Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen
Summary
Menschliche Tumorxenotransplantate sind vaskularisiert und durch Zellen von Maus – Ursprung während der Wachstumsphase in vivo infiltriert. Um die Vorspannung, die durch diese kontaminierenden Zellen während nachgeschalteten Analyse verursacht umgehen, entwickelten wir ein Verfahren erlaubt eine umfassende Depletion aller Mauszellen durch magnetische Zellsortierung.
Abstract
Die Verwendung von de – vitro – Zelllinie Modelle für die Krebsforschung hat ein nützliches Werkzeug gewesen. Es hat sich jedoch gezeigt , dass diese Modelle zuverlässig nicht gezeigten Patiententumoren in verschiedenen Assays 1 nachahmt. Menschliche Tumorxenografte stellen den Goldstandard in Bezug auf Tumorbiologie, Arzneimittelforschung und Metastasierung Forschung 2-4. Tumor – Xenotransplantate können aus verschiedenen Arten von Material , wie Tumorzelllinien, Tumorgewebe von Patienten primären Tumoren 4 oder seriell transplantierten Tumoren ableiten. Wenn in vivo propagiert wird xenografted Gewebe infiltriert und durch Zellen der Maus Herkunft vaskularisiert. Mehrere Faktoren wie die Tumor Einheit, beeinflussen die Entstehung von xenografted Material, Wachstumsrate und der Region der Transplantation, die Zusammensetzung und die Menge an Mauszellen in Tumorxenografte. Allerdings sind, auch wenn diese Faktoren konstant gehalten wird, ist der Grad der Mauszell Kontamination sehr variabel.
Contaminating Mauszellen beeinträchtigen signifikant Downstream-Analysen von menschlichen Tumorfremdtransplantaten. Als Maus-Fibroblasten hohe Plattierung Wirksamkeiten und Proliferationsraten zeigen, neigen sie Kulturen von menschlichen Tumorzellen zu überwuchern, besonders langsam Subpopulationen wuchernden. Maus – Zell – DNA, mRNA und Protein – Komponenten können Bias nachgelagerten Genexpressionsanalyse, der nächsten Generation Sequenzierung, sowie Proteomanalyse 5 abgeleitet. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir eine schnelle und einfache Methode zur Isolierung unberührt menschlichen Tumorzellen aus xenografted Tumorgewebe entwickelt. Dieses Verfahren basiert auf der umfassenden Depletion von Zellen von Maus-Ursprung, indem sie mit dem Gewebe benchtop Dissociator und magnetische Zellsortierung automatisierten Gewebedissoziation kombiniert. Hier zeigen wir, dass die menschliche Zielzellen werden kann, kann mit Reinheiten von mehr als 96% innerhalb von weniger als 20 min unabhängig vom Tumortyp erhalten werden.
Introduction
Feste menschlichen Tumoren bestehen aus mehreren physiologischen sowie neoplastischen Zelltypen. Sie bilden heterogene Gewebe mit komplexen biologischen Strukturen. Biologische Prozesse wie Tumorbildung, Progression und Reaktionen auf Therapien sind noch nicht vollständig verstanden. In – vitro – Zellkultur – Modellen ein nützliches Instrument darstellen , zu studieren und Tumorbiologie zu verstehen. Jedoch können sie nur teilweise in Tumorgeweben gefunden Strukturen und Prozesse widerspiegeln. Zuverlässige und stabile preclinical humanen Tumormodelle sind eine Voraussetzung für die Entwicklung von Anti-Tumor – Medikamente und Therapien 4,6 sowie für Tumorbiologie zu verstehen und die Wechselwirkung der Tumorzellen und ihrer Umgebung.
Menschliche Tumor Xenotransplantatmodellen von primären Patiententumoren abgeleitet zeigen hohe Beziehungen zum Ursprungsgewebe in Bezug auf histologischen Architektur, die Wechselwirkungen mit Mikro-Umwelt-Strukturen, metastatische Potential und Reaktionen auf Medikamente 7 </sup>. Selbst wenn Tumorxenotransplantaten werden aus kultivierten Zellen oder Zelllinien abgeleitet mehr sie eng Patiententumoren imitieren, damit höhere Gültigkeit zeigt in den meisten Assays im Vergleich zu in vitro Zellkulturmodellen. Diese Eigenschaften machen sie der Goldstandard der präklinischen Modellen 4. Neben der Anwendung in der Krebsforschung, der Xenotransplantation von menschlichen Zellen in Mäuse auch häufig in der Stammzellforschung 8 die stemness und Differenzierungspotential einer Zielpopulation zu bestimmen.
Es hat sich gezeigt , dass die menschliche microvasculature und humanen Immunzellen auf in vivo Vermehrung von menschlichen Tumoren 2,9 ersetzt ist. Faktoren wie die Tumorsubtyp, Wachstumsrate, und in der Region der Transplantation haben erhebliche Auswirkungen auf die globale Ebene der Infiltration sowie die Zusammensetzung der Maus Zelltypen gefunden. Selbst wenn jedoch diese Faktoren konstant gehalten werden, sind die Menge und Zusammensetzung der Mauszellen sehr variabel.
Downstream Analysen xenografted Geweben werden oft von Zellen murinen Ursprungs in Frage gestellt. Primärkulturen von menschlichen Tumorzellen aus Xenotransplantate werden durch Fibroblasten häufig überwuchert. Neben behindert die Bildung von Tumorzelllinien in vitro, stromabwärts Assays wie Arzneimittel Zytotoxizität Tests oder Pharmakokinetik da für Effekte in silico – Korrektur vorgespannt sind , aus dem Ursprungs kontaminierenden Mauszellen in den meisten Fällen nicht möglich ist. Darüber hinaus hat das nur teilweise aufgeklärt Übersprechen zwischen Maus – Fibroblasten und humanen Tumorzellen einen direkten Einfluss auf experimentelle Ergebnisse der Studien 10. Darüber hinaus verschärft die am weitesten unberechenbar Variation infiltrieren Mauszellen genaue molekulare Downstream-Analysen. In NGS oder Proteom analysiert jede Maus stammenden Signal anstelle eines menschlichen Tumors gemessenen Signalsequenzierungs Empfindlichkeit direkt abnimmt. Auch Microarray-basierten Expressionsanalysen werden von murinen Nuk herausgefordertleic Säuren möglicherweise Kreuz hybridisiert menschlichen Sonden.
Um die Hindernisse von kontaminierenden Mauszellen in Downstream-Analysen von humanen Tumorzellen von Xenograft-Modellen verschiedene Ansätze vorgeschlagen worden, zu umgehen. In vielen Studien Downstream-Analyse gewünschten Zielzellen für isoliert werden durch Markierungen oder Kombinationen von Markern unter Verwendung ausgedrückt ausschließlich auf menschlichen Tumorzellen. Allerdings stellt das Fehlen zuverlässiger Marker für eine positive Identifizierung von humanen Tumorzellen häufig eine große Hürde. Auch im Großen und Ganzen ausgedrückt Marker, wie EpCAM auf humanen Karzinomen, zeigen häufig Tumor intrinsische Expressionsunterschiede 11. Dies erhöht das Risiko , die niedrig exprimierenden Subpopulationen, beispielsweise Tumorzellen epithelialen-to-mesenchymale Transition erfahren, sind bei der Isolierung verloren. Darüber hinaus könnte die direkte Bindung eines Selektionsmittels an die Zielzelle die nachfolgenden Analyseergebnisse beeinflussen. Versuche von abbauenden Zellen der Maus durchverwenden , haben eine Kombination von Antikörpern , die spezifisch für murine CD45 und MHC – Klasse – I – Epitope auch 12 gemacht worden. Jedoch nur diese Markerkombination detektiert eine Teilmenge von Mauszellen. Ein weiterer Ansatz ist die Analyse von Prozessen durch Software zu verbessern. Doch alle diese Ansätze sind entweder nicht geeignet für jede Art von Versuchsaufbau oder für jede Tumorart und Transplantationsmethode.
In dieser Studie stellen wir eine neue und schnelle Methode zur Mauszellen aus xenografted Gewebe unabhängig von der Mausstamm und Ursprungsgewebe umfassend erschöpfen. In Vorführungen auf mehreren Zielorganen und Geweben zur Transplantation von Xenotransplantaten (einschließlich Haut, Lunge, Gehirn, Niere und Skelettmuskel) konnten wir eine Kombination von Antikörpern zu ermöglichen, dass Zellen umfassend Erkennung Maus zu identifizieren. Diese Antikörper wurden an superparamagnetische Partikel gekoppelt, titriert und zur Abreicherung optimiert durch magnetische Zellsortierung verwendet wird. Da nur Maus spezifischeAntikörper werden verwendet, menschliche Zielzellen bleiben "unberührt" und das Verfahren ist nicht auf xenotransplantierten Tumorgewebe beschränkt. Wir zeigen, dass umfassend Entfernen von Mauszellen aus xenografted Tumorproben standardisiert und erleichtert Kulturen von humanen Tumorzellen. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Analyse von menschlichen Tumorfremdtransplantaten durch Sequenzierung der nächsten Generation deutlich verbessert. Da dieser Effekt wurde beobachtet, wenn auch ein menschlicher sequenzspezifische Selektion während Exoms Anreicherung durchgeführt wurde, werden der Einfluss auf die gesamte Genom und ganze Transkriptom Sequenzierung erwartet noch deutlicher werden. Zusammengenommen Entfernung von Mauszellen Dieses neuartige Verfahren unter Verwendung erleichtert Kultivierung von menschlichen Tumorzellen und verbessert signifikant die Downstream-Analysen von humanen Tumor-Xenotransplantaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben eine schnelle und einfache Methode entwickelt, um unberührte menschliche Tumorzellen aus xenografted Tumorgewebe isolieren. Dieses Verfahren basiert auf der umfassenden Depletion von Zellen von Maus-Ursprung durch automatisierte Gewebedissoziation Vereinigen und magnetische Zellsortierung. Neben Erschöpfung aller Mauszellen auch die Menge an toten Zellen und Trümmer in der Zielzellfraktion deutlich reduziert. Zusammengenommen, ist dieses Verfahren wesentlich verbessert Molekular Downstream-Analysen und Kultivierung von humanen Tumorzellen.
Im Gegensatz zu alternativen Verfahren ist es nicht erforderlich, nach Wissen der Tumorzellen-spezifischen Markern, die Anpassung an Zusammensetzungen Mauszellen oder Schaffung von Algorithmen variiert. Die vorgestellte Methode ist unabhängig von der Mausstamm und Tumorart. Daher wird eine Vorspannung durch Isolierung von humanen Tumor – Subpopulationen auf der Grundlage von einzelnen menschlichen spezifischen Markern , die in der Expression kann variieren, wie für EpCAM 11 gezeigt ist avoided. Darüber hinaus ist es nicht auf Tumormaterial beschränkt, sondern kann für jede Art von xenotransplantierten Gewebe verwendet werden, wie Mauszellen anstelle von spezifischen menschlichen Tumor Subpopulationen ausgerichtet sind (Daten nicht gezeigt).
Comprehensive Entfernung von Mauszellen wird durch gezielte Oberflächen Epitope erleichtert ausschließlich auf Zellen von Maus-Ursprung exprimiert wird. Neben dem etablierten Verfahren zur Tumor Dissoziation wie in dieser Studie präsentierten, gibt es viele Verfahren unter Verwendung verschiedener Arten von Enzymen. Erhaltung der Zelloberflächen-Epitope ist eine Voraussetzung für dieses neue Verfahren, sondern auch für die genaue Analyse von humanen Tumorzellpopulationen. Daher ist es entscheidend, dass die schonende Enzyme für die Verdauung von Tumorgewebe verwendet werden. Somit kann Maus-Zell-Depletion nur in Kombination mit enzymatischen Verdau Verfahren verwendet werden, die offenbar nicht Epitope während Maus-Zell-Depletion Verfahren gezielt beeinflussen. Im Zweifelsfall kann dies nur durch den jeweiligen Hersteller überprüft werden.
<pclass = "jove_content"> Diese Methode funktioniert auch für den menschlichen zirkulierenden Tumorzellen (CTCs). Wie jedoch Frequenzen von Zielzellen sind in der Regel <0,1% Entfernung von Mauszellen erfordert zusätzlich rote Blutkörperchen Lyse und Reinheiten von mehr als 50% kann nicht erwartet werden. In diesem Fall kann der Maus-Zell-Depletion als Voranreicherung von CTCs durch eine Anreicherung unter Verwendung positiver Marker (Daten nicht gezeigt), gefolgt verwendet werden.Entfernen von Mauszellen verbessert signifikant die Kultur von menschlichen Tumorzellen durch die Kultur überwuchern von Maus-Fibroblasten zu vermeiden. Darüber hinaus ist die Analyse der menschlichen Tumorxenografte von Next-Generation-Sequenzierung deutlich verbessert und standardisiert. Da dieser Effekt beobachtet wurde, obwohl eine gezielte menschliche sequenzspezifische Auswahl wurde bei Exoms Anreicherung durchgeführt worden, der Einfluss auf die gesamte Genom und ganze Transkriptom-Sequenzierung wird erwartet, dass noch mehr im Vordergrund.
Darüber hinaus erleichtert das vorgestellte Verfahren accurate molekulare Untersuchungen von Tumor Subpopulationen innerhalb xenotransplantiert menschlichen Tumoren. Entfernen von Mauszellen aus einer entsprechenden Probe in dem ersten Schritt und anschließend Zellen menschlichen Tumor in zwei verschiedenen Subpopulationen ermöglicht den direkten Vergleich molekularer des Tumors Subpopulation von Interesse für menschlichen bulk Tumorzellen 20 zu sortieren. Differentielle Genexpression zwischen Tumorzellsubtypen kann mehr zuverlässig beurteilt, da sie nicht durch Kreuzhybridisierung von Maus-abgeleitete Moleküle beeinflusst wird.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Janina Kuhl, Nadine Chelius, Petra Kussmann, Lena Willnow and Dorothee Lenhard for excellent technical assistance.
Materials
| Tumor Dissociatio Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | contains enzymes H, R and A; see data sheet for reconstitution instructions |
| RPMI 1640 | Biowest | L0501-500 | |
| gentleMACS C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| MACS SmartStrainer (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| Petri dish 100 mm | Various | ||
| Scalpel | Various | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-694 | |
| PBS | Various | use 1x PBS for PEB buffer | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3610 | use final concentration of 2 mM in PEB buffer |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | or use 5 mg/L BSA in PEB buffer |
| MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| PreSep filters (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| CD326-FITC, human | Miltenyi Biotec | 130-080-301 | use 1:40 for immunofluorescence staining |
| anti-Vimentin antibody | abcam | ab92547 | |
| goat-anti-mouse IgG-Alexa488 | Life Technologies | A11029 | |
| goat-anti-rabbit IgG-Alexa594 | Life Technologies | A11012 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | dilute to a final concentration of 0.1 µg/ml in 0.1 M sodium bicarbonate |
| Inside Stain Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-477 | InsideFix from this kit can be used for fixation step during immunofluorescence staining |
| FBS | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93418 | |
| FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100g | |
| Nextera Rapid Capture Enrichment Kit | Illumina | FC-140-1000 | |
| MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
Referências
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