גידול זבוב הפירות<em> תסיסנית</em> בתנאי Axenic ו Gnotobiotic
Summary
שיטה לגידול תסיסנית בתנאי axenic ו gnotobiotic מוצגת. עוברי זבובים הם dechorionated ב חומצת נתרן, הועברו בסביבה נקיה מחיידקים לתזונה סטרילי, וגדלו במיכלים סגורים. ייחסתי דיאטה ועובר עם חיידקים מובילים עמותות gnotobiotic, ונוכחות חיידקים אושר על ידי ציפוי homogenates תסיסנית הגוף כולו.
Abstract
The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.
Introduction
רוב בעלי החיים קשורים באופן הדוק עם חיידקים ( "חיידקים ') מלידה ועד מות 1. השוואות של חינם-בקטריה ( 'axenic') ו מיקרואורגניזם קשור ( "קונבנציונליות") בבעלי חיים הראו להשפיע חיידקי היבטים מגוונים של בריאות בעלי חיים, כוללים חילוף חומרים, תזונה, מחלות כלי דם, כבד, נשימה, אימונולוגית, האנדוקרינית, ונוירולוגיות פונקציה 2. זבוב הפרות תסיסנית הוא מודל מפתח להבנת רבים של תהליכים אלה בנוכחות החיידקים 3,4 ו ללימוד השפעת חיידקים על 5,6 הגנריקה. אין מיני חיידקים קיימים בכל אדם ( 'ליבה'), אבל Acetobacter ו לקטובצילוס מינים מספריים להשתלט על החיידקים של שניהם המעבדה-נעמד על רגליו אחוריות ניצוד ד melanogaster. אחרים Acetobacteraceae (כולל Komagataeibacter ו Gluconobacter), Firmicutes (כגון אנטרוקוקוס ו Leuconostoc), ו Enterobacteriaceae הם או בהווה לעתים קרובות אצל פרטים תסיסנית ב שפע נמוך, או בהווה סדיר בבית גבוה שפע 7-12.
החיידקים של תסיסנית ויונקים אינו עקבי בתוך ועל פני דורות 14,19. inconstancy חיידקים יכול לגרום לרעש פנוטיפי כאשר מודדים תכונות תלויות חיידקים. לדוגמא, שומני שפעת Acetobacteraceae (טריגליצרידים) אחסון תסיסנית 15-18. אם Acetobacteraceae הוא עשיר יותר אצל זבובים של בקבוקון אחד מאשר עוד 19, זבובי isogenic יכולים לקבל פנוטיפים שונים 20. פתרון לבעיית inconstancy חיידקים בעכברים 14 כבר בפועל מאז 1960, על ידי החדרת קהילה מוגדרת של 8 מינים של חיידקים דומיננטיים כדי גורי עכבר כל דור חדש (שינה צומח Schaedler),להבטיח כי כל גור חשוף לאותה אנשי מפתח של חיידקי העכבר. פרקטיקה זו שולטת על הרכב החיידקים גם כאשר החיידקים הוא לא המטרה העיקרית של המחקר 32, וקובע תקדים כדי להבטיח נוכחות של חיידקים מפתח במגוון של תנאי הניסוי.
כדי להגדיר את ההשפעה של חיידקים על תזונה תסיסנית, כמה פרוטוקולים לגזירת קווי לטוס axenic פותחו, כולל תת-כלורי dechorionation של עוברים (או נגזרת דה נובו כל דור או מתוחזקים generationally בהעברה דיאטות סטרילי) וטיפול אנטיביוטי 13. ישנם יתרונות לגישות שונות, כגון הקלות המהירות הן של טיפול באנטיביוטיקה והעברת סדרתי, בקרת לעומת יותר של משתנים מבלבלים עם דה נובו dechorionation (למשל, צפיפות ביצה, חיידקים זיהום שיורית, מחוץ היעד תופעות אנטיביוטיקה). ללא קשר לשיטה שלהכנה, הכנסת מינים של חיידקים מסוימים, לקבל axenic עובר מתירה תרבות תסיסנית עם מוגדר ( 'gnotobiotic') קהילות. לחלופין, מחק את השימוש צומח Schaedler, קהילה זו יכולה להיות מחוסנת לביצים כמקובלות הניחו (ביצוע השלבים 6-7 בלבד) על מנת להבטיח את נוכחותם של חיידקים המשפיע על תכונה בכל בקבוקון ולהימנע מסיבוכים של inconstancy חיידקים. כאן אנו מתארים את הפרוטוקול לגיוס תסיסנית axenic ו gnotobiotic ידי דה נובו dechorionation של עוברים, ועבור המאשר את הנוכחות הציגו או זיהום מינים של חיידקים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת כאן היא אחת כמה גישות עבור העובר dechorionation 8,11,18,25,26,27, יחד עם שיטות חלופיות של גידול זבובים axenic, כולל העברת סדרתי של מבוגרים axenic 18,27 או טיפול אנטיביוטי 13,18. שיטות dechorionation אחרות כוללות שוטף אתנול ולהפחית 11,25,26 או להאריך 8 טיפול …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרטים מסוימים של פרוטוקול זה היו אופטימיזציה בסיוע ד"ר אדם דובסון, שסיפק גם הערות מועילות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן עבור ה- National Institutes of Health (FNIH) מספר מענק R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD, ו AED). FNIH מספר מענק 1F32GM099374-01 (PDN), ואת בריגהם קרנות ההפעלה יאנג אוניברסיטת (JMC, MLK, MV). עלויות פרסום נתמכו על ידי מכללת אוניברסיטת בריגהם יאנג למדעי החיים והמחלקה למדעי הצמח בטבע.
Materials
| Brewer's Yeast | MP Biomedicals, LLC. | 903312 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312 |
| Glucose | Sigma Aldrich | 158968-3KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en®ion=US |
| Agar | Fisher–Lab Scientific | fly802010 | https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177 |
| Welch's 100% Grape Juice Concentrate | Walmart or other grocery store | 9116196 | http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406 |
| Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container | Webstaurant Store | 999L5032Y | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html |
| Translucent Round Deli Container Lid | Webstaurant Store | 999YNL500 | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html |
| Stock Bottles | Genesee Scientific | 32-130 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130 |
| Droso-Plugs | Genesee Scientific | 49-101 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101 |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102 |
| Plastic Bushing | Home Depot | 100343125 | http://www.homedepot.com/p/Halex-2-1-2-in-Rigid-Insulated-Plastic-Bushing-75225/100343125 |
| Specimen Cup | MedSupply Partners | K01-207067 | http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers–Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Laboratory Product Sales | TR2003 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003 |
| Food Boxes | USA Scientific | 2316-5001 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001 |
| Lysing Matrix D Bulk | MP Biomedicals, LLC. | 116540434 | http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search |
| Filter Pipette Tips, 300μl | USA Scientific | 1120-9810 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810 |
| Petri Dishes | Laboratory Product Sales | M089303 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303 |
| Ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2701 | http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88 |
| Paintbrush | Walmart | 5133 | http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005 |
| Forceps | Fisher | 08-882 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693 |
| Household Bleach (6-8% Hypochlorite) | Walmart | 550646751 | http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295 |
| Universal Peptone | Genesee Scientific | 20-260 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260 |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500 |
| Dipotassium Phosphate | Sigma Aldrich | P3786-1KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
| Ammonium Citrate | Sigma Aldrich | 25102-500g | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
| Sodium Acetate | VWR | 97061-994 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994 |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500 |
| Manganese Sulfate | Sigma Aldrich | 10034-96-5 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
| MRS Powder | Sigma Aldrich | 69966-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en®ion=US |
| 96 Well Plate Reader | BioTek (Epoch) | NA | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_spectrophotometer.html |
| 1.7 ml Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5500 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500 |
| Filter Pipette Tips, 1000μl | USA Scientific | 1122-1830 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830 |
| 96 Well Plates | Greiner Bio-One | 655101 | https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/13243/ |
| Ceramic Beads | MP Biomedicals, LLC. | 6540-434 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434 |
| Tissue Homogenizer | MP Biomedicals, LLC. | 116004500 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500 |
| Class 1 BioSafety Cabinet | Thermo Scientific | Model 1395 | http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html |
Referências
- McFall-Ngai, M. J. Giving microbes their due–animal life in a microbially dominant world. J Exp Biol. 218, 1968-1973 (2015).
- Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their commensal intestinal microbiota. Semin Immunol. 19 (2), 59-69 (2007).
- Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
- Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol Biol. 420, 1-25 (2008).
- Lee, W. J., Brey, P. T. How microbiomes influence metazoan development: insights from history and Drosophila modeling of gut-microbe interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 571-592 (2013).
- Erkosar, B., Leulier, F. Transient adult microbiota, gut homeostasis and longevity: novel insights from the Drosophila model. FEBS Lett. 588 (22), 4250-4257 (2014).
- Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genet. 7 (9), e1002272 (2011).
- Broderick, N. A., Buchon, N., Lemaitre, B. Microbiota-induced changes in drosophila melanogaster host gene expression and gut morphology. MBio. 5 (3), 01117 (2014).
- Wong, C. N., Ng, P., Douglas, A. E. Low-diversity bacterial community in the gut of the fruitfly Drosophila melanogaster. Environ Microbiol. 13 (7), 1889-1900 (2011).
- Staubach, F., Baines, J. F., Kunzel, S., Bik, E. M., Petrov, D. A. Host species and environmental effects on bacterial communities associated with Drosophila in the laboratory and in the natural environment. PLoS One. 8 (8), e70749 (2013).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
- Ridley, E. V., Wong, A. C., Douglas, A. E. Microbe-dependent and nonspecific effects of procedures to eliminate the resident microbiota from Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 79 (10), 3209-3214 (2013).
- Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
- Chaston, J. M., Newell, P. D., Douglas, A. E. Metagenome-wide association of microbial determinants of host phenotype in Drosophila melanogaster. MBio. 5 (5), 01631-01714 (2014).
- Huang, J. H., Douglas, A. E. Consumption of dietary sugar by gut bacteria determines Drosophila lipid content. Biology Letters. , (2015).
- Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
- Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metab. 14 (3), 403-414 (2011).
- Wong, A. C., Chaston, J. M., Douglas, A. E. The inconstant gut microbiota of Drosophila species revealed by 16S rRNA gene analysis. ISME J. 7 (10), 1922-1932 (2013).
- Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 80 (2), 788-796 (2014).
- Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
- Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metab. 6 (2), 144-152 (2007).
- Wong, A. C., et al. The Host as the Driver of the Microbiota in the Gut and External Environment of Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6232-6240 (2015).
- Dobson, A. J., et al. Host genetic determinants of microbiota-dependent nutrition revealed by genome-wide analysis of Drosophila melanogaster. Nat Commun. 6, 6312 (2015).
- Bakula, M. The persistence of a microbial flora during postembryogenesis of Drosophila melanogaster. J Invertebr Pathol. 14 (3), 365-374 (1969).
- Ryu, J. H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
- Blum, J. E., Fischer, C. N., Miles, J., Handelsman, J. Frequent replenishment sustains the beneficial microbiome of Drosophila melanogaster. MBio. 4 (6), 00860 (2013).
- Bitner-Mathe, B. C., Klaczko, L. B. Plasticity of Drosophila melanogaster wing morphology: effects of sex, temperature and density. Genetica. 105 (2), 203-210 (1999).
- Edward, D. A., Chapman, T. Sex-specific effects of developmental environment on reproductive trait expression in Drosophila melanogaster. Ecol Evol. 2 (7), 1362-1370 (2012).
- Ridley, E. V., Wong, A. C., Westmiller, S., Douglas, A. E. Impact of the resident microbiota on the nutritional phenotype of Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (5), e36765 (2012).
- Newell, P. D., et al. In vivo function and comparative genomic analyses of the Drosophila gut microbiota identify candidate symbiosis factors. Front Microbiol. 5, 576 (2014).
- Dewhirst, F. E., et al. Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora. Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).
- Min, K. T., Benzer, S. Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10792-10796 (1997).
