xenotrapianti tumorali umani migliora in modo significativo Analisi A valle delle cellule bersaglio

Published: July 29, 2016
doi:
10.3791/54259
, , , , , , , ,
1R&D Reagents,Miltenyi Biotec GmbH, 2In vivo Tumorbiology,Oncotest GmbH

Summary

Xenotrapianti tumorali umani sono vascolarizzati e infiltrate da cellule di origine mouse durante la fase di crescita in vivo. Per aggirare la distorsione causata da queste cellule contaminanti durante l'analisi a valle, abbiamo sviluppato un metodo che permette di esaurimento completo di tutte le cellule di topo con cellule di smistamento magnetico.

Abstract

L'utilizzo di modelli di linee cellulari in vitro per la ricerca del cancro è stato uno strumento utile. Tuttavia, è stato dimostrato che questi modelli non riescono a imitare affidabile tumori di pazienti in saggi differenti 1. Xenotrapianti tumorali umani rappresentano il gold standard per quanto riguarda la biologia del tumore, scoperta di nuovi farmaci, e la ricerca di metastasi 2-4. Xenotrapianti tumorali possono derivare da diversi tipi di materiale come linee cellulari tumorali, tessuto tumorale da tumori di pazienti primari 4 o tumori in serie trapiantati. Quando propagato in vivo, tessuto xenotrapiantati è infiltrata e vascolarizzato da cellule di origine del mouse. Molteplici fattori quali l'entità del tumore, l'origine del materiale xenotrapiantati, il tasso di crescita e la regione del trapianto influenzano la composizione e la quantità di cellule di topo presenti in xenotrapianti tumorali. Tuttavia, anche quando questi fattori sono mantenute costanti, il grado di contaminazione di cellule mouse è molto variabile.

contaminating cellule di topo da pregiudicare significativamente le analisi a valle di xenotrapianti tumorali umani. Come fibroblasti di topo mostrano efficacies alta placcatura e tassi di proliferazione, tendono a invadere colture di cellule tumorali umane, in particolare proliferare lentamente sottopopolazioni. Cellule del mouse deriva DNA, mRNA, e componenti proteiche possono pregiudizi analisi di espressione genica a valle, il sequenziamento di nuova generazione, così come l'analisi del proteoma 5. Per superare questi limiti, abbiamo sviluppato un metodo semplice e veloce per isolare le cellule tumorali umane intatte dal tessuto tumorale xenotrapiantati. Questa procedura si basa sulla deplezione completa delle cellule di origine murina combinando dissociazione tissutale automatizzata con dissociatore tessuti banco e cell sorting magnetico. Qui, dimostriamo che cellule bersaglio umane possono essere può essere ottenuto con purezze superiori al 96% in meno di 20 min indipendente dal tipo di tumore.

Introduction

tumori umani solidi costituiti da fisiologico multipla, così come i tipi di cellule neoplastiche. Essi formano i tessuti eterogenei con strutture biologiche complesse. I processi biologici come la formazione di tumori, la progressione e le risposte verso le terapie non sono ancora pienamente compreso. Modelli in vitro di colture cellulari rappresentano un utile strumento per studiare e comprendere la biologia del tumore. Tuttavia, essi possono solo in parte rispecchiare le strutture ei processi si trovano in tessuti tumorali. Modelli tumorali umani preclinici affidabili e stabili sono un prerequisito per lo sviluppo di farmaci antitumorali e terapie 4,6 nonché per la comprensione della biologia del tumore e l'interazione delle cellule tumorali e il loro ambiente.

Modelli tumorali xenotrapianto umane derivate da tumori primari del paziente mostrano alti rapporti con il tessuto di origine per quanto riguarda l'architettura istologica, interazioni con strutture micro-ambientale, il potenziale metastatico e le risposte ai farmaci 7 </sup>. Anche quando xenotrapianti tumorali sono derivati ​​da cellule in coltura o linee cellulari che imitano più da vicino i tumori dei pazienti, mostrando quindi una maggiore validità nella maggior parte dei test rispetto ai modelli di colture cellulari in vitro. Queste caratteristiche li il gold standard di modelli preclinici 4 fanno. Oltre alla sua applicazione nella ricerca sul cancro, lo xenotrapianto di cellule umane in topi è anche frequentemente usato nella ricerca sulle cellule staminali per determinare il potenziale di staminalità e la differenziazione di una popolazione target 8.

E 'stato dimostrato che microcircolo umano e cellule immunitarie umane sono sostituito su propagazione in vivo dei tumori umani 2,9. Fattori quali il sottotipo tumorale, il tasso di crescita, e nella regione del trapianto hanno importanti ripercussioni sul livello globale di infiltrazione nonché la composizione dei tipi di cellule del mouse trovato. Tuttavia, anche quando questi fattori sono mantenute costanti, la quantità e la composizione di cellule di topo sono molto variabili.

analisi a valle di tessuti xenotrapiantati sono spesso sfidati da cellule di origine murina. colture primarie di cellule tumorali umane di xenotrapianti sono spesso invasi dai fibroblasti. Oltre che ostacolano la generazione di linee cellulari tumorali in vitro, analisi a valle, come un test di citotossicità o farmacocinetica sono polarizzati in quanto nella correzione silico per gli effetti derivanti da contaminanti cellule di topo è impossibile in molti casi. Oltre a ciò, il solo in parte chiarito cross-talk tra fibroblasti di topo e cellule tumorali umane ha un impatto diretto sui risultati sperimentali di studi 10. Inoltre, la variazione più ampiamente imprevedibile di infiltrarsi cellule di topo aggrava analisi valle molecolare accurati. In NGS o proteoma analizza ogni segnale topo derivato misurata invece di un segnale di tumore umano diminuisce direttamente sensibilità sequenziamento. Anche le analisi di espressione microarray base sono sfidati per NUC murinoGli acidi Leic ibridazione possibilmente trasversale alle sonde umane.

Al fine di aggirare gli ostacoli di contaminazione cellule di topo nelle analisi a valle di cellule tumorali umane da modelli di xenotrapianto sono stati proposti diversi approcci. In molti studi cellule bersaglio desiderate per l'analisi a valle sono isolate utilizzando marcatori o combinazioni di marcatori espressi esclusivamente su cellule tumorali umane. Tuttavia, la mancanza di marcatori affidabili per l'identificazione positiva di cellule tumorali umane spesso rappresenta un grande ostacolo. Anche i marcatori ampiamente espresse, come EpCAM su carcinomi umani, mostrano spesso differenze tumore espressione intrinseca 11. Questo aumenta il rischio che sottopopolazioni partire esprimono, per esempio, cellule tumorali sottoposti epiteliali-to-mesenchymal transizione, vengono persi durante l'isolamento. Inoltre, il legame diretto di un agente di selezione alla cellula bersaglio potrebbe influenzare i successivi risultati dell'analisi. I tentativi di esaurire le cellule di topo dautilizzando una combinazione di anticorpi specifici per CD45 murino e MHC di classe I epitopi sono stati fatti anche 12. Tuttavia, questa combinazione marcatore rileva solo un sottogruppo di cellule di topo. Un altro approccio è quello di migliorare i processi di analisi da un software. Tuttavia, tutti questi approcci non sono né adatto a qualsiasi tipo di configurazione sperimentale o per qualsiasi entità tumore e metodo di trapianto.

In questo studio presentiamo un romanzo e metodo veloce per completo deplezione delle cellule di topo dai tessuti xenotrapiantati indipendenti del ceppo di topi e tessuto di origine. In proiezioni su più organi bersaglio e tessuti per i trapianti di xenotrapianti (tra cui pelle, polmoni, cervello, reni e muscolo scheletrico) siamo stati in grado di identificare una combinazione di anticorpi che consentono di rilevare completo cellule di topo. Questi anticorpi sono stati accoppiati alle particelle superparamagnetiche, titolati e ottimizzati per l'esaurimento utilizzando magnetica ordinamento delle cellule. Poiché solo specifica il mouseGli anticorpi sono utilizzati, cellule bersaglio umane rimanere "intatta" e il metodo non si limita al tessuto tumorale allo-trapiantate. Abbiamo dimostrato che le cellule di topo completo rimozione da campioni tumorali xenotrapiantati standardizza e facilita colture di cellule tumorali umane. Inoltre, dimostriamo che l'analisi di xenotrapianti tumorali umani entro la prossima generazione di sequenziamento è notevolmente migliorata. Come è stato osservato questo effetto anche se una selezione specifica sequenza umana è stata condotta durante arricchimento exome, l'influenza sul genoma e sequenziamento dell'intero trascrittoma dovrebbero essere ancora più importante. Presi insieme, rimozione di cellule di topo usando questo nuovo metodo facilita coltivazione di cellule tumorali umane e migliora significativamente le analisi a valle di xenotrapianti di tumori umani.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida etiche e legali locali del Regierungspräsidium Freiburg Referat 35. 1. Preparazione dei reagenti NOTA: Prima di iniziare l'esperimento, preparare i seguenti reagenti dal kit di dissociazione: Per preparare enzima H sciogliere ciascun flacone di polvere liofilizzata in 3 ml di RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) o mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM). Al fine di evitare ripetuti di congelamento e scongelamento preparare aliquote adatti (ad esempio, 200 mL) e conservarli a – 20 ° C per un massimo di 6 mesi. Per preparare enzima R sciogliere il flacone di polvere liofilizzata in 2,7 ml di RPMI o DMEM media. Al fine di evitare ripetuti di congelamento e scongelamento preparare aliquote adatti (ad esempio, 100 mL) e conservarli a – 20 ° C per un massimo di 6 mesi. Per preparare enzima A sciogliere il vial della polvere liofilizzata in 1 ml di tampone A fornito con il kit senza vortex. Al fine di evitare ripetuti di congelamento e scongelamento preparare aliquote adatte e memorizzarli al (es 25 microlitri.) – 20 ° C per 6 mesi. Assicurarsi di mescolare bene questa sospensione immediatamente prima di ritirare il volume di reazione desiderata. Preparare 250 ml di tampone (1x PBS con 0,5% BSA) per la procedura di separazione delle cellule e colorazione degli anticorpi. NOTA: Quando le cellule di coltura dopo la rimozione di cellule di topo filtrare tutti i tamponi e le soluzioni enzimatiche attraverso un filtro di 0,22 micron. 2. Tumore Dissociazione protocollo NOTA: In questo studio xenotrapianti derivati ​​da pazienti di tumore non a piccole cellule del polmone (NSCLC), sono stati utilizzati il ​​cancro renale e della vescica. I tumori sono stati generati mediante l'impianto di xenotrapianti di cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC) carcinoma renale e della vescica in 4 – 6 settimane di vita femminile NMRI nu / nu topi come descritto in precedenza 13 </sup>. NOTA: Poiché questo protocollo è completamente indipendente dal tipo di tumore, può essere utilizzato per qualsiasi tipo di paziente o tumore derivato dalla linea di cellule così come altri tipi di tessuto allo-trapiantate umana senza modifica del protocollo. Preparare 5 ml di miscela di digestione per campione di tessuto (fino a 1 g) appena aggiungendo 4,7 ml di RPMI 1640 o DMEM, 200 ml di enzima H, 100 ml di enzima R, e 25 ml di enzima A in un tubo di dissociazione cellulare ( C Tube). Assicurarsi di mescolare accuratamente sospensione enzima R prima di ritirare il volume richiesto. Sacrificare gli animali da dislocazione cervicale sotto anestesia. Disinfettare mouse irrorazione con piccola quantità di 80% v / v di etanolo. Harvest tumore sottocutaneo dal fianco del mouse con pinze e forbici in una cappa di coltura di tessuti. Tagliare la pelle aperta al posto del tumore con le forbici e poi separare il tumore dal tessuto sano adiacente con pinze e forbici. NOTA: A seconda dello scopo dell'esperimento eseguire questa e seguenti operazioni in condizioni asettiche. In questo studio sono stati effettuati tutti i passi in una cappa di coltura cellulare in condizioni asettiche per poter coltivare le cellule. Preparare il campione tumorale per digestioni, eliminando il grasso (come questo renderà il galleggiante campione) e aree necrotiche (come questo si tradurrà in una diminuzione vitalità) tagliando via con pinze e un bisturi. Tritare il tessuto in pezzi di 2 – 4 millimetri, utilizzando bisturi e pinze. Trasferire i pezzi di tessuto nella provetta C contenente il mix di digestione. Chiudere la provetta C e assicurarsi che sia ben chiuso. Attaccare a testa in giù sul manicotto del dissociatore tessuti da banco e fare in modo che i pezzi di tessuto si trovano nella zona del rotore / statore. Scegliere la modalità "h_tumor_01" premendo il tasto "su" o il tasto "giù" finché la modalità appare sul display e poi premendo il pulsante "start". Se tucantare la funzione di riscaldamento del dissociatore tessuti da banco, assicurarsi di allegare anche il riscaldamento. Quindi eseguire la modalità 37C_h_TDK_1 (per i tumori molli), 37C_h_TDK_2 (per i tumori di media) o 37C_h_TDK_3 (per i tumori duri) facendo clic sul simbolo della cartella sul touchscreen fino a visualizzare la cartella "Miltenyi". Per scegliere la modalità, fare clic sulla freccia su o giù fino a che la modalità di dissociazione 37C_h_TDK_2 viene evidenziato. Le maniche del tessuto dissociatore banco sono raffigurati come posizioni sul display del dispositivo. Scegliere le posizioni campioni vengono eseguiti su da loro cliccando sul touchscreen. Premere il tasto "start" per eseguire la modalità e continuare con il passo 2.16. NOTA: A seconda del tipo di tumore di un altro programma di dissociazione potrebbe essere adatto (vedi punto 2.7.1). Osservare una finestra che mostra "Fine del programma" sullo schermo. Dopo la cessazione del programma, staccare C tubo dal dissociatore tessuti da banco. Incubare campione per 30 min a 37° C sotto rotazione continua, ad esempio, utilizzando un rotatore tubo. Dopo l'incubazione collegare C della metropolitana a testa in giù sul manicotto del dissociatore tessuti da banco. Anche assicurarsi che il campione è situato nella zona del rotore / statore. Eseguire il programma di h_tumor_02 di dissociazione (per i tumori morbide e medie) o h_tumor_01 (per i tumori duri) come descritto al punto 2.7.1. Dopo la cessazione del programma, staccare C tubo dal dissociatore tessuti da banco. Incubare campione per 30 minuti a 37 ° C sotto rotazione continua. Attaccare C tubo a testa in giù sul manicotto del dissociatore tessuti da banco dopo l'incubazione. Anche assicurarsi che il campione è situato nella zona del rotore / statore. Eseguire il programma di h_tumor_03 di dissociazione (per i tumori molli), h_tumor_02 (per i tumori di media) o h_tumor_01 (per i tumori duri) come descritto al punto 2.7. Per raccogliere il campione in corrispondenza del fondo della provetta eseguire una shofase di centrifugazione rt (a 100 xg per 10 sec). Risospendere le cellule e si applicano a un filtro cella con 70 micron dimensioni nesh collocato su un tubo da 50 ml. Lavare il filtro cella con 20 ml di RPMI 1640 o DMEM. sospensione cellulare Centrifugare a 300 xg per 7 minuti. Aspirare il surnatante completamente. Risospendere le cellule in 5 ml di tampone per il conteggio. Procedere con il mouse cellulare Depletion per separazione cellulare magnetica (sezione 3). 3. Topo cellulare Depletion da Magnetic Cell Technology di separazione NOTA: I volumi per l'etichettatura magnetica indicati di seguito sono per un massimo di 2 x 10 6 cellule tumorali o 10 7 cellule totali, comprese globuli rossi. A seconda delle dimensioni del tumore si otterrà più basso o il numero di cellule superiori. In caso di un numero inferiore di celle, utilizzare gli stessi volumi come indicato. Quando si utilizza il numero di cellule superiori, scalare tutti i volumi dei reagenti e volumi totali di conseguenza (per esempio, 4 x 10 6 cellule tumorali o 2 x 10 <sup> 7 cellule totali, usano il doppio del volume di tutti i volumi dei reagenti indicati e volumi totali). Determinare il numero di cellule di un'aliquota da sospensione di cellule in fase 2.21 utilizzando un microscopio e la camera adatta per il conteggio. NOTA: A questo punto la sospensione cellulare è costituito da una miscela eterogenea di cellule tumorali umane e cellule stromali mouse e sangue, inclusi i globuli rossi. La composizione delle cellule dipende fortemente dal tipo di tumore e la regione per il trapianto. Quando si esegue l'analisi di citometria di flusso dopo la rimozione di cellule di topo ritirare aliquote di 100 microlitri di tubi adatti per un senza macchia e due per l'analisi di citometria di flusso singolo controllo di colorazione colore. Conservarli in frigorifero a 2 – 8 ° C fino a ulteriori fasi di colorazione (sezione 4). sospensione cellulare Centrifugare a 300 xg per 10 min. Eliminare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 80 ml ​​di tampone per 2 x 10 6 cellule tumorali o 10 7cellule totali Aggiungere 20 ml di reagente etichettatura magnetica per le cellule di topo. Mescolare bene e incubare per 15 min in frigorifero (2 – 8 ° C). Durante marcatura magnetica, preparare colonne larga scala (LS colonne) per la separazione magnetica, ponendolo nel campo magnetico di un magnete adatto (vedi Tabella Materiali e attrezzature) secondo il protocollo del produttore. Lavare la colonna con 3 ml di tampone. Regolare il volume del campione di 500 microlitri utilizzando tampone fino a 2 x 10 6 cellule tumorali o fino a 10 7 cellule totali. (Fino a 1 x 10 7 cellule tumorali o fino a 5 x 10 7 cellule totali possono essere trattati su una colonna LS. Quando si lavora con più celle dividere il campione su più LS Colonne). Quando si esegue l'analisi di citometria di flusso, l'analisi molecolare o il confronto frazioni nelle culture, prelevare un'aliquota del 50 microlitri come campione non ordinato. Conservare in frigorifero a 2 – 8 ° C fino ad ulteriore trasformazione. </ Li> Applicare 500 microlitri della sospensione cellulare nella colonna precedentemente preparato. Raccogliere flusso continuo contenente cellule bersaglio senza etichetta, che rappresenta le cellule tumorali umane arricchiti. NOTA: Quando si lavora con il numero di cellule più elevate fino a 2,5 ml di sospensione cellulare che è stato preparato secondo la fase 3.5 può essere applicato a una colonna. Lavare colonna con 2 x 1 ml di tampone. Raccogliere le cellule che passano attraverso e combinare con il flusso continuo dal punto 3.6. Eseguire le operazioni di lavaggio aggiungendo aliquote tampone 1 ml appena il serbatoio colonna è vuota. NOTA: Il flusso continuo contiene cellule tumorali umane purificate. Per raccogliere anche le cellule di topo trattenuti nella colonna, rimuovere colonna dal separatore e posizionarlo su un tubo adatto. Pipettare 3 ml di tampone sulla colonna e utilizzare immediatamente lo stantuffo per irrigare le cellule di topo premendo saldamente nella colonna. Spin giù le frazioni e campioni di controllo a 300 xg per 10 min. Aspirare supernatant completamente e risospendere le cellule in tampone, terreno di coltura o congelare pellet in azoto liquido, a seconda dell'applicazione desiderata valle. 4. Analisi a valle La colorazione per l'analisi citometria a flusso NOTA: Prima di effettuare ulteriori analisi a valle, una parte di cellule ottenute dalla procedura di deplezione di cellule mouse può essere analizzato (ad esempio, valutare purezza e resa) in citometria a flusso. Per le analisi citofluorimetrica, girare almeno il 10% di frazione negativi e positivi ottenuti dalla procedura di separazione cellulare magnetica (punto 3) nonché i campioni di controllo di passo 3.2 e 3.5 a 300 xg per 10 min. Eliminare il surnatante. Risospendere il pellet di cellule dei campioni di controllo colorazione dal punto 3.2 in 90 ml di tampone. Risospendere le frazioni ottenute dalla procedura di separazione cellulare magnetica in 80 ml di tampone. Aggiungere 10 ml di topo FcR Blocking reagente a tutticampioni. Mescolare bene e incubare per 5 minuti a 2 – 8 ° C in frigorifero. Aggiungere 10 ml di anti-umana EpCAM-PE (uguale diluizione degli anticorpi di 1,10) e 25 ml di anticorpi anti-topo APC-cocktail (uguale diluizione degli anticorpi di 1: 4) per i campioni di sezione 3. Aggiungere 10 ml di anti- -human EpCAM-PE ad un campione singolo controllo del colore (uguale diluizione degli anticorpi di 1,10) e 10 ml di anti-umana EpCAM-APC all'altra (uguale diluizione degli anticorpi di 1,10). Mescolare tutti i campioni e incubare per 10 min a 2 – 8 ° C in frigorifero. NOTA: EpCAM non è adatto come marcatore tumorale di qualsiasi tipo di tumore. Per i tumori utilizzati in questo studio dell'espressione EpCAM era noto. Per lavare i campioni, aggiungere 1 ml di tampone ciascuna e far girare a 300 xg per 5 min. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare ad una concentrazione per l'analisi di citometria di flusso. Per escludere le cellule morte aggiungono ioduro di propidio (1 mg / ml). Eseguire l'analisi di citometria di flusso utilizzando un apposito fbassa citometro secondo i protocolli del produttore. La coltivazione di cellule tumorali umane NOTA: Oltre alla citometria a flusso, le cellule ottenute dalla procedura di separazione possono essere coltivate e utilizzati per ulteriori test in vitro. Risospendere la frazione filtrate dalla sezione 3 in terreno di coltura ad una concentrazione di 5 x 10 5 cellule / ml. NOTA: A seconda del tipo di tumore del rivestimento, adatto densità di semina, e le condizioni di coltivazione possono differire. Aggiungere 500 ml di sospensione cellulare nei pozzetti di una piastra 24 e rivestito con 0,1% di gelatina. Incubare le cellule in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C e 5%. NOTA: condizioni di coltura ottimali dipendono dal tipo di tumore utilizzato. Pertanto, applicare condizioni di coltura adatte al tipo di tumore utilizzato. Immunofluorescenza di cellule in coltura Preparare soluzione bloccante aggiungendo 10% FCS e 0,1%Triton X-100 a 1x PBS. terreno di coltura degli scarti. Aggiungere 500 ml di PBS 1x per pozzetto per lavare le cellule. Incubare per 2 minuti a temperatura ambiente (RT), poi scarta completamente 1x PBS. Fissare cellule aggiungendo 300 ml di soluzione al 4% PFA. Incubare a temperatura ambiente per 15 min. Eliminare la soluzione PFA. Lavare le cellule fisse 3 volte come indicato al punto 4.3.2. Eseguire permeabilizzazione e il blocco con l'aggiunta di 300 ml di blocco per pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 30 min. Scartare soluzione bloccante. Lavare le cellule come indicato al punto 4.3.2. Aggiungere 300 ml di anticorpo primario diluito in soluzione bloccante alle cellule. Anti-umano di anticorpi EpCAM è diluito 1:40, anticorpi Vimentin viene diluito 1: 200. Incubare per una notte a 2 – 8 ° C. Nota: Gli anticorpi utilizzati non sono adatti per qualsiasi tipo di tumore come EpCAM potrebbe non essere espresso sulle cellule tumorali e / o vimentina è espresso anche dalle cellule tumorali. Assicurarsi che i anticorpi utilizzati sono adatti per il mo xenotrapiantodel. Eliminare la soluzione anticorpo primario. Lavare le cellule 3 volte, come indicato al punto 4.3.2. Aggiungere 300 ml di anticorpo secondario diluito in soluzione bloccante alle cellule. Entrambi gli anticorpi anti-rabbit IgG-Alexe594 e anti-topo IgG-Alexa488 vengono diluiti 1: 400. Incubare per 1 ora al buio a temperatura ambiente. Eliminare la soluzione anticorpo secondario. Lavare le cellule 2 volte, come indicato al punto 4.3.2. Aggiungere 300 ml di soluzione DAPI (0,1 mg / ml) in ciascun pozzetto. Incubare per 10 minuti al buio a temperatura ambiente. Eliminare la soluzione DAPI. Lavare le cellule 3 volte, come indicato al punto 4.3.2. Aggiungere 500 ml di 1x PBS a ciascun pozzetto. Eseguire microscopia a fluorescenza utilizzando un microscopio adatto. Sequenziamento dell'intero exome Per l'intero sequenziamento (WES) Pellets freeze dal punto 3.9 in azoto liquido. Conservare e raccogliere campioni a -80 ° C. Dopo aver raccolto le cellule, eseguire la cattura exome e tutta la ss exomeuenzare in conformità alle istruzioni del rispettivo kit del produttore (vedi Tabella di materiali e attrezzature).

Representative Results

Diversi approcci sono stati proposti per identificare o deplezione delle cellule di topo da tumori umani xenotrapiantati, ad esempio una combinazione di anticorpi specifici di topo contro CD45 e MHC di classe I. Tuttavia, solo sottopopolazioni di cellule di topo sono stati rilevati utilizzando queste combinazioni, mentre la combinazione proposta rilevato CD45 e MHC classe i esprimendo cellule di topo e il resto delle cellule di topo trovati nei tessuti bersaglio per il trapianto (Figura 1). Utilizzando questa nuova combinazione di anticorpi per selezione cellulare magnetica, cellule tumorali umane potrebbero essere isolati indipendentemente dal tipo di tumore (Figura 2). Le cellule ottenute dalla separazione cellulare rimozione delle cellule del mouse procedura basata magnetica potrebbero coltivare, portando a colture pure di cellule tumorali umane (Figura 4). Inoltre, cellule di topo validi potrebbero essere ottenute e coltivate dalstesso campione. Oltre rimozione delle cellule di topo, anche detriti è stato rimosso sulla riduzione di cellule mouse (MCD) (Figura 3). L'esaurimento completo di cellule di topo, così come il piombo rimozione detriti per una migliore analisi a valle molecolari. Questo è stato dimostrato confrontando i risultati ottenuti da tutto il sequenziamento (WES) effettuate su pezzi tumorali di massa e campioni di cellule di topo impoverito da tre diversi modelli di xenotrapianto di tumori derivati ​​da pazienti (figure 5 – 9). I nostri dati indicano che la rimozione di cellule di topo prima di eseguire WES su campioni tumorali xenotrapianto non solo aumenta significativamente la quantità totale di operazioni di lettura (figura 5), ma anche di ridurre notevolmente il numero di serie derivata letture mappato al riferimento genoma umano (Figura 6B). Poiché queste topo erroneamente mappato si legge spesso interferisce con SNP chiamata, abbiamo osservato una forte riduzione della falsamente predettoSNP dopo MCD (figure 7-8). Infine, abbiamo dimostrato che la rimozione in silico di mouse-derivato legge con metodi bioinformatici non potrebbe sostituire completamente la procedura sperimentale, come un incarico sequenza basata inequivocabile alla specie di origine non era possibile per tutte le letture. Inoltre, il procedimento in silico potrebbe non corretto per il miglioramento della qualità e concomitante copertura lettura maggiore della a vitro campioni esauriti (Figura 9). Figura 1. Stabilire un cocktail anticorpo che riconosce tutte le cellule del mouse su più organi 14. Le proiezioni in diversi organi, tra cui pelle, polmoni, cervello, reni e muscolo scheletrico, sono stati eseguiti. Questi organi rappresentano importanti tessuti bersaglio per lo xenotrapianto. Combinazioni come quelle mou riconoscereSE CD45 e MHC di classe I epitopi sono già stati utilizzati al fine di esaurire cellule di topo dopo xenotrapianto. Tuttavia, queste combinazioni marcatori rilevati solo un sottogruppo di cellule di topo in tutti i tessuti esaminati. In proiezioni precedenti una combinazione di cinque anticorpi è stata identificata permettendo la rilevazione completa di tutte le cellule di origine murina. Questo pannello comprende globuli rossi ed è indipendente dal tessuto di origine (A, B, e dati non mostrati). Modificato da 14. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2. L'esaurimento affidabile e veloce delle cellule di topo 15. Coniugati della combinazione di anticorpi con superparamagnetico nanoparticles sono stati usati per sviluppare un protocollo ottimizzato per l'esaurimento delle cellule di topo da xenotrapianti tumorali umani da cellule magnetica ordinamento (magnetica separazione delle cellule) (A). Questo nuovo protocollo consentito per l'eliminazione del> 99% di contaminazione cellule di topo in meno di 20 minuti, indipendentemente dal tipo di tumore. Frazioni cellulari ottenute dalla procedura di separazione cellulare magnetica sono stati etichettati con l'anticorpo cocktail pan-mouse e un anticorpo specifico umano contro CD326 (EpCAM) (B). Modificato da 15. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3. Isolamento di cellule di glioblastoma umano. Mouse Kit cellulare Depletion è stato utilizzato per isolare le cellule di glioblastoma umano dal MoU per adultie cervello. Durante la dissociazione del tessuto neurale elevate quantità di detriti è comunemente generato. MCDK esaurisce in modo efficace le cellule morte e detriti come si vede dal grafico che mostra le dimensioni delle cellule contro granularità delle cellule. Con questo coniugato cocktail, è stato possibile eliminare il> 99% delle cellule di topo contaminanti e> 60% dei detriti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 4. L'esaurimento delle cellule di topo Facilita Culture a valle di cellule tumorali umane 14. Fibroblasti di topo spesso ostacolano la coltivazione di cellule tumorali umane dopo la dissociazione dei tessuti trapiantati o portano a culture eterogenee. I fibroblasti collegare e si espandono in modo più efficiente, così overgrowing bersaglio c ells. Questo perturba in saggi di coltura cellulare in vitro (ad esempio, farmaco test citotossicità), poiché correzione matematica degli effetti derivanti dalla contaminazione cellule di topo è impossibile nella maggior parte dei casi. Il negativo (B) e le frazioni positive (C) dopo l'esaurimento delle cellule del mouse sono state coltivate per tre giorni, fissate e colorate per un marcatore specifico per fibroblasti di topo (vimentina) e il marcatore tumorale specifica umano CD326 (EpCAM). Come controllo, la frazione originale contenente cellule non separati (A) è stato coltivato e macchiato pure. Anche dopo tre giorni di coltura, una popolazione quasi puro di cellule tumorali umane è stata osservata nella frazione negativa (B), mentre la frazione non ordinato (A) era quasi coperto da fibroblasti. Solo una porzione minore di cellule bersaglio è stato perso alla frazione positiva (C). Modificato da 14.ge.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 5. intero sequenziamento (WES) di campioni di tumore prima e dopo il mouse cellulare Depletion (MCD) 15. Abbiamo condotto WES su tre diversi modelli di xenotrapianto derivati ​​dal rene umano, del polmone e cancro alla vescica, al fine di valutare l'impatto di MCD su la qualità dei dati di sequenziamento di prossima generazione. DNA da tumore massa e dalle cellule tumorali isolate dopo l'esaurimento delle cellule del mouse è stato utilizzato per generare le librerie di sequenziamento dell'esoma-catturato applicando un kit di cattura exome. Per il sequenziamento su uno strumento del desktop sequencer, un kit di reagenti del desktop sequenziatore 150 cicli, è stato utilizzato per generare 75-bp abbinato-end legge. Un aumento significativo (p <0.05) nella densità di cluster (A) e un aveaumento rabbia nella conta di lettura di 33% (B) è stata osservata per i campioni impoverito di cellule di topo, che indica un miglioramento della qualità del campione. Corrispondentemente, una forte riduzione di detriti e cellule morte upon MCD può essere dimostrata anche citometria a flusso (vedere Figura 3). Modificato da 15. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 6. mouse cellulare Depletion (MCD) riduce notevolmente Numero di mouse erroneamente mappata Legge dopo intero sequenziamento (WES) 15. Come oligonucleotidi di cattura utilizzati per l'arricchimento mirato di sequenze codificanti proteine ​​sono stati progettati sulla base del genoma umano, un pre-iniziale arricchimento di frammenti di DNA di fr origine umanaom si aspettava la miscela di mouse e cellule umane. Al fine di valutare il numero di oligonucleotidi di cattura che potrebbe attraversare-ibridarsi con il mouse DNA genomico, abbiamo condotto ricerche BLAST di ogni singola sonda rapida cattura exome contro genoma del topo. I parametri di allineamento risultanti sono stati usati per determinare possibili cross-ibridazione. (.. Lunghezza allineamento, non di disallineamenti, nessuna delle lacune) A seconda delle soglie di selezione, avevamo previsto un cross-reattività del 5 – 10% delle sonde di cattura con trascrizioni del mouse (dati non riportati). Dopo adattatore clipping (v0.32 trimmomatic 16), abbiamo mappato la legge di tutti i campioni contro genoma umano e di topo (BWA v0.7.12 17) e si deriva la loro origine presunta sulla base dei rispettivi parametri di allineamento (shell di Linux, da riga di comando Perl) (A). Una media del 12% di letture derivati ​​da campioni tumorali di massa è stato attribuito a cellule di topo. Tale importo potrebbe essere ridotto a 0,3% in prima deplezione di cellule di topo (B </strong>). Come in media il 15% del mouse derivato letture mappato erroneamente al genoma umano, corrispondenti al 1,9% del totale legge nei campioni tumorali bulk e 0,04% nelle cellule tumorali isolate, una forte influenza positiva della deplezione di cellule mouse su analisi a valle ci si può aspettare. Figura 6B esemplifica l'assegnazione di lettura dettagliata di tumore alla rinfusa e isolate cellule tumorali umane derivate dalla xenotrapianto cancro alla vescica. Modificato da 15. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 7. MCD riduce notevolmente il numero di SNP falsamente attesi 15. Al fine di determinare l'impatto del mouse di letture mappato il genoma umano, abbiamo determinato il numero di predicted SNP per i campioni di xenotrapianto prima e dopo MCD. Poiché non tessuto sano era disponibile per confronto, un SNP è stato definito come la differenza tra il campione e sequenziato il genoma di riferimento (hg19). Dopo la rimozione dei duplicati legge, SNP e INDEL chiamata è stata condotta il 18 e si è limitato alle regioni mirati da parte di un kit di cattura exome. 63 ± 10% di tutto il SNP previsto per i campioni tumorali di massa non sono più stati rilevati dopo l'esaurimento delle cellule del mouse, il 18 ± 1% era specifico per le cellule tumorali umane isolate (A). Mentre il primo sono stati causati principalmente dal mouse erroneamente mappato legge quest'ultimo sembrava essere rilevato a causa di elevati conteggi di lettura e la copertura di conseguenza più elevato all'interno dei campioni di cellule tumorali umane isolate. Questo effetto è stato anche visibili indels previsti (B). Modificato da 15. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questafigura. Figura 8. MCD Migliora la previsione di High-impact SNP 15. (A) Impatto della MCD su SNP previsione all'interno di un esone codificante del gene POLA1 19 è esemplificato. Mentre il mouse erroneamente mappato si legge ha provocato un certo numero di SNP falsamente previsti nella massa xenotrapianto cancro del rene, questi SNP sono stati dispersi dopo MCD. Inoltre, MCD anche migliorato la previsione di forte impatto SNP. Ad esempio, mouse si legge mappato il genoma umano di riferimento nel campione tumorale bulk provocato la distruzione torto prevista del codone di inizio del gene GRIA3 (B). Modificato da 15. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. <p clas s = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Figura 9. In Silico L'esaurimento delle Mouse-derivato Legge non può pienamente Sostituire I n Vitro MCD 15. La si legge prevede che sia di origine del mouse sono stati rimossi dal punto di vista computazionale dei dati di sequenziamento, e SNP chiamata è stata ripetuta. Con questo approccio, il numero di SNP previsto per i campioni tumorali bulk è considerevolmente ridotto dal 63% al 8,5% del numero totale di SNP (confrontare con la figura 8). Tuttavia, questo approccio silico non può sostituire completamente in MCD vitro, soprattutto se il miglioramento della qualità del campione e il concomitante aumento conteggi lettura e la copertura sono considerati. Modificato da 15."_blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Abbiamo sviluppato un metodo semplice e veloce per isolare le cellule tumorali umane intatte dal tessuto tumorale xenotrapiantati. Questa procedura si basa sulla deplezione completa delle cellule di origine murina combinando dissociazione tissutale automatizzata e cell sorting magnetico. Oltre deplezione di tutte le cellule di topo anche la quantità di cellule morte e detriti è significativamente ridotta nella frazione di cellule bersaglio. Presi insieme, questo metodo migliora significativamente analisi valle molecolari e coltivazione di cellule tumorali umane.

In contrasto con metodi alternativi, non c'è bisogno di conoscenze di marcatori specifici delle cellule tumorali, la regolazione al variare composizioni di cellule di topo o creazione di algoritmi. Il metodo proposto è indipendente dal ceppo di topi e tipo di tumore. Pertanto, una polarizzazione attraverso l'isolamento di sottopopolazioni tumorali umani sulla base di singoli marcatori specifici che possono variare in espressione, come illustrato ad EpCAM 11, è evitareed. Inoltre, esso non è limitato al materiale tumorale, ma può essere utilizzato per qualsiasi tipo di tessuto allo-trapiantate come cellule di topo sono mirati anziché specifiche sottopopolazioni tumorali umane (dati non mostrati).

la rimozione completa delle cellule di topo è facilitata prendendo di mira epitopi superficie espressa esclusivamente su cellule di origine del mouse. A parte il consolidato metodo per la dissociazione del tumore come presentato in questo studio, ci sono molte procedure che utilizzano diversi tipi di enzimi. Conservazione di epitopi superficie cellulare è un prerequisito per questo nuovo metodo, ma anche per le analisi accurate di popolazioni di cellule tumorali umane. Pertanto, è fondamentale che dolci enzimi sono utilizzati per la digestione del tessuto tumorale. Così, deplezione delle cellule del mouse può essere utilizzato solo in combinazione con procedure di digestione enzimatica che, evidentemente, non incidono epitopi mirati durante la procedura di deplezione delle cellule del mouse. In caso di dubbio questo può essere verificata solo dal rispettivo produttore.

<pclass = "jove_content"> Questo metodo funziona anche per le cellule tumorali circolanti umani (CTC). Tuttavia, come la frequenza di cellule bersaglio sono di solito <0,1% rimozione delle cellule di topo richiede inoltre rosso lisi delle cellule del sangue e purezza di più del 50% non può essere previsto. In questo caso, deplezione delle cellule mouse può essere utilizzato come pre-arricchimento di CTC seguito da un arricchimento utilizzando marcatori positivi (dati non mostrati).

La rimozione di cellule di topo migliora significativamente la coltura di cellule tumorali umane evitando cultura overgrow di fibroblasti di topo. Inoltre, l'analisi di xenotrapianti tumorali umani da parte di sequenziamento di prossima generazione è notevolmente migliorata e standardizzato. Come è stato osservato questo effetto anche se una selezione specifica sequenza umana mirata è stata effettuata durante arricchimento exome, l'influenza sul genoma e sequenziamento dell'intero trascrittoma dovrebbero essere ancora più importante.

Inoltre, il metodo presentato facilita accurastudi molecolari te di sottopopolazioni tumorali all'interno di tumori umani allo-trapiantate. La rimozione di cellule di topo da un rispettivo campione nella prima fase e successivamente classificare cellule tumorali umane in due sottopopolazioni differenti consente confronto molecolare diretta della sottopopolazione tumorale interessare cellule tumorali umani all'ingrosso 20. genica differenziale tra i sottotipi di cellule tumorali può essere valutata più affidabile in quanto non è influenzato dalla cross-ibridazione delle molecole topo derivate.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We are grateful to Janina Kuhl, Nadine Chelius, Petra Kussmann, Lena Willnow and Dorothee Lenhard for excellent technical assistance.

Materials

Tumor Dissociatio Kit, human Miltenyi Biotec 130-095-929 contains enzymes H, R and A; see data sheet for reconstitution instructions
RPMI 1640 Biowest L0501-500
gentleMACS C-Tubes Miltenyi Biotec 130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters Miltenyi Biotec 130-096-427
MACS SmartStrainer (70 µm) Miltenyi Biotec 130-098-462
Petri dish 100 mm Various
Scalpel Various
Mouse Cell Depletion Kit Miltenyi Biotec 130-104-694
PBS Various use 1x PBS for PEB buffer
EDTA Sigma-Aldrich 3610 use final concentration of 2 mM in PEB buffer
BSA Miltenyi Biotec 130-091-376 or use 5 mg/L BSA in PEB buffer
MACS LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
PreSep filters (70 µm) Miltenyi Biotec 130-095-823
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753
CD326-FITC, human Miltenyi Biotec 130-080-301 use 1:40 for immunofluorescence staining 
anti-Vimentin antibody abcam ab92547
goat-anti-mouse IgG-Alexa488 Life Technologies A11029
goat-anti-rabbit IgG-Alexa594 Life Technologies A11012
DAPI Sigma-Aldrich D9542 dilute to a final concentration of 0.1 µg/ml in 0.1 M sodium bicarbonate 
Inside Stain Kit Miltenyi Biotec 130-090-477 InsideFix from this kit can be used for fixation step during immunofluorescence staining 
FBS Various
Triton X-100  Sigma-Aldrich 93418
FcR Blocking Reagent, mouse Miltenyi Biotec 130-092-575
Gelatin Sigma-Aldrich G2500-100g
Nextera Rapid Capture Enrichment Kit Illumina FC-140-1000
MiSeq Reagent Kit v3 Illumina MS-102-3001
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Referências

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Agorku, D. J., Tomiuk, S., Klingner, K., Wild, S., Rüberg, S., Zatrieb, L., Bosio, A., Schueler, J., Hardt, O. Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells. J. Vis. Exp. (113), e54259, doi:10.3791/54259 (2016).
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