Observeren mitotische deling en Dynamiek in een live zebravis embryo
Summary
Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.
Abstract
Mitose is essentieel voor groei en differentiatie organismal. Het proces is zeer dynamisch en vereist besteld gebeurtenissen om een goede chromatine condensatie, microtubule-kinetochoor gehechtheid, chromosoom segregatie en cytokinese bereiken in een klein tijdsbestek. Fouten in het delicate proces kan leiden tot menselijke ziekte, geboorteafwijkingen en kanker. Traditionele benaderingen onderzoek naar menselijke mitotische ziektebeelden zijn vaak afhankelijk van celkweek systemen, die de natuurlijke fysiologie en ontwikkelingsstoornissen / weefsel-specifieke context voordelig ontbreekt bij het bestuderen van ziekten bij de mens. Dit protocol overwint vele hindernissen door het verstrekken van een manier om te visualiseren, met een hoge resolutie, chromosoom dynamiek in een gewervelde systeem, de zebravis. Dit protocol zal detail een aanpak die kan worden gebruikt om dynamische beelden van delende cellen, waaronder verkrijgen: in vitro transcriptie, zebravis fokken / verzamelen, embryo inbedding en time-lapse imaging. Optimalisatie en modifnicatieorganisatie van dit protocol worden ook onderzocht. Met behulp van H2A.F / Z-EGFP (labels chromatine) en mCherry-CAAX (labels celmembraan)-mRNA geïnjecteerde embryo's, mitose in AB wild-type, auroraB hi1045 pt esco2 hi2865 mutant zebravis wordt gevisualiseerd. Hoge resolutie live-imaging in de zebravis maakt het mogelijk om meerdere mitoses observeren om statistisch kwantificeren mitotische defecten en de timing van de progressie van de mitose. Bovendien, de observatie van kwalitatieve aspecten die oneigenlijk mitotische processen (dat wil zeggen, congression gebreken, missegregation chromosomen, etc.) en oneigenlijk chromosomale uitkomsten (dwz, aneuploïdie, polyploïdie, micronuclei, etc.) definiëren in acht worden genomen. Deze test kan worden toegepast voor de waarneming van weefseldifferentiatie / ontwikkeling en vatbaar is voor het gebruik van mutante zebravis en farmacologische middelen. Visualisatie van de manier waarop defecten in mitose leiden tot kanker en ontwikkelingsstoornissen zal sterkverbeteren begrip van de pathogenese van de ziekte.
Introduction
Mitose is een kritische cellulaire proces dat cruciaal is voor groei, differentiatie en regeneratie in een levend organisme. Bij nauwkeurige opstelling en replicatie van DNA in interfase wordt de cel klaargemaakt splitsen. De eerste fase van mitose, profase, geïnitieerd door activering van cycline B / Cdk1. Profase wordt gekenmerkt door condensatie van chromatine materiaal in chromosomen. Kernenvelop doorslag optreedt bij de overgang tussen profase en prometaphase. In prometafase, centrosomes, het kiemvormende centrum voor spindle vorming, beginnen te migreren naar tegengestelde polen terwijl de uitbreiding van microtubuli op zoek kinetochoor gehechtheid. Na bevestiging, conversies tot eind-on attachment microtubuli en trekkrachten oriënteren de chromosomen vormen van een metafaseplaat 1. Als alle chromosomen correct zijn aangesloten, wordt de spil montage checkpoint tevreden, cohesin ringen die de zusterchromatiden samen worden gesplitst, en microtubules in te korten om zus te trekkenchromatiden naar tegengestelde polen tijdens anafase 2,3. De eindfase telofase, omvat verlenging van de cel en hervorming van de kern envelop rond de twee nieuwe kernen. Cytokinese het splitsingsproces door het scheiden van het cytoplasma van de twee nieuwe dochtercellen 4-6 voltooid. Wijziging van de belangrijkste mitotische trajecten (dat wil zeggen, assemblage van de spoel checkpoint, centrosome duplicatie, zuster-cohesie, enz.) Kan leiden tot metafase arrestatie, missegregation van de chromosomen en genomische instabiliteit 7-10. Uiteindelijk defecten in trajecten beheersen van mitose kunnen ontwikkelingsstoornissen en kanker, noodzakelijk visualisatie van mitose en de gebreken in een live, gewerveld dier, meercellig organisme 10-16 veroorzaken.
Zebravis embryo's dienen als een grote modelorganisme voor live-imaging als gevolg van de transparante weefsel, het gemak van micro-injectie, en een snelle ontwikkeling. Met behulp van de zebravis, de algemene doelstelling van dit manuscript is ombeschrijven een werkwijze voor levende 5D (afmetingen X, Y, Z, tijd en golflengte) beeldvorming van mitose 17 (figuur 1C). Het gebruik van mutante zebravis defectief in verschillende mitotische paden tonen de gevolgen van dergelijke defecten. Voor dit protocol, werden Aurora B en Esco2 mutanten gekozen om deze gebreken te illustreren. Aurora B is een kinase die deel uitmaakt van het chromosoom passagier complex (CPC) betrokken bij de vorming en spindel microtubuli bevestiging. Het is ook vereist voor splitsing furrow formatie in cytokinese 18,19. In de zebravis, Aurora B-deficiëntie leidt tot defecten in vore inductie, cytokinese, en chromosoom segregatie 20. Esco2, daarentegen, is een acetyltransferase dat essentieel is voor zuster-cohesie 21,22. Het acetyleert cohesin op de SMC3 gedeelte van de ring dus cohesin stabiliseren om een goede chromosoom segregatie te verzekeren bij de metafase-anafase transitie 23. Verlies van Esco2 in de zebravis leidt tot chromosome missegregation, voortijdige zusterchromatide scheiding, genomische instabiliteit, en p53-afhankelijke en onafhankelijke apoptose 24,25. Door de beschikbaarheid, auroraB hi1045 pt esco2 hi2865 mutante zebravis (hierna aurB m / m pt esco2 m / m, respectievelijk) gebruikt deze techniek 25-27 illustreren.
Koppeling confocale microscopie met TL-gelabelde cel machines heeft de onderzoekers in staat om te visualiseren chromatine en celmembraan dynamiek tijdens de mitose 25,28,29. Fluorescent-gemerkte histonen van oudsher gebruikt om chromatine te visualiseren. Histonen kerneiwitten uit vier paren (H2A, H2B, H3 en H4) die van het nucleosoom structuur die chromosomen 30 samenstelt zijn. Terwijl H2B is misschien wel de meest gebruikte histone voor fluorescerende eiwitten inmuis en celkweek, het gebruik van histon 2A, Familie Z (H2A.F / Z) heeft goed gebleken voor gebruik in de zebravis 31,32. Concanavaline A en caseïne kinase 1-gamma bijvoorbeeld lokaliseren aan het celmembraan en eerder zijn effectief in het visualiseren van de celmembraan in zee-egels en Drosophila 33,34 weergegeven. Andere studies hebben aangetoond dat de CAAX fluorescerend gemerkt eiwit labelt de celmembraan en succesvol in zebravis 31 was. CAAX is een motief dat door post-translationeel modificerende enzymen zoals farnesyltransferases en geranylgeranyltransferases wordt herkend. Wijzigingen van deze enzymen veroorzaken eiwitten membraangebonden lopen, waarbij het labelen van de celmembraan 35.
Door de voorgebruik met zebravis dit protocol kozen H2A.F / Z en CAAX om chromatine en het celmembraan label. Toepassing van deze methode kan de onderzoeker mitose controleren op individueel celniveau individuele chromosoom observerendynamiek, evenals gelijktijdig volgen meerdere celdelingen die invloed weefseldifferentiatie en ontwikkeling. Dit artikel zal zich richten op de beeldvorming van de dynamiek van chromosoom segregatie tijdens de mitose op het individuele celniveau. Binnen dit manuscript wordt de mogelijkheid om meerdere mitotische delingen waarnemen, berekenen divisie tijd, en het ontcijferen van de mitotische fenotypes worden geïllustreerd en besproken. Door deze parameters, fysiologisch relevante gegevens kunnen worden verzameld en toegepast op verscheidene ziektetoestanden die door mitotische afwijkingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gebruik van deze werkwijze kan men kernenvelop afbraak vorming van metafase plaat van microtubule-kinetochore attachments en scheiding van zusterchromatiden afleiden twee nieuwe cellen in vivo en in een tijdsafhankelijke wijze te vormen. Het vermogen om mitose observeren zebravis is voordelig ten opzichte van vaste monsters en celkweek systemen omdat de cellen worden afgebeeld in de natuurlijke fysiologie, het weefsel is transparant waardoor voor fluorescerende eiwitten voor gebruik, ontwikkelen zij relatief sn…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).
Materials
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
Referências
- Musacchio, A., Hardwick, K. G. The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 731-741 (2002).
- Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
- Rieder, C. L., Cole, R. W., Khodjakov, A., Sluder, G. The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores. J Cell Biol. 130 (4), 941-948 (1995).
- Hayles, J., Nurse, P. A review of mitosis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Exp Cell Res. 184 (2), 273-286 (1989).
- Pederson, T. Historical review: an energy reservoir for mitosis, and its productive wake. Trends Biochem Sci. 28 (3), 125-129 (2003).
- Sobel, S. G. Mini review: mitosis and the spindle pole body in Saccharomyces cerevisiae. J Exp Zool. 277 (2), 120-138 (1997).
- Thompson, S. L., Compton, D. A. Chromosome missegregation in human cells arises through specific types of kinetochore-microtubule attachment errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (44), 17974-17978 (2011).
- Duijf, P. H., Benezra, R. The cancer biology of whole-chromosome instability. Oncogene. 32 (40), 4727-4736 (2013).
- Lara-Gonzalez, P., Taylor, S. S. Cohesion fatigue explains why pharmacological inhibition of the APC/C induces a spindle checkpoint-dependent mitotic arrest. PLoS One. 7 (11), 49041 (2012).
- Araujo, A., Baum, B., Bentley, P. The role of chromosome missegregation in cancer development: a theoretical approach using agent-based modelling. PLoS One. 8 (8), 72206 (2013).
- Deardorff, M. A., et al. HDAC8 mutations in Cornelia de Lange syndrome affect the cohesin acetylation cycle. Nature. 489 (7415), 313-317 (2012).
- Chetaille, P., et al. Mutations in SGOL1 cause a novel cohesinopathy affecting heart and gut rhythm. Nat Genet. 46 (11), 1245-1249 (2014).
- Kaiser, F. J., et al. Loss-of-function HDAC8 mutations cause a phenotypic spectrum of Cornelia de Lange syndrome-like features, ocular hypertelorism, large fontanelle and X-linked inheritance. Hum Mol Genet. 23 (11), 2888-2900 (2014).
- Snape, K., et al. Mutations in CEP57 cause mosaic variegated aneuploidy syndrome. Nat Genet. 43 (6), 527-529 (2011).
- Suijkerbuijk, S. J., et al. Molecular causes for BUBR1 dysfunction in the human cancer predisposition syndrome mosaic variegated aneuploidy. Cancer Res. 70 (12), 4891-4900 (2010).
- Vega, H., et al. Roberts syndrome is caused by mutations in ESCO2, a human homolog of yeast ECO1 that is essential for the establishment of sister chromatid cohesion. Nat Genet. 37 (5), 468-470 (2005).
- Andrews, P. D., Harper, I. S., Swedlow, J. R. To 5D and beyond: quantitative fluorescence microscopy in the postgenomic era. Traffic. 3 (1), 29-36 (2002).
- Nigg, E. A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (1), 21-32 (2001).
- Carlton, J. G., Caballe, A., Agromayor, M., Kloc, M., Martin-Serrano, J. ESCRT-III governs the Aurora B-mediated abscission checkpoint through CHMP4C. Science. 336 (6078), 220-225 (2012).
- Yabe, T., et al. The maternal-effect gene cellular island encodes aurora B kinase and is essential for furrow formation in the early zebrafish embryo. PLoS Genet. 5 (6), 1000518 (2009).
- Hou, F., Zou, H. Two human orthologues of Eco1/Ctf7 acetyltransferases are both required for proper sister-chromatid cohesion. Mol Biol Cell. 16 (8), 3908-3918 (2005).
- Ivanov, D., et al. Eco1 is a novel acetyltransferase that can acetylate proteins involved in cohesion. Curr Biol. 12 (4), 323-328 (2002).
- Beckouet, F., et al. An Smc3 acetylation cycle is essential for establishment of sister chromatid cohesion. Mol Cell. 39 (5), 689-699 (2010).
- Monnich, M., Kuriger, Z., Print, C. G., Horsfield, J. A. A zebrafish model of Roberts syndrome reveals that Esco2 depletion interferes with development by disrupting the cell cycle. PLoS One. 6 (5), 20051 (2011).
- Percival, S. M., et al. Variations in dysfunction of sister chromatid cohesion in esco2 mutant zebrafish reflect the phenotypic diversity of Roberts syndrome. Dis Model Mech. 8 (8), 941-955 (2015).
- Amsterdam, A., Hopkins, N. Retroviral-mediated insertional mutagenesis in zebrafish. Methods Cell Biol. 77, 3-20 (2004).
- Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
- Jeon, H. Y., Lee, H. Depletion of Aurora-A in zebrafish causes growth retardation due to mitotic delay and p53-dependent cell death. FEBS J. 280 (6), 1518-1530 (2013).
- Jeong, K., Jeong, J. Y., Lee, H. O., Choi, E., Lee, H. Inhibition of Plk1 induces mitotic infidelity and embryonic growth defects in developing zebrafish embryos. Dev Biol. 345 (1), 34-48 (2010).
- Bonenfant, D., Coulot, M., Towbin, H., Schindler, P., van Oostrum, J. Characterization of histone H2A and H2B variants and their post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 5 (3), 541-552 (2006).
- Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Davidson, G., et al. Casein kinase 1 gamma couples Wnt receptor activation to cytoplasmic signal transduction. Nature. 438 (7069), 867-872 (2005).
- Smith, R. M., et al. Exocytotic insertion of calcium channels constrains compensatory endocytosis to sites of exocytosis. J Cell Biol. 148 (4), 755-767 (2000).
- Reid, T. S., Terry, K. L., Casey, P. J., Beese, L. S. Crystallographic analysis of CaaX prenyltransferases complexed with substrates defines rules of protein substrate selectivity. J Mol Biol. 343 (2), 417-433 (2004).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. J Vis Exp. (101), e52943 (2015).
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J Vis Exp. (46), (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20812-20817 (2009).
- Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation. J Vis Exp. (43), (2010).
- O’Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nat Cell Biol. 16 (5), 386-394 (2014).
- Gorbsky, G. J. Cohesion fatigue. Curr Biol. 23 (22), 986-988 (2013).
- Daum, J. R., et al. Cohesion fatigue induces chromatid separation in cells delayed at metaphase. Curr Biol. 21 (12), 1018-1024 (2011).
- Germann, S. M., et al. TopBP1/Dpb11 binds DNA anaphase bridges to prevent genome instability. J Cell Biol. 204 (1), 45-59 (2014).
- Chan, K. L., North, P. S., Hickson, I. D. BLM is required for faithful chromosome segregation and its localization defines a class of ultrafine anaphase bridges. EMBO J. 26 (14), 3397-3409 (2007).
- Wuhr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W., Mitchison 3rd, ., J, T. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).
- Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. CDK-dependent phosphorylation and nuclear exclusion coordinately control kinetochore assembly state. J Cell Biol. 201 (1), 23-32 (2013).
- Scott, E. S., O’Hare, P. Fate of the inner nuclear membrane protein lamin B receptor and nuclear lamins in herpes simplex virus type 1 infection. J Virol. 75 (18), 8818-8830 (2001).
- Shankaran, S. S., Mackay, D. R., Ullman, K. S. A time-lapse imaging assay to study nuclear envelope breakdown. Methods Mol Biol. 931, 111-122 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9 (12), 114632 (2014).
