직렬 블록 얼​​굴 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 뇌 미토콘드리아 분석

미토콘드리아는 세포의 세포 골격과의 긴밀한 상호 작용, 자신의 모양과 휴대 단서 및 필요에 따라 위치를 변경 동적 소기관이며, 이러한 뉴런 ¹ 칼슘 전류와 같은 셀룰러 이벤트에 대한 응답이다. 다른 세포 소기관이 차례로 자신의 역학과 신진 대사 ^2를 조절 소포체를, 예와 미토콘드리아는 또한 상호 작용합니다. 미토콘드리아 형태, 즉 서로 다른 세포 유형의 이질성을 보여줍니다. 세포 기관의 모양은 시트, 자루 및 타원 ³ 구성된으로 관에 따라 다릅니다. 미토콘드리아 융합과 분열주기 단백질 위치, 크기, 형상 및 미토콘드리아 ^(4)의 분포를 조절할 수 있음을 보여왔다. 또한, 미토콘드리아 형상의 변화는 신경 퇴화, 신경 세포의 가소성, 근육 위축, 칼슘 신호, 반응성 산소 종의 생성뿐만 아니라, 수명 및 세포사 연루 그쪽와 연관된T 세포 특이 미토콘드리아 형태는 정상적인 세포 기능 ^5-11의 유지에 중요하다.

미토콘드리아의 주요한 생체 에너지 함수는 TCA 사이클을 통해 완전한 영양소 파괴 (즉, 글루코스, 지방산 류 또는 아미노산)를 포함하고 OXPHOS ¹² 경로 대사 된 일련의 반응을 실행함으로써, 아데노신 삼인산 (ATP)를 생성한다. 인간의 뇌는 체중의 2 %에 불과하지만 그것이 ~ 그것을 기관 ^(13)을 요구하는 매우 에너지 생산을 전체 에너지의 20 %를 소비 구성한다. 인간의 미토콘드리아 기능 장애는 신경 학적 증상 ^14-17의 큰 숫자에 이르게 것을 따라서 놀라운 일이 아니다. 유전 ~ 1의 유병률과 임상 질환의 이종 집단이다 미토콘드리아 장애 ^17,18에 ATP 생성 오퍼 손상 OXPHOS 성분 돌연변이 : 5000 개인, 및 m의 가장 흔한 원인 중 하나어린이와 성인 etabolic 장애. 미토콘드리아 유래 ATP의 결핍은 뇌, 심장과 골격 근육은 주로 환자 ^14,17,18에 영향을받지 높은 에너지를 요구하는 기관으로 여러 기관의 시스템에 영향을줍니다. 최근 몇 년 동안, 여러 연구는 신경 발달 및 신경 퇴행성 질환 ^15-17,19,20 모두 미토콘드리아의 기능 장애에 대한 증거를 제공했다. 미토콘드리아 필수적인 뇌 발달과 기능에 중요하기 때문에, 모두 건강하고 질병 상태하에 미토콘드리아 뇌 형태, 구조, 크기, 수 및 분포의 변화를 분석 할 수있는 프로토콜을 개발하는 것이 필수적이다. 미토콘드리아-대상으로 녹색 형광 단백질 (GFP)과 마우스 모델은 뇌 ^{(21, 22)에서} 미토콘드리아의 움직임과 현지화를 시각화하기 위해 제작되었습니다. 이것은 미토콘드리아 운동성 일반적인 분포를 조사하기 위해 매우 유용한 도구이지만 포함하여 몇 가지 단점이있다전자 제한된 해상도와 형광 현미경의 감도. 이러한 특성은 어려운 비교적 소형 미토콘드리아를 추적 할 수 있습니다. 마찬가지로, 시리얼 전송 전자 현미경 성공적 시냅스 미토콘드리아 ^23를보기 위해 사용하지만, 이러한 방법은 매우 시간이 걸리고있다. 미토콘드리아 형태들은 연속 분열 및 융합 사이클을 겪는다으로 매우 동적으로 알려져 있고 대부분의 세포에서 미토콘드리아 고도로 연결된 네트워크 ^24-26을 유지한다. 뉴런은 매우 그들이이 신경 돌기를 통해 그들의 방법 (그림 1) 확인으로 분리 할 수있는 다수의 수상 돌기 및 확장 축삭과 세포체에 연결된 망상 네트워크를 형성 미토콘드리아와 세포를 편광된다. 이 크기와 모양이 매우 다양 뇌 미토콘드리아를 만든다. 예를 들어, 일련의 블록 표면을 주사 전자 현미경 법을 사용하여 (SBFSEM) 기술, 우리는 이전에 관찰 extrasynaptic mitochondr의 양 또는 크기의 차이16 개의 ²⁷ 배로 신경 말단에 존재하는 미토콘드리아에 아이오와만큼 할 수있다.

볼륨을 수행하기위한 여러 가지 방법이 있습니다을 Ultramicrotome SEM ⁽³⁰⁾ 수집 시리얼 섹션 TEM ^(29), 자동화 된 테이프를 포함, ²⁸ 분석은, 이온 빔 SEM ^(31), 및 SBFSEM ^(32)을 집중했다. SBFSEM 분석은 뇌의 1mm까지의 영역에서 미토콘드리아는 형태 학적 형태, 크기, 분포 및 세포 소기관의 수 정량에 데이터를 제공하는 해상도를 가지고 있다는 장점을 갖는다. 기술적 동작 이전 EM 경험 부족 많은 생물학 실험실의 능력 내에서 데이터 수집 및 분석, 또한 상기 요구하고있다. 직렬 섹션 같은 이미지를 생성하기위한 상용 장비의 출현은 조직의 3 차원 미세 구조 분석을했다 더 신속하고 반복 가능한 방식 ^(28)의 편견 부피 분석을 허용하는 일상적인 기술, </> SUP. SBFSEM는 우선 신경 회로 ^(34)의 재구성 분석에 중요한 수단으로이 기술을 확립 한 이후 1981 ^33. 여러 연구에서 레이튼 도입 아이디어에 기초하여 2004 년 ³² 신경 생물학의 분야에 기술 하였다. 또한, 많은 작은 규모의 프로젝트를 위해, 그것은 세포 소기관 ^27,35-39를 식별하기 위해 재구성 분석을 제공합니다. 이후, 획득 된 이미지가 저전압 다시 산란 전자로부터 유도되며, 다른 공지 된 중금속 염색 기법을 결합하여 새로운 염색 프로토콜 해상도 ⁴⁰ 높이기 위해 개발되었다.

본 논문에서는 3 차원 전자 현미경 이미징 및 이전에 우리와 다른 사람 ^38,39,41에 의해 사용 된 방법에 따라 뇌 미토콘드리아의 부피 분석을 활용하기위한 프로토콜을 제공합니다. 티슈 후 처리 방법 바와 Deerinck 등에 의해 설명 된 사용40.