Analyse de Brain mitochondries utilisant Serial Bloc-Face microscopie électronique à balayage

Les mitochondries sont des organelles dynamiques qui changent leur forme et leur emplacement en fonction des besoins et des signaux cellulaires, en interaction étroite avec le cytosquelette cellulaire, et en réponse à des événements cellulaires tels que les courants de calcium dans les neurones ^1. Les mitochondries interagissent également avec d' autres organites cellulaires , par exemple réticulum endoplasmique, qui à son tour régule leur dynamique et leur métabolisme ^2. Morphologie mitochondriale montre une hétérogénéité dans différents types de cellules ie. la forme de l'organite varie d' un tube à celui constitué par des feuilles, des sacs et des ovales ^3. Il a été montré que les protéines du cycle de fusion et de fission mitochondriale peuvent réguler l'emplacement, la taille, la forme et la distribution des mitochondries ^4. De plus, les changements dans la forme mitochondriale sont associés à la neurodégénérescence, la plasticité neuronale, une atrophie musculaire, la signalisation du calcium, de l'oxygène production d'espèces réactives ainsi que la durée de vie et la mort cellulaire impliquant thala morphologie des mitochondries des cellules T spécifiques est essentielle pour le maintien de la fonction cellulaire normale ^11/05.

Une fonction majeure bioénergétique des mitochondries est de générer de l' adénosine triphosphate (ATP) en exécutant une série de réactions métaboliques qui impliquent ventilation complète des nutriments (c. -à- glucose, acides gras ou acides aminés) par l' intermédiaire du cycle de TCA et OXPHOS voies ^12. Le cerveau humain ne représente que 2% du poids du corps mais il consomme environ 20% de l' énergie totale produite qui en fait une énergie extrêmement exigeante organe ^13. Il est donc pas surprenant que le dysfonctionnement mitochondrial chez l' homme conduit à un grand nombre de manifestations neurologiques ^14-17. Les mutations génétiques dans les composants OXPHOS qui nuisent conduit ATP génération à des troubles mitochondriaux ^17,18, qui sont un groupe hétérogène de troubles cliniquement avec une prévalence de 1 ~: 5.000 personnes, et l' une des causes les plus communes de mtroubles etabolic chez les enfants et les adultes. Déficit de l' ATP des mitochondries dérivées affecte plusieurs organes et systèmes d'organes exigeants de haute énergie tels que le cerveau, le cœur et les muscles squelettiques étant principalement affectés chez ces patients ^14,17,18. Au cours des dernières années, plusieurs études ont fourni des preuves pour le dysfonctionnement mitochondrial dans les deux troubles neurodéveloppementaux et neurodégénératives ^15-17,19,20. Comme les mitochondries sont essentielles et critiques pour le développement et le fonctionnement du cerveau, il est impératif d'élaborer des protocoles qui peuvent analyser les changements dans le cerveau mitochondrial la morphologie, la structure, la taille, le nombre et la distribution au titre des deux états sains et malades. Des modèles de souris avec mitochondrie ciblée protéine fluorescente verte (GFP) ont été produits pour visualiser les mouvements mitochondriales et la localisation dans le cerveau ^21,22. Bien que ce soit un outil extrêmement utile pour examiner la motilité mitochondrial et la distribution générale, il y a quelques inconvénients qui INCLUDe résolution limitée et la sensibilité de la microscopie par fluorescence. Ces attributs font qu'il est difficile de suivre les relativement petites mitochondries de taille. De même, la microscopie de série électronique à transmission a été utilisé avec succès pour afficher les mitochondries synaptique ^23, mais cette méthode est très coûteuse en temps. Morphologie mitochondriale est connue pour être hautement dynamique car ils sont soumis à des cycles de fission et de fusion en continu, et dans la plupart des cellules mitochondries maintenir un réseau fortement connecté ^24-26. Les neurones sont des cellules fortement avec plusieurs dendrites et des axones étendus et les mitochondries qui forment un réseau réticulaire connecté dans le corps de la cellule polarisée peut avoir à séparer car elles se frayer un chemin à travers ces neurites (figure 1). Cela rend les mitochondries cérébrales extrêmement variées en taille et en forme. Par exemple, en utilisant la microscopie électronique à balayage d'îlot série (SBFSEM) technique, nous l'avons déjà fait remarquer que la différence dans le volume ou la taille de mitochondr extrasynaptiqueia aux mitochondries présentes dans les terminaisons nerveuses peut être jusqu'à seize replient ^27.

Il existe plusieurs approches pour réaliser le volume des analyses ^28, qui comprend de série section TEM ^29, bande automatisé collecte ultramicrotome SEM ^30, faisceaux d' ions focalisés SEM ^31, et SBFSEM ^32. L'analyse de SBFSEM présente des avantages en ce qu 'il a une résolution pour fournir des données quantitatives sur la forme morphologique, la taille, la distribution et le nombre d'organites tels que les mitochondries dans des zones allant jusqu'à 1 mm du cerveau. Le fonctionnement technique est aussi le moins exigeant, avec l'acquisition de données et d'analyse au sein des capacités de nombreux laboratoires biologiques qui manquent d'expérience EM précédente. L'avènement des instruments du commerce pour générer des images de section en forme de série a fait une analyse des tissus microscopie électronique 3D une technique de routine, ce qui permet en outre une analyse volumétrique non biaisé de façon rapide et reproductible ²⁸ </sup>. Le SBFSEM a d' abord été décrite et utilisée dans le domaine de la neurobiologie en 2004 ^32, basé sur une idée introduite par Leighton en 1981 ^33. De nombreuses études depuis ont mis en place cette technique comme un outil majeur dans l' analyse de la reconstruction des circuits neuronaux ^34. En outre, pour de nombreux projets à plus petite échelle, il fournit une analyse de la reconstruction pour identifier les organites cellulaires ^27,35-39. Depuis, les images acquises sont dérivées de basse tension des électrons de rétrodiffusion, de nouveaux protocoles de coloration qui combinent différentes techniques connues de coloration des métaux lourds ont été développés pour augmenter la résolution ^40.

Dans cet article, nous fournissons un protocole pour l' utilisation de la 3D imagerie par microscopie électronique et analyse volumétrique des mitochondries cérébrales basée sur les méthodes qui ont déjà été utilisées par nous et d' autres ^38,39,41. Les méthodes de tissus post-traitement ont été utilisées comme décrit précédemment par Deerinck et al40.