Analyse van de Brain Mitochondriën gebruik van Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Mitochondriën zijn dynamische organellen die hun vorm en locatie afhankelijk van de cellulaire signalen en verandert zal in nauwe interactie met mobiele cytoskelet en als reactie op cellulaire gebeurtenissen zoals calcium stromen in neuronen ^1. Mitochondriën ook een wisselwerking met andere cellulaire organellen, bijv endoplasmatisch reticulum, waardoor reguleert de dynamiek en metabolisme ^2. Mitochondriale morfologie toont heterogeniteit in verschillende celtypen dwz. de vorm van het organel verschilt van die buisvormige bestaande uit platen, zakken en ovalen ^3. Het is aangetoond dat mitochondriale fusie en splijtstofcyclus eiwitten de locatie, afmeting, vorm en verdeling van mitochondria ⁴ kan reguleren. Bovendien, veranderingen in mitochondriale vorm geassocieerd met neurodegeneratie, neuronale plasticiteit, spieratrofie, calcium signaaloverdracht, reactieve zuurstofspecies generatie en levensduur en celdood impliceert that celspecifieke mitochondriale morfologie essentieel is voor de handhaving van normale cellulaire functie ^5-11.

Een belangrijke bio-energetische functie van de mitochondriën is om adenosine trifosfaat (ATP) te genereren door het uitvoeren van een reeks van metabole reacties die volledige afbraak van voedingsstoffen (ie glucose, vetzuren en aminozuren) via de TCA cyclus te betrekken en OXPHOS trajecten ^12. Het menselijk brein vormt slechts 2% van het lichaamsgewicht maar het verbruikt ~ 20% van de totale energie geproduceerd, waardoor het een zeer energie veeleisende orgaan ^13. Het is dan ook niet verwonderlijk dat mitochondriale dysfunctie bij de mens leidt tot een groot aantal neurologische verschijnselen ^14-17. Genetische mutaties in OXPHOS componenten die ATP productie leidt afbreuk mitochondriale aandoeningen ^17,18, die klinisch heterogene groep van aandoeningen met een prevalentie van ~ 1: 5000 individuen, en een van de meest voorkomende oorzaak van metabolic stoornissen bij kinderen en volwassenen. Deficit van mitochondriën afkomstig ATP invloed op meerdere orgaansystemen met een hoge energie-eisen organen, zoals de hersenen, het hart en de skeletspieren wordt voornamelijk beïnvloed bij deze patiënten ^14,17,18. In de afgelopen jaren hebben meerdere studies bewijs geleverd voor mitochondriële disfunctie bij zowel neurologische en neurodegeneratieve aandoeningen ^15-17,19,20. Aangezien mitochondria essentieel en kritisch voor ontwikkeling van de hersenen en de functie, is het noodzakelijk om protocollen die veranderingen in de hersenen mitochondriale morfologie, structuur, grootte, aantal en distributie onder zowel gezonde als zieke toestanden kunnen analyseren ontwikkelen. Muismodellen mitochondriën gerichte groen fluorescerend eiwit (GFP) werden geproduceerd om mitochondriale mutaties en lokalisatie visualiseren in de hersenen ^21,22. Hoewel dit een zeer nuttig hulpmiddel mitochondriale motiliteit algemene verspreiding te onderzoeken, zijn er een aantal nadelen die include beperkte resolutie en gevoeligheid van fluorescentie microscopie. Deze kenmerken maken het moeilijk om de relatief kleine formaat mitochondria volgen. Evenzo seriële transmissie elektronenmicroscopie is met succes gebruikt om synaptische mitochondriën ²³ bekijken, maar deze methode is zeer tijdrovend. Mitochondriale morfologie bekend is zeer dynamisch te zijn als ze worden voortdurend kernsplijting en kernfusie cycli, en in de meeste cellen mitochondria onderhouden van een sterk verbonden netwerk ^24-26. Neuronen zijn sterk gepolariseerde cellen met meerdere dendrieten en axonen verlengd, en dat mitochondria een aangesloten netvormige netwerk in het cellichaam vormen kan hebben om te scheiden als zij hun weg door deze neurieten (figuur 1). Hierdoor hersenen mitochondriën zeer gevarieerd in grootte en vorm. Bijvoorbeeld met gebruikmaking serieblok-face scanning elektronenmicroscopie (SBFSEM) techniek we eerder waargenomen dat het verschil in de hoeveelheid of de grootte van extrasynaptic mitochondria aan mitochondria in de zenuwuiteinden kan zo veel als zestien vouwen ^27.

Er zijn verschillende manieren voor het uitvoeren van analyses volume ^28, welke seriële sectie TEM ^29, geautomatiseerde tape verzamelen ultramicrotoom SEM ³⁰ omvat, gefocusseerde ionenbundel SEM ³¹ en SBFSEM ^32. De SBFSEM analyse heeft voordelen doordat zij de resolutie kwantitatieve gegevens over de morfologische vorm, grootte, verdeling en het aantal van organellen zoals mitochondriën, deze gebieden tot 1 mm van de hersenen. De technische werking is ook de minst veeleisende, met data-acquisitie en analyse binnen de mogelijkheden van vele biologische laboratoria die eerdere EM ervaring missen. De komst van commerciële instrumenten voor het genereren seriële sectie-achtige beelden heeft 3D ultrastructurele analyse van weefsels die routinematig techniek, die een onbevooroordeelde volumetrische analyse op een snelle en reproduceerbare wijze ²⁸ verder toelaat </sup>. De SBFSEM werd eerst beschreven en gebruikt in het gebied van neurobiologie in 2004 ^32, gebaseerd op een idee van Leighton geïntroduceerd in 1981 ^33. Meerdere studies sindsdien deze techniek als een belangrijk instrument voor reconstructie analyse van neuronale circuits ³⁴ zijn opgesteld. Bovendien vele kleinere projecten, biedt reconstructie analyse celorganellen ^27,35-39 identificeren. Daar worden de verkregen beelden afkomstig zijn van lage spanning terug scatter elektronen, nieuwe kleuringsprotocollen waarin verschillende bekende heavy metal-kleuring technieken te combineren werden ontwikkeld om de resolutie van ⁴⁰ te verhogen.

In dit artikel geven we een protocol voor het gebruik van 3D-elektronenmicroscopie beeldvorming en volumetrische analyse van de hersenen mitochondriën gebaseerd op methoden die eerder zijn gebruikt door ons en anderen ^38,39,41. Het weefsel nabewerking methoden waren zoals eerder beschreven door Deerinck c.s.40.