A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.
Generalist bestøvere ligesom buff-tailed humlebi, Bombus terrestris, støder både næringsstoffer og giftstoffer i blomstret nektar, de indsamler fra blomstrende planter. Kun få studier har beskrevet de smagsmæssige svarene fra bier mod toksiner i fødevarer, og disse forsøg har hovedsageligt brugt snabel forlængelse respons på fastholdte honningbier. Her er en ny adfærdsmæssige assay præsenteret til måling fodring reaktioner af frit-bevægelse, individuel arbejdstager humlebier til næringsstoffer og giftstoffer. Dette assay måler mængden af opløsning indtages af hver humlebi og identificerer, hvordan smagsstoffer i fødevarer påvirke mikrostruktur spiseadfærd.
De løsninger præsenteres i en mikrokapillær rør til individuelle humlebier, der tidligere er blevet udsultet for 2-4 timer. Adfærden er fanget på digital video. Den fine struktur af spiseadfærd analyseres ved kontinuerligt at udføre positionen af ProboLAF (munddele) fra videooptagelser bruger hændelseslogføring software. Positionen af proboscis er defineret ved tre forskellige adfærdsmæssige kategorier: (1) snabel er udvidet og i kontakt med opløsningen, er (2) snabel udvidet, men ikke i kontakt med opløsningen og (3) snabel er anbragt under hovedet. Derudover skønnes også hastigheden af snabel tilbagetrækningskraften bort fra opløsningen.
I det foreliggende assay den forbrugte mængde natriumhydroxidopløsning, antallet af fodring anfald, er varigheden af fodring anfald og hastigheden af proboscis tilbagetrækning efter den første kontakt anvendes til at evaluere phagostimulatory eller afskrækkende aktivitet af de testede forbindelser.
Denne nye smag assay vil give forskerne at måle, hvor forbindelser, der findes i nektar påvirke fodring adfærd bier og vil også være nyttigt at bestøvning biologer, toksikologer og neuroethologists studerer humlebien smag system.
Plant-bestøver interaktioner er komplekse. Bestøvere besøge blomster at få nektar og pollen som fødevarer; til gengæld bestøvere lette seksuel reproduktion i planter. Mens dette forhold er for det meste mutualistisk, blomster nektar og pollen til tider indeholder giftstoffer eller anden plante forbindelser 1-5 som kan skade bestøvere. Den økologiske begrundelse for tilstedeværelsen af sådanne forbindelser i nektar og pollen er ikke klart i alle indstillinger. Et fremragende spørgsmål på dette område er, hvordan bestøvere, såsom bier kan opdage og undgå blomster med nektar indeholder toksiner.
Humlebien arter, Bombus terrestris (Linnaeus, 1758), er en generalist bestøver der besøger blomsterne af mange plantearter, herunder dem, der producerer nektar indeholder toksiner 6. Humlebier har vist sig at undgå forbrugende opløsninger indeholdende høje koncentrationer af toksiner i en 24 hr to choice assay 7. dette assayaf fødevareforbrug beskrevet af Tiedeken et al. 7 viste, at bier kan registrere bitre forbindelser i løsninger. Men dette assay var i stand til at skelne smag fra post-ingestive processer såsom utilpashed, der også kunne påvirke spiseadfærd i denne tidsinterval 8-10.
Bier besidder gustatory sensilla på deres antenner, munddele og tarsi at detektere forbindelser 11-13. Den snabel forlængelse refleks (PER) eksperimenter involverer fastholdende enkelte bier i en sele og derefter stimulere biens antennal sensilla at producere fodring refleks 14-17. Bier kan holdes tilbage i individuelle seler og derefter stimuleret til at producere fodring refleks som et assay af deres evne til at smage forbindelserne 18,19. Andre har ændret PER analysen at undersøge følsomheden af antenner eller munddele til toksiner 9,20. Men bier udsættes for stress under udnyttelse. Dette kan påvirke, hvordande reagerer på forbindelser 21.
Her er en ny analyse beskrevet at vurdere adfærdsmæssige smag reaktion frit omsættelige humlebier til saccharose og kinin, et alkaloid, der tidligere har været rapporteret at være afskrækkende 9 og giftigt 10 til honningbier (Apis mellifera) og humlebier (Bombus terrestris) 7, 22. Selvom kinin ikke er blevet fundet i plante nektar, er denne alkaloid ofte brugt som et afskrækningsmiddel stimulus i adfærdsmæssige og fysiologiske studier i bier 7,9,12,13,22. Metoden indebærer videooptagelse humlebier 'munddele på stor opløsning under den indledende snabel kontakt med test løsninger. Specifikt fine struktur fodring respons undersøgt ved kontinuerligt at udføre opførsel over en 2 min interval. Den forbrugte mængde natriumhydroxidopløsning måles under fodringsperioden og så mængden af indtaget føde kan korreleres med mikrostrukturen affodring adfærd. Også hastigheden af proboscis tilbagetrækning måles, som en indikator for en aktiv unddragelse, og derfor pre-ingestive detektion.
Med denne hidtil ukendte adfærdsmæssige assay kinin vist at afskrække fremføring af buff-tailed humlebien. Den reducerede snabel kontakttid og fodring Bout frekvens med vand eller saccharoseopløsningen snøret med kinin tolkes her som en afvisning af at indlede yderligere fodring på ikke-ernæringsmæssige eller potentielt giftige løsninger. Når kinin føjes til en M saccharoseopløsning, humlebier ikke kun reducere mængden af løsningen, de forbruger, de også trække snabel hurtigere, og dermed reducere kontakttiden mellem munddele og opløsning, der indeholder et giftstof. Tilsammen antyder disse resultater, at kinin opfattes af smagssansen receptor celler på munddele af humlebien, som allerede tidligere er identificeret i honningbi 9. Kinin er et giftstof for insekter, der inducerer utilpashed-lignende adfærd i honningbien 10 og knockdown i malaria myg (malariamyg) 23. Denne analyse kan meget vel føre til identification af nogle afskrækkende og potentielt giftige forbindelser, der opfattes af smag receptor celler på munddele i humlebier.
Det er afgørende for mikrokapillær røret skal fyldes med en tilstrækkelig volumen af testopløsning til at vare hele testfasen. Det anbefales, at mindst omkring tre fjerdedele af mikrokapillær rør (fx 70-80 pi) er fyldt. Imidlertid bør der drages omsorg for ikke helt at fylde mikrokapillær røret for at reducere risikoen for spild under processen med scanning og fastgørelse af mikrokapillær slangen til eksperimentelle enheder. Man skal også tages, når præsentere mM saccharose dråbe 500 til humlebien, så forsøgslederen undgår utæt dråben i bedriftens røret.
Hullet 4 mm på spidsen af bedriften røret er stort nok til en voksen arbejdstager humlebien til naturligt udvide sine snabel mod testopløsning. Det er dog muligt, athumlebier kan smage løsning med deres antenner, før udvide deres proboscises. Dette kan påvirke sandsynligheden for snabel forlængelse som PER kunne fremkaldes i humlebier ved at stimulere deres antenner med en sukkeropløsning 15. Faktisk antennerne af Hymenoptera ligesom snyltehveps hveps (Trissolcus brochymenae) 24 eller honningbien 13 er udstyret med smag sensilla, der giver dem mulighed for at smage sukker og toksiner som kinin. Derfor kunne de første antennal kontakter med opløsninger, der indeholder meget afskrækkende forbindelser som kinin også reducere motivationen af en humlebi at udvide sine snabel og derfor påvirke den eksperimentelle succesrate. Selv om det ikke kan kontrolleres antennal kontakt med prøveopløsningen, i nærværende undersøgelse vi ikke fandt nogen signifikant effekt af antennal kontakt på snabel forlængelse mod testopløsning. I denne analyse umiddelbart opsætning af mikrokapillær glasset efter præ-testfasen whøne humlebier 'antenner er stadig inden for bedriften røret kan reducere muligheden for humlebier at smage testopløsningen med deres antenner.
Den væsentligste begrænsning af denne analyse opstår, når spore snabel tilbagetrækning væk fra testopløsningen efter den første snabel kontakt ved hjælp af bevægelsessporing video software. Den video-optagelser viser kun 2D bevægelse af snabel, så den givne output af målingen hastighed kan være under eller over forventet. Men med nogle ændringer, kan dette aspekt af assayet forbedres.
Dette assay kan anvendes til at observere naturlige fodring responser mod opløsninger indeholdende forskellige forbindelser herunder naturligt forekommende plante sekundære metabolitter. Observere de umiddelbare fodring reaktioner med denne analyse giver detaljerede oplysninger om, hvordan humlebier opdage disse forbindelser. Dette er en fordel i forhold til eksisterende 'go-no go' metoder som PER 18,19 </sup> Og over to-choice analyser 7, fordi denne metode giver flere adfærdsmæssige respons foranstaltninger, herunder fødeindtagelse under en diskret fodring Bout.
Måling flere parametre tillader samtidig en bedre evaluering af smagen af en forbindelse. For eksempel i vores analyse, undgå humlebier forbrug af vand eller saccharose løsning snøret med kinin. Tilbagetrækning af snabel kan skyldes en ændring i svarene fra de sukker receptor celler 12,13. Vores analyse viser, at humlebier trække snabel hurtigere efter at kontakte saccharose plus kinin løsning end vand alene; Dette kunne tyde på, at kinin påvirker et bestemt sæt af neuroner ud over at hæmme sukker sensing neuroner 9,12,13,25.
Vores analyse kan analysen af den tidsmæssige mønster af adfærdsmæssige reaktioner under fodringen. En lignende protokol, hvor forbruget og antallet af anfald måles har alklar blevet gennemført for at evaluere fodring respons Drosophila til næringsstoffer og ikke-nærende sukkere 26. Vi forudser, at bier vil udvise en mere pålidelig reaktion på fodring stimulanser i vores analyse end i andre metoder såsom PER fordi bierne er fri til at bevæge sig i den bedrift røret 21. Denne teknik vil tillade en udtømmende analyse af tærskelværdier smag for næringsstoffer og giftstoffer til at belyse de mekanismer af fodring i humlebier og potentielt andre biarter.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af Leverhulme Trust tilskud (RPG-2012-708) og en BBSRC tilskud (BB / M00709X / 1) til GAW.
Bumblebee colonies | Koppert Biological Systems | NATUPOL Beehive | |
Digital microscopic camera | Dino-lite Europe | AM4815ZT | Dino-Lite Edge |
100 μl microcapillary tube | Blaubrand IntraEND | 709144 | |
15 ml polypropylene centifuge tube | Fisher Scientific | 11849650 | |
1 ml disposable plastic luer slip syringe | BD | 300013 | |
Dell Latitude 3550 laptop | Dell | Check for compatibility with video software | |
Canon CanoScan LiDE 120 | Canon | Check for compatibility with the computer/laptop | |
Observer software version 5.0.25 | Noldus | ||
Kinovea software version 0.8.15 | Kinovea | ||
silicone tubing | 6 cm length, 1 mm inside Ø & 6 cm length, 4 mm inside Ø | ||
Male luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Parmer | TW-45518-22 | |
Female luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Palmer | TW-45508-12 | |
Steel mesh | 0.5 mm mesh size | ||
Sucrose (grade II) | Sigma-Aldrich | S5391 | |
Quinine hydrochloride dihydrate | Sigma-Aldrich | Q1125 | |
ImageJ software version 1.48 | ImageJ |