Aanbrengen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) naar Effector Translocatie Efficiency Onderzoek door<em> Coxiella burnetii</em> Tijdens siRNA Silencing

Coxiella burnetii is een unieke intracellulaire ziekteverwekker die de zoönotische menselijke besmetting Q-koorts veroorzaakt. Deze ziekte wordt geassocieerd met een breed spectrum van klinische presentaties uitstrekt van asymptomatische seroconversie tot levensbedreigende chronische infectie die vaak manifesteert als endocarditis jaar na blootstelling ^1. Menselijke besmetting ontstaat voornamelijk door inhalatie van gecontamineerde aërosolen met herkauwers grote reservoir van infectie, in het bijzonder melkkoeien, schapen en geiten. Hoewel Coxiella-infectie bij deze dieren is meestal subklinische, kan de infectie leiden tot abortus en de aanzienlijke bacteriële belasting in het geboorteproces vloeistof en placenta kan de lokale omgeving ¹ besmetten. Een voorbeeld van de enorme last dergelijke vervuiling kan hebben op zowel de volksgezondheid en de landbouwindustrie onlangs waargenomen in de Q-koorts die zich in Nederland ^2. Tussen 2007 en2010, meer dan 4.000 menselijke gevallen van Q-koorts werden gediagnosticeerd en deze uitbraak was gekoppeld aan significante besmetting van geitenhouderijen ^3. Bovendien, Coxiella een potentieel biologisch wapen, zoals geclassificeerd door de Amerikaanse Centers for Disease Control and Prevention, vanwege de milieustabiliteit van de bacteriën en lage infectieuze dosis nodig ernstige morbiditeit en mortaliteit ⁴ veroorzaken.

Coxiella bestaat in twee fasen: Fase I organismen, geïsoleerd uit natuurlijke bronnen, zijn zeer virulent en Fase II organismen sterk verzwakt in vivo. Bijvoorbeeld, na een aantal overzettingen in vitro van Coxiella burnetii Nine Mile organismen Fase I, Fase II bacteriën werden geleverd dat een onomkeerbare chromosomale deletie bevatten waardoor afgeknotte lipopolysaccharide (LPS) ^5. Deze stam C. burnetii NMII, fenotypisch vergelijkbaar met Fase I in weefselkweek modellen en zorgt voor een veiligere modusl voor onderzoekers om Coxiella pathogenese in laboratoria ⁵ bestuderen. De laatste jaren hebben verscheidene doorbraken snel gevorderd het gebied van Coxiella genetica. Het meest opvallend is de ontwikkeling van axenische media (aangezuurd citraat cysteine ​​midden – ACCM-2) heeft het celvrije groei van Coxiella toegestaan ​​in zowel vloeibare en vaste media ^6,7. Dit resulteerde in de directe verbetering van genetische hulpmiddelen beschikbaar voor Coxiella waaronder een induceerbare genexpressie systeem, shuttle vectoren en willekeurig transposon systemen ^8-11. Meest recent, twee methoden voor doelgerichte geninactivatie zijn ook ontwikkeld, die de weg vrijmaakt voor de behandeling van specifieke virulentie-gen kandidaten ^12.

Na internalisatie door alveolaire macrofagen, Coxiella gerepliceerd naar grote aantallen binnen een membraangebonden compartiment aangeduid als de Coxiella- met vacuole (CCV). Het CCV vereist gastheer endocytische mensenhandel thruwe vroege en late endosomen, totdat het rijpt in een lysosoom afgeleide organel ^13. Gedurende dit proces, verkrijgt het CCV gastheer factoren die ofwel verschijnen tijdelijk of verbonden blijven met de vacuole, waaronder, maar niet beperkt tot, Rab5, Rab7, CD63 en ^LAMP-13-15 januari. Replicatie van Coxiella binnen gastheercellen is volledig afhankelijk van een volledig functionele Dot / Icm Type IVB Afscheiding System (T4SS) ^8,16,17. Dit afscheidingssysteem is een multi-eiwitstructuur ancestrally betrekking conjugatie systemen en omvat zowel bacteriële als vacuolaire membranen bacteriële eiwitten leveren, genaamd effectoren, in de gastheercel cytoplasma ^18. De Coxiella T4SS functioneel vergelijkbaar met de goed gekarakteriseerde Type IVB Dot / Icm afscheidingssysteem van Legionella pneumophila ^19,20. Interessant is dat activering van de T4SS en daaropvolgende translocatie effector pas optreedt Coxiella de zure lysosoom afgeleide bereiktorganel, ongeveer 8 uur na infectie ^17,21. Tot op heden hebben meer dan 130 Dot / Icm effectoren geïdentificeerd ^9,17,22-24. Veel van deze effectoren waarschijnlijk een belangrijke rol spelen tijdens de replicatie van Coxiella binnen gastheercellen; Echter, slechts een paar effectoren zijn functioneel gekarakteriseerd ^25-29.

In dit onderzoek gebruiken we een fluorescentie gebaseerde translocatie assay die is gebaseerd op splitsing van de CCF2-AM FRET substraat (hierna het BLAM substraat) via β-lactamase activiteit in de gastheercel cytoplasma (Figuur 1). Het gen van belang wordt gefuseerd aan TEM-1 β-lactamase (BLAM) op een reporterplasmide die constitutieve expressie verschaft. De BLAM substraat bestaat uit twee fluoroforen (coumarine en fluoresceïne), die een FRET-paar vormen. Excitatie van de cumarine in FRET resultaten van het fluoresceïne en groene fluorescentie-emissie in afwezigheid van effector translokatie; Indien de BlaM-effector-eiwit translocatie in de gastheer cytoplasma, de resulterende β-lactamase activiteit splitst de β-lactam ring van het BLAM substraat, het scheiden van het FRET paar producerende blauwe fluorescentie-emissie na excitatie. Deze translocatie assay is bewezen als een benadering van effector eiwitten te identificeren van een reeks verschillende intracellulaire en extracellulaire bacteriën, waaronder C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropathogene E. coli, Salmonella pt Brucella ^17,30-35.

Om de rol van specifieke host factoren op Coxiella effector translocatie bepalen we gebruik van een bekende methode voor het gene silencing bekend als RNA-interferentie, in het bijzonder kleine interfererende RNA (siRNA). Oorspronkelijk geïdentificeerd in Caenorhabditis elegans, RNA-interferentie is een geconserveerd endogeen cellulair proces dat wordt gebruikt voor het aangeboren defense tegen virussen en genregulatie ^36,37. Na binding van sequentie-specifieke siRNA, afbraak van mRNA vindt plaats via RISC (RNA-geïnduceerd silencing complex) waardoor specifiek gen silencing of ³⁸ knockdown. In deze studie werd gebruikt siRNA targeten twee gastheereiwitten, Rab5A en Rab7A, die belangrijke regulatoren van de endocytische route zijn. De impact van zwijgen Rab5A en Rab7A op effector translocatie werd vastgesteld met behulp van C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 werd geselecteerd als zij eerder werd aangetoond dat getransloceerd door de Dot / Icm secretie systeem van Coxiella ^17.

Gebruik makend van beide siRNA gene silencing en de fluorescencebased translocatie test hier beschreven, beginnen we een rol voor host factoren te vestigen in de translocatie van effector eiwitten door Coxiella. Deze benadering kan worden toegepast op een breed scala aan zowel intracellulaire als extracellulaire bacteriën die vergelijkbaar secretio bezittenn systemen verantwoordelijk voor de translocatie van effector eiwitten.